重组人粒细胞集落刺激因子的高压定点聚乙二醇修饰方法

摘要

本发明提供重组人粒细胞集落刺激因子的高压定点聚乙二醇修饰方法，通过对rhG‑CSF和马来酰亚胺聚乙二醇修饰试剂的混合溶液在0.1‑600MPa压力下反应6‑24h；对修饰后的产物进行分离纯化并进行结构和活性验证。本发明方法能提高rhG‑CSF修饰反应效率，使用mPEG‑40kDa‑MAL和mPEG‑20kDa‑MAL定点修饰rhG‑CSF时分别能够提升蛋白单修饰率达到32％和45％，而常压下几乎不发生修饰反应，还能够减弱常规修饰反应参数的影响，提升生产效率，降低生产成本，适用于大规模工业生产。

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的高压定点聚乙二醇修饰方法。

背景技术

粒细胞集落刺激因子(Granulocyte Colony Stimulating Factor，G-CSF)主要是由巨噬细胞、内皮细胞及成纤维母细胞产生的一种造血因子，于1980s年代初被发现，随后科研人员将人粒细胞集落刺激因子进行重组表达，成功制备出rhG-CSF。1991年美国FDA批准通过了Amgen公司重组粒细胞集落刺激因子Neupogen的申请，随后正式投放市场并获得了良好的销售成绩。重组人粒细胞集落刺激因子可以用于治疗各种原因引起的粒细胞减少症，临床上主要用于预防和治疗肿瘤放疗或化疗后引起的白细胞减少症、治疗伴随发热的中性粒细胞减少症、治疗骨髓造血机能障碍和骨髓增生异常综合征、预防白细胞减少可能潜在的感染并发症、使感染引起的中性粒细胞减少的恢复加快以及用于外周干细胞动员、AIDS的辅助治疗和肝、肾移植后中性粒细胞的恢复等。但是通过重组原核表达得到的rhG-CSF因为缺少翻译后修饰过程，存在半衰期短、免疫原性强等问题，是临床病人药物治疗的一大难题。

蛋白药物的聚乙二醇修饰已被证明具有改善药物稳定性、提高药物溶解性、降低药物免疫原性、提高抗酶解能力以及有效延长药物半衰期等特点。至今已有数十种聚乙二醇修饰药物通过FDA批准上市或处于不同临床研究阶段，并且都具有优异的临床医疗效果，同时也表现出良好的业绩(Turecek et al.,2016)。进一步通过蛋白定点修饰技术则可以解决聚乙二醇修饰过程中存在的修饰产物不均一，修饰样品活性降低以及修饰效率低等问题，其中使用马来酰亚胺修饰试剂与蛋白游离巯基进行定点修饰反应具有特异性高和反应活性强的特点(Boutureira and Bernardes,2015；Jevsevar et al.,2010)。rhG-CSF分子中有五个Cys残基，Cys36-Cys42和Cys64-Cys74形成了两对二硫键，其作用在于维系分子的高级结构并保持其生物学活性，Cys17则以游离巯基的形式存在。研究人员发现使用马来酰亚胺修饰试剂与rhG-CSF游离巯基进行定点修饰反应时存在修饰效率低的问题。这是因为通常情况下，在蛋白折叠过程中，表面的游离半胱氨酸残基倾向于被包埋在疏水区域中，从而防止形成蛋白链间二硫键错配聚集体(Pfister and Morbidelli,2014)。而蛋白表面形成的疏水区域会阻止亲水性物质如PEG等的进入。在这种情况下，PEG修饰试剂很难与巯基接触并反应，因此修饰反应效率较低。

