法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2023-02-03
公开
发明专利申请公布
技术领域
本发明属于蛋白质组学分析技术领域,涉及蛋白质组相对定量的方法,具体涉及一种基于质量亏损的多标羰基活化标签(mdCAT)用于数据非依赖性采集蛋白质组质谱定量新方法,本发明方法利用赖氨酸同位素合成的八种质量亏损标签并非依赖性数据采集质谱定量蛋白质组。本发明方法能够使质谱非依赖性数据采集提升至八个通道,并且可应用于血清等临床样本。
背景技术
据研究报道,蛋白质组学的关注焦点和研究趋势已经逐渐从定性分析转向定量分析。定量蛋白质组学是对细胞、组织乃至完整生物体的蛋白质表达进行定量分析,对生物过程机理的探索和临床诊断标志物的发现与验证具有重要意义。现有技术中的定量蛋白质组的质谱主要技术手段有基于数据依赖性采集(DDA)的鸟枪法和针对专一性肽段进行选择反应监测(SRM)。然而,DDA二级采集取决于一级扫描结果,易造成低丰度肽段的丢失,具有一定的随机性,扫描点数也不均匀;而SRM等目标采集方法不能采集非目标肽段,而且分析通量有限。近年来发展的数据非依赖性采集(DIA)结合了DDA与SRM的特点,将整个扫描范围分为若干窗口,每个窗口依次选择、碎裂,采集窗口内所有母离子的全部子离子信息。常见的通过一级母离子提取峰面积实现定量的具有标记通量低、动态范围差、灵敏度不高等不足;而以iTRAQ和TMT为代表的同重同位素标记技术面临大量共洗脱肽段使报告例子重叠造成实际定量比例不能准确反映真实结果。因此,本申请的发明人拟提供新的蛋白质组相对定量的方法,本发明利用赖氨酸同位素合成了八个通道的质量亏损的赖氨酸同位素八通道标签,通过活化该标签的羧基将其标记在肽段N-端以及赖氨酸侧链氨基上,能够同时实现高通量与非依赖性数据采集的蛋白质组定量。
发明内容
本发明的目的在于克服现有定量技术存在的不足,提供一种可实现高通量并非依赖性数据采集的蛋白质组相对定量新方法,尤其涉及一种基于质量亏损的八标标签并非依赖性数据采集定量蛋白质组的方法,本发明中合成八标质量亏损的同位素标签并利用其活波羧基使其标记在肽段N-端及赖氨酸侧链氨基上,在质谱非依赖性数据采集模式下实现高通量样本相对定量的方法。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:
1.二甲基化Nε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸,合成两种N,N-二甲基化赖氨酸同位素;
2.乙酰化L-赖氨酸-二盐酸盐,合成四种Nα,Nε-二乙酰化赖氨酸;
3.脱水缩合反应N,N-二甲基化赖氨酸与Nα,Nε-二乙酰化赖氨酸,合成并纯化质量亏损标签mdCATs(N2-(N2,N6-二乙酰赖氨酰)-N6,N6-二甲基化赖氨酸);
4.以单一肽段为标准样品,考察mdCATs的标记效率;
5.以大肠杆菌(E.coli)为标准样品,测试mdCATs并非依赖性数据采集定量方法在复杂样品中的可行性;
6.以临床血清为实际样,测试mdCATs标记肽段用于实际样品蛋白质组相对定量的可行性。
更具体的,
本发明提供的一种基于质量亏损的多标羰基活化标签(mdCAT)用于数据非依赖性采集蛋白质组质谱定量方法,该方法中基于质量亏损的八标标签并非依赖性数据采集定量蛋白质组,其中利用准等重赖氨酸试剂对蛋白质酶解肽段进行标记,实现数据非依赖性采集模式下高通量、高准确性、高重复性的蛋白质组定量分析,其包括步骤:
1)对赖氨酸进行乙酰化并纯化;
2)对赖氨酸进行二甲基化并纯化;
3)对乙酰化赖氨酸与二甲基化赖氨酸进行脱水缩合并纯化产物,合成mdCAT标签;
4)对蛋白质酶解肽段进行mdCAT标记,并利用超高分辨质谱进行分析,随后借助skyline开源软件,对蛋白质丰度进行定量分析。
成N-三本发明中,所述的赖氨酸乙酰化反应,是乙酸酐在0℃下使L-赖氨酸-2HCl的羧基乙酰化,反应需加入吡啶,反应时间是20小时,乙酰化赖氨酸利用ACN(10mL,3次)洗涤纯化。
本发明中,所述的赖氨酸二甲基化反应,是Boc-赖氨酸-OH与氰基硼氢化钠,甲醛的还原胺化反应,反应温度是37℃,反应时间是2小时,通过硅胶快速色谱柱(MeOH/H
本发明中,所述的mdCAT标签合成反应,是DMTMM先活化乙酰化赖氨酸形嗪基四氟硼酸铵,反应温度是0℃,反应时间是2h,再加入N,N-二甲基赖氨酸,乙酰化赖氨酸与二甲基化赖氨酸摩尔比是1:1.2,反应温度是室温,反应时间是8h,样品通过HPLC-C18柱纯化,得到高纯度的质量亏损mdCATs标签。
本发明中,所述的mdCAT标记蛋白质酶解肽段反应,是利用DMTMM与NMM将mdCATs活化,反应体系是20μL DMF,反应温度是0℃,反应时间是2小时,形成原位四氟硼酸N-三叠氮基铵盐,加入1μg蛋白质酶解肽段,肽段与mdCAT质量比为1:24,反应温度是37℃,反应时间是4h,标记mdCAT的肽段进行C18除盐。
本发明方法能实现数据非依赖性采集模式下高通量、高准确性、高重复性的蛋白质组定量分析,其准确性和重复性好,线性范围较宽,可用于肝癌血清蛋白组定量相对与正常人血清蛋白表达水平的差异分析,可定量到24个差异表达蛋白,其中2个蛋白为FDA批准的标志物。
本发明的优点有;
1.由商品化的赖氨酸同位素合成的质量亏损标签mdCATs,与传统的同位素标记试剂(例如iTRAQ,TMT)相比价格低廉,可以推广使用。
2.合成的质量亏损标签mdCATs与肽段N-端脱水缩合反应,衍生效率高(接近100%)。
3.质量亏损标签mdCATs可以简化一级谱图,实现质谱非依赖性数据采集方法的八标标记定量。
4.细胞样本与非细胞样本(如血清、血浆、脑脊液等临床样本)均可被质量亏损标签mdCATs标记,在非依赖性数据采集模式下实现重复性好、准确性高、线性范围宽的特点。
5.与现有技术的只能利用赖氨酸-C酶解后的y离子定量的方法相比,本发明方法所用的标签mdCATs能够兼容胰蛋白酶酶解,y离子与b离子都能够提供定量信息。
附图说明
图1本发明方法的流程示意图。
图2(a)合成的八种质量亏损标签mdCATs(N2-(N2,N6-二乙酰赖氨酰)-N6,N6-二甲基化赖氨酸)所需的反应试剂列表;(b)合成mdCATs标签所涉及的化学反应式。
图3纯化得到质量亏损标签mdCATs(N2-(N2,N6-二乙酰赖氨酰)-N6,N6-二甲基化赖氨酸)的质谱图。
图4(a)衍生前的标准肽段MALDI质谱图,(b)质量亏损标签mdCATs标记标准肽段的MALDI质谱图。(a)和(b)是在MALDI的反射正离子模式下获得的。
图5(a)8标mdCATs标记的E.coli样本等质量比混合相对定量方法重复性与准确性图,(b)8标mdCATs标记的E.coli样本系列质量比混合相对定量方法的线性图。
图6八标mdCATs标记的血清样本图。