在定点修饰反应过程中，PEG修饰试剂与蛋白修饰位点之间的空间可及性影响整个修饰反应过程。PEG分子量大小以及被修饰基团的位置对修饰反应速率以及修饰率有显著影响，这是由于空间位阻的存在影响了整个修饰反应效率(Pfister et al.,2015；Pasutand Veronese,2012)。因此提升蛋白被修饰位点的暴露程度从而提升整个修饰反应效率成为一种解决办法。通过使用可逆变性的修饰策略对rhG-CSF蛋白进行巯基定点修饰能够提升rhG-CSF的修饰率，但是在修饰蛋白样品中发现大量聚集体，修饰成本较高(Veronese etal.,2007)。这是因为rhG-CSF自身具有较强的疏水性，变性情况下rhG-CSF蛋白的疏水基团完全暴露，相互之间聚集产生沉淀(Roessl et al.,2012；Monahan et al.,1995)。

因此，在本领域中，需要寻找一种高效便捷并且相对较低成本的rhG-CSF定点马来酰亚胺聚乙二醇的修饰方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的高压定点聚乙二醇修饰方法。是一种基于高压条件的重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)定点聚乙二醇修饰方法。

本发明提供的一种重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的高压定点聚乙二醇修饰方法，通过以下步骤实现：

(1)对rhG-CSF和马来酰亚胺聚乙二醇修饰试剂的混合溶液在压力下进行反应；

(2)对步骤(1)处理后的产物进行分离纯化并进行结构和活性验证。

优选地，步骤(1)所述rhG-CSF和马来酰亚胺聚乙二醇修饰试剂的混合溶液在压力下进行反应，具体包括以下步骤：

a、将所述rhG-CSF和马来酰亚胺聚乙二醇修饰试剂按照一定的修饰摩尔比加入至缓冲溶液混合；

b、将所述rhG-CSF和马来酰亚胺聚乙二醇修饰试剂混合溶液在压力下反应并计算修饰率。

优选地，步骤a所述马来酰亚胺聚乙二醇修饰试剂的分子量为5kDa-40kDa，例如5kDa、10kDa、20kDa、30kDa和40kDa。

优选地，步骤a所述rhG-CSF与马来酰亚胺聚乙二醇修饰试剂的摩尔比为1:1-1:10(蛋白：PEG)，例如1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10，优选为1:2。

优选地，步骤a所述rhG-CSF与马来酰亚胺聚乙二醇修饰试剂的混合溶液是rhG-CSF与马来酰亚胺聚乙二醇修饰试剂加入至缓冲溶液中得到的溶液。

优选地，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液(PB)或Tris-HCl缓冲溶液。

优选地，所述缓冲溶液为pH值6.5-8.0的缓冲溶液。

优选地，所述缓冲溶液为pH 6.5的20mM磷酸盐缓冲液、pH 7.0的20mM磷酸盐缓冲液、pH 7.5的20mM磷酸盐缓冲液、pH 7.5的20mM Tris-HCl缓冲溶液或pH 8.0的20mM Tris-HCl缓冲溶液中的任意一种，优选为pH 7.5的20mM磷酸盐缓冲液。在Tris-HCl缓冲液中蛋白单修饰率较低，修饰产物中都存在大量聚集体。在磷酸盐缓冲溶液中的蛋白修饰产物中聚集体的比例明显减少，而且修饰产物单体比例高。pH 7.5的缓冲溶液中蛋白修饰率则明显高于pH 7.0缓冲溶液条件。

优选地，步骤b所述高压修饰反应采用将所述rhG-CSF和马来酰亚胺聚乙二醇修饰试剂混合溶液直接通过高压处理。

优选地，将所述rhG-CSF和马来酰亚胺聚乙二醇修饰试剂混匀后在0.1-600MPa压力下作用6-24h。

本发明中高压修饰反应的压力还可以选自0.1MPa、10MPa、50MPa、100MPa、150MPa、200MPa、250MPa、300MPa、350MPa、400MPa、450MPa、500MPa、550MPa或600MPa，优选为200MPa。压力低于100MPa不会对rhG-CSF结构产生影响，无法使被修饰巯基基团暴露，但是若压力过大(高于300MPa)则可能造成rhG-CSF结构完全被破坏，蛋白发生变性，无法继续参与修饰反应。

本发明中高压修饰反应的时间还可以选自6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h或24h，优选为16h。

高压处理时间过短，低于6h的情况下修饰比例低，此后随着时间的增加，修饰率逐渐增加并趋于稳定，当处理时间高于16h基本可以认为修饰率不会再继续增加，所以无需进一步提升作用时间。优选地，所述高压处理为在200MPa压力下作用16h。

优选地，步骤b所述计算反应产物的修饰率，首先要将修饰反应进行终止。

优选地，所述终止条件为将高压处理产物溶液体系置换为酸性缓冲溶液，包括pH3.5醋酸钠缓冲溶液、pH 4.5醋酸钠缓冲溶液、pH 5.5醋酸钠缓冲溶液和pH 6.0磷酸盐缓冲溶液。通过调节pH值至酸性可以降低rhG-CSF游离巯基与马来酰亚胺聚乙二醇修饰试剂的反应活性，达到终止修饰反应的目的，防止过度修饰。过低的pH值会导致蛋白变性，过高的pH值则不能终止反应，出现多修饰产物，优选为pH 4.5醋酸钠缓冲溶液。

在本发明中，对rhG-CSF蛋白与马来酰亚胺聚乙二醇修饰试剂反应后的修饰率进行计算分析采用Agilent 1100高效液相系统，色谱分析柱为Vydac C4(4.6×250mm,Grace)柱，流动相A为含有0.1％ TFA的超纯水，流动相B为含有0.1％ TFA的乙腈，流速0.5mL/min，上样50μL，检测波长为280nm。首先在20min从20％B增加洗脱梯度至53％B。接下去在25min内提升洗脱梯度到68％B，接着在5min内增加洗脱梯度到100％B。单修饰率按照如下方程计算：

本发明中，常压下rhG-CSF几乎不与修饰试剂反应，而高压下mPEG-MAL能够与rhG-CSF蛋白中游离巯基发生偶联反应并且基本没有聚集体产生，修饰效率远高于常压结果，高压条件下使用mPEG-40kDa-MAL修饰rhG-CSF蛋白单修饰率达到32％，使用mPEG-20kDa-MAL时的单修饰率则达到45％。

优选地，步骤(2)所述对高压处理后的产物进行分离纯化方法包括SP FF阳离子交换和Superdex 200凝胶过滤层析。

优选地，所述SP FF阳离子交换层析方法包括将高压修饰获得的样品稀释5倍后上样，上样结束后先用5％洗脱缓冲液淋洗，然后用100％洗脱缓冲液直接洗脱2-3柱体积。

优选地，所述SP FF阳离子交换层析方法用到的平衡缓冲溶液为20mM NaAc-HAc，pH 5.2，所述洗脱缓冲液为20mM NaAc-HAc，1M NaCl，pH 5.2。

根据PEG自身不带电荷的性质，通过离子交换柱可以分离蛋白和过量的马来酰亚胺聚乙二醇修饰试剂。

优选地，所述Superdex 200凝胶过滤层析方法用到的平衡缓冲液为20mM PB，0.15M Na

本发明采用一步SP FF阳离子交换层析和Superdex 200凝胶过滤层析的方法进行纯化，纯化后的rhG-CSF马来酰亚胺聚乙二醇单修饰产品纯度能够达到95％以上。

优选地，步骤(2)所述对纯化后的单修饰产物进行结构和活性验证，所述结构验证包括利用荧光光谱和圆二色光谱对修饰产物进行结构检测。

优选地，所述活性验证包括体外细胞活性和体内长效验证。利用特定细胞与对应蛋白的依赖性生长关系，通过NFS-60细胞增值活性分析rhG-CSF马来酰亚胺聚乙二醇修饰产物的生物活性。进一步使用Sprague Dawley(SD)大鼠进行蛋白质修饰样品体内药代动力学性质的研究，通过尾静脉注射SD大鼠rhG-CSF马来酰亚胺聚乙二醇修饰产物，在既定时间点采集血清，ELISA试剂盒测定血清中修饰产物的代谢情况，构建动力学模型考察考察修饰产物的长效规律。