具体实施方式
实施例1质量亏损标签mdCATs的合成与纯化
将Boc-赖氨酸-OH(246.3mg,1mmol)和氰基硼氢化钠(NaCNBD
Nα,Nε-二乙酰基赖氨酸由L-赖氨酸-2HCl(L-赖氨酸-2HCl
mdCATs的合成是在0℃,2h用适当的DMTMM(328.1mg,1mmol,溶于6.6mL DMF溶液)和NMM(328.1μL)活化Nα,Nε-二乙酰基赖氨酸(239.1mg,1mmol)以形成N-三嗪基四氟硼酸铵,再加入N,N-二甲基赖氨酸(217.3mg,1.2mmol),室温反应8h。冻干后样品通过HPLC-C18柱纯化,得到质量亏损mdCATs,为透明固体。
上述反应中涉及的试剂组合详如图2(a)所示,合成步骤如图2(b)所示;纯化后ESI直喷检测结果如图3所示。
实施例2质量亏损标签mdCATs反应衍生效率的考察
向反应容器中,将24μg mdCATs和6.6μg DMTMM溶解在20μL DMF中,并加入1μLNMM。混合后在0℃下反应2小时,形成原位四氟硼酸N-三叠氮基铵盐,加入1μg标准肽段ESTLHLVLR,在37℃下反应4h后冻干除盐。
反应前后分别进行MALDI质谱检测分析,反应前的标准肽段结果如图3(a)所示;衍生mdCATs标签后的肽段结果如图3(b)所示,未衍生的肽段基本看不到,反应效率接近100%。
实施例3考察mdCATs并数据非依赖性采集质谱相对定量方法准确性及线性
按照实施例2的方法分别对等质量比的mdCATs标记E.coli肽段混合后进行LC-MS/MS质谱分析,结果如图5(a)所示。所得到的结果分别是1.11,1.00,0.98,0.92;该实验重复三次标准差分别为0.31,0.24,0.30,0.35。将不同摩尔比(1:2:6:8:10:16:20:25)mdCATs标记的E.coli酶解肽段混合,进行LC-MS/MS质谱分析。将实验得到的强度比对理论比作图,得到图5(b),可以看出该方法在较大线性范围能够重复、准确定量。
实施例4 mdCATs标记肽段并非依赖性数据采集质谱相对定量方法在临床样品中的应用
各取10μL(600μg)9例正常人血清与12例肝癌血清样本,向每个样品中加入500μL50mM碳酸氢铵溶液混匀,再中加入二硫苏糖醇(DTT),使终浓度为10mM,置于37℃振荡反应1小时后再向溶液中加入碘乙酰胺(IAA),使其终浓度为30mM,室温、避光条件下反应30分钟,实现巯基的还原烷基化。随后向样品中加入胰蛋白酶,37℃孵育16小时后用C18富集除盐,肽段用500μL 50%乙腈(乙腈/水:v/v 5:5)与500μL 80%乙腈(乙腈/水:v/v 8:2)洗脱,之后冻干。之后按照实例1对正常人的血清肽段进行mdCATs衍生,衍生后等质量比混合在一起,C18除盐富集后进行LC-MS/MS质谱分析。本发明中利用质量亏损标签mdCATs并非依赖性数据采集质谱相对定量蛋白组的方法,成功的对比分析了肝癌病人血清中蛋白相对正常人血清蛋白表达水平的差异,共鉴定到24个差异表达蛋白,其中2个是FDA批准的标志物。
机译: 基于质量缺陷的多重二甲基嘧啶丁鸟氨酸(DIPYRO)标签用于高通量定量蛋白质组学和肽组学
机译: 基于质量缺陷的多重二甲基嘧啶丁鸟氨酸(DIPYRO)标签用于高通量定量蛋白质组学和肽组学
机译: 基于质量缺陷的多重二甲基嘧啶基鸟氨酸(DiPyrO)标签用于高通量定量蛋白质组学和肽组学