一个优选技术方案，本发明所述基于高压条件的重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)定点聚乙二醇修饰方法包括以下步骤：

(1)将修饰摩尔比为1:1-1:10(蛋白：PEG)的rhG-CSF和马来酰亚胺聚乙二醇修饰试剂加入至pH值6.5-8.0的缓冲溶液中混合均匀，得到混合溶液，将混合溶液在0.1-600MPa压力下进行高压处理6-24h；

(2)高压处理结束后将修饰混合溶液置换到pH 4.5醋酸钠缓冲溶液中终止修饰反应，然后采用一步SP FF阳离子交换层析结合Superdex 200凝胶过滤层析对高压处理后的修饰产物进行分离纯化得到rhG-CSF马来酰亚胺聚乙二醇修饰产物；并对纯化后的rhG-CSF马来酰亚胺聚乙二醇修饰产物进行结构以及活性验证。

不同于传统变性剂将蛋白结构完全变性伸展开来，高压处理是一种温和的变性过程。本发明利用压力作用可以挤压水分子进入蛋白疏水界面并破坏其疏水结构，使蛋白结构部分松散开来，但不会引起蛋白聚集沉淀。这种结构高度有序，非常接近蛋白天然态。因此高压处理能够将被包埋在rhG-CSF疏水区域内的蛋白被修饰位点氨基酸残基充分暴露在水环境中，提升聚乙二醇修饰试剂与被修饰位点的可及程度，从而提高rhG-CSF马来酰亚胺聚乙二醇修饰反应效率，使用mPEG-40kDa-MAL和mPEG-20kDa-MAL定点修饰rhG-CSF时分别能够提升蛋白单修饰率达到32％和45％，而常压下几乎不发生修饰反应，进而还能减少修饰剂用量，减弱常规修饰反应过程中诸如修饰摩尔比，修饰试剂分子量，修饰反应pH值等反应参数的影响，最终提高生产效率，降低生产成本，适用于大规模工业生产。

附图说明

图1为本发明实施例1中反相高效液相(A)，Superdex200凝胶过滤色谱(B)和SDS-PAGE电泳(C)检测分析在200MPa压力与常压条件下rhG-CSF分别与mPEG-20kDa-MAL以及mPEG-40kDa-MAL修饰反应16h的结果以及rhG-CSF单修饰率的比较(D)；其中条带1：mPEG40k-MAL-rhG-CSF(高压)；条带2：mPEG20k-MAL-rhG-CSF(高压)；条带3：mPEG40k-MAL-rhG-CSF(常压)；条带4：mPEG20k-MAL-rhG-CSF(常压)。

图2为本发明实施例2中反相高效液相(A,B)和Superdex200高效凝胶过滤(C,D)检测分析不同pH值和缓冲体系条件下使用mPEG-20kDa-MAL以及mPEG-40kDa-MAL高压修饰rhG-CSF的结果，修饰反应在200MPa下进行16h。

图3为本发明实施例2中不同pH及缓冲体系下使用mPEG-MAL 20kDa和40kDa高压修饰rhG-CSF时蛋白修饰率以及修饰产物中mPEG-MAL-rhG-CSF单体含量(图中阴影部分比例)的比较。

图4为本发明实施例3使用SP FF离子交换(A)和Superdex200凝胶过滤(B)组合层析纯化mPEG-MAL-rhG-CSF样品。

图5为本发明实施例1-3制备的重组人粒细胞集落刺激因子马来酰亚胺聚乙二醇修饰产品的荧光光谱图(A)及圆二色光谱图(B)。

图6为本发明实施例1-3制备的重组人粒细胞集落刺激因子马来酰亚胺聚乙二醇修饰产品的体外细胞活性(A)及体内长效活性验证(B)。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

在本实施例中，通过以下方法制备重组人粒细胞集落刺激因子马来酰亚胺聚乙二醇修饰产品，分析高压与常压下rhG-CSF与马来酰亚胺聚乙二醇修饰结果的对比，具体包括以下步骤：

(1)选择pH 7.5磷酸盐缓冲体系的rhG-CSF蛋白，按照1:2的修饰摩尔比(蛋白：PEG)分别加入20kDa以及40kDa分子量的马来酰亚胺聚乙二醇修饰试剂并混合均匀后加入一次性无菌注射器。

(2)将混合样品放入高压仓，按200MPa压力作用16h。

(3)压力处理结束后按10MPa/min的速度卸压，然后取出样品，将反应混合样置换到pH 4.5体系，终止反应。

(4)将修饰样品按12,000rpm，4℃离心15min后留上清用于检测分析。

(5)以上修饰反应同时在常压下进行并且与高压修饰反应结果进行比较。

从反相高效液相以及凝胶过滤色谱检测修饰反应结果(图1A和B)来看，常压下rhG-CSF几乎不与修饰试剂反应。而高压下mPEG-MAL能够与rhG-CSF蛋白中游离巯基发生偶和反应并且基本没有聚集体产生，修饰效率远高于常压结果，结合电泳检测进一步验证了高压修饰效果(图1C)。最终高压条件下使用mPEG-40kDa-MAL修饰rhG-CSF蛋白单修饰率达到32％，使用mPEG-20kDa-MAL时的单修饰率则达到45％(图1D)。实验证明高压能够有效抑制对rhG-CSF巯基定点PEG修饰反应时的空间位阻效应，提升修饰反应活性和蛋白修饰率。其中mPEG-20kDa-MAL的修饰效率要略高于mPEG-40kDa-MAL，说明PEG自身分子量所引起的空间位阻效应还是对修饰结果起到了一定负面影响，这可能是由于rhG-CSF蛋白的游离巯基被深埋在蛋白空间结构内，实验所选择的压力只能一定程度提升其暴露水平，仍需要进一步研究压力参数以及其他修饰反应参数。

实施例2

在本实施例中，通过以下方法制备重组人粒细胞集落刺激因子马来酰亚胺聚乙二醇修饰产品，分析其他反应过程参数对高压下rhG-CSF巯基PEG修饰结果的影响，具体包括以下步骤：

(1)选择pH 7.0PB缓冲溶液，7.5PB缓冲溶液以及7.5Tris-HCl缓冲溶液条件的rhG-CSF蛋白，按照1:2的修饰摩尔比(蛋白：PEG)分别加入20kDa以及40kDa分子量的马来酰亚胺聚乙二醇修饰试剂，混合均匀后加入一次性无菌注射器。

(2)将混合样品放入高压仓，按200MPa压力作用16h。

(3)压力处理结束后按10MPa/min的速度卸压，然后取出样品，将反应混合样置换到pH 4.5体系，终止反应。

(4)将修饰样品按12,000rpm，4℃离心15min后留上清用于检测分析。

传统修饰反应中溶液pH值以及缓冲溶液体系也是影响修饰反应结果的重要因素，通过研究高压下不同pH值以及缓冲体系对于定点修饰rhG-CSF游离巯基的影响发现在相同pH值条件时，Tris-HCl体系中蛋白修饰率要明显高于PB体系，而且在pH 7.5条件下的修饰率则要高于pH 7.0的结果(图2A和B)。但是当进一步使用Superdex200凝胶过滤色谱对修饰产物进行分析时却发现pH 7.5Tris-HCl体系中的蛋白修饰样品主要呈现为聚集体，而在PB环境下聚集体则明显减少(图2C和D)。

通过反相高效液相色谱检测分别计算三种缓冲溶液条件中的rhG-CSF蛋白修饰率，然后通过凝胶过滤色谱计算得到rhG-CSF修饰产物单体比例，从图3中可以看出在pH7.5Tris-HCl体系中蛋白修饰率达到80％以上，但是其中mPEG20k-MAL-rhG-CSF的单体比例只含有20％不到，并且mPEG40k-MAL-rhG-CSF单体比例也只有35％左右，两种修饰产物中都存在大量聚集体。而相对于Tris-HCl体系，在pH 7.5PB环境下的蛋白修饰产物中聚集体的比例明显减少，使用mPEG-20kDa-MAL修饰rhG-CSF时的蛋白修饰率接近50％，其中修饰产物单体比例能够达到45％，使用mPEG-40kDa-MAL修饰rhG-CSF时的蛋白修饰率达到35％，其中修饰产物单体比例达到32％。在pH 7.0PB溶液中则几乎不存在修饰产物聚集体，但是在pH7.0条件下蛋白修饰率也比较低，分别只获得17.3％的mPEG20k-MAL-rhG-CSF与10.6％的mPEG40k-MAL-rhG-CSF，低于pH 7.5条件下蛋白修饰产物的单体比例。

实施例3

在本实施例中，通过以下方法分离纯化重组人粒细胞集落刺激因子马来酰亚胺聚乙二醇修饰产品，具体包括以下步骤：

(1)SP FF阳离子交换层析纯化：将高压修饰获得的样品稀释5倍后上样，平衡缓冲溶液为20mM NaAc-HAc，pH 5.2，洗脱缓冲液为20mM NaAc-HAc，1M NaCl，pH 5.2。上样结束后先用5％洗脱缓冲液淋洗，然后用100％洗脱缓冲液直接洗脱2-3柱体积，收集洗脱峰。

(2)Superdex 200凝胶过滤层析纯化：将SP FF纯化样品用Superdex 200进一步纯化，平衡缓冲液为20mM PB，0.15M Na

图4分别是SP FF纯化层析图和Superdex 200纯化层析图。通过图上可以看出，根据PEG自身不带电荷的性质，通过SP FF层析纯化可以分离蛋白和过量的马来酰亚胺聚乙二醇修饰试剂。进一步使用Superdex 200层析进行纯化时，未与马来酰亚胺聚乙二醇修饰试剂反应的rhG-CSF蛋白被分离去除，从而获得rhG-CSF马来酰亚胺聚乙二醇单修饰产品。本发明采用一步SP FF阳离子交换层析和Superdex 200凝胶过滤层析的方法进行纯化，纯化后的rhG-CSF马来酰亚胺聚乙二醇单修饰产品纯度能够达到95％以上。

实施例4

在本实施例中，通过以下方法验证本工艺制备得到的重组人粒细胞集落刺激因子马来酰亚胺聚乙二醇修饰产品的结构与活性，具体包括以下步骤：

(1)荧光光谱分析检测修饰样品的结构：比较rhG-CSF标准品以及本制备工艺获得的rhG-CSF马来酰亚胺聚乙二醇修饰产品的三级结构。

图5A表明本发明制备工艺获得的rhG-CSF马来酰亚胺聚乙二醇修饰产品的最大发散峰存在一定蓝移，这是由于聚乙二醇覆盖蛋白所致，符合理论值。

(2)圆二色光谱分析检测修饰样品的结构：比较rhG-CSF标准品以及本制备工艺获得的rhG-CSF马来酰亚胺聚乙二醇修饰产品的二级结构。

图5B表明本发明制备工艺获得的rhG-CSF马来酰亚胺聚乙二醇修饰产品的二级结构与标准品一致，符合理论值，说明本发明得到的修饰产品结构正确。

(3)通过NFS-60细胞增值活性分析本发明制备工艺获得的rhG-CSF马来酰亚胺聚乙二醇修饰产品的生物活性。

图6A表明本发明制备工艺获得的rhG-CSF马来酰亚胺聚乙二醇修饰产品的细胞活性为rhG-CSF标准品的40％，与文献报道类似。

(4)使用SD大鼠进行本发明制备工艺获得的rhG-CSF马来酰亚胺聚乙二醇修饰产品体内药代动力学分析。

图6B表明本发明制备工艺获得的rhG-CSF马来酰亚胺聚乙二醇修饰产品的体内半衰期相较于rhG-CSF标准品要明显提升。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。