水蛭提取物在银屑病外用药物研制中的应用

摘要

本发明公开了水蛭提取物在治疗银屑病药物研制中的应用；所述凝胶药物由1％～10％的水蛭素活性成分和70％～85％的凝胶与其他必要药用辅料组成；所述乳膏药物由1％～10％的水蛭素活性成分和凡士林或鱼肝油、羊毛脂等必要基质和其他必要药用辅料组成；由水蛭提取物制备而成的药物凝胶和乳膏在治疗皮肤疾病时有显著效果，且本发明所采用的水蛭提取物低廉无毒，不仅安全有效，且易于产业化生产，后续能取得更好的经济收益和社会效益。其有效成分不同于现有的抗炎药物，涉及天然小分子化合物领域，水蛭提取物在治疗皮肤疾病尤其是银屑病中的应用较好。

说明书

技术领域

本发明属于银屑病治疗药物技术领域，具体涉及水蛭提取物在治疗银屑病药物中的应用。

背景技术

银屑病是一种常见的以表皮角化不全、炎性细胞浸润、真皮毛细血管扩张为特征的慢性遗传性炎症性疾病。银屑病患者不仅承担着巨大的生理压力，皮肤瘙痒疼痛，甚至破裂出血，严重者不能自由活动，在心理上也饱受煎熬，影响正常社交，生活质量下降。银屑病的病程较长且易复发，其传统治疗方法包括维A酸类药物、免疫抑制剂等系统用药，糖皮质激素、维生素D3衍生物等外用，物理治疗和中医治疗等。

虽然数年来对于银屑病的治疗和探究一直在不断进行，但其病因和发病机制仍尚未明确。银屑病患者承担着巨大的生理压力，皮肤瘙痒疼痛，甚至破裂出血，严重者不能自由活动，心理上也饱受煎熬，影响正常社交，生活质量下降。由于银屑病发病病程比较长久，并伴随着一系列并发症，目前的药物很难完全治愈银屑病，因此迫切需要对银屑病发病机制进一步探明，并寻找更加理想的药物。

水蛭为我国的一味传统活血化瘀药材，为环节门蛭纲动物，在两千多年前的《神农本草经》中就有记录，后来在《本草纲目》和《中国动物药》等一专注中也有相应的记载。水蛭作为一种传统中药材，具有活血化瘀和通经之功能。菲牛蛭Poecilobdella manillensisLesson. 系医蛭科牛蛭属动物,俗名马尼拟医蛭，我国福建、台湾、广东、广西、海南和云南均有分布。现代研究表明菲牛蛭含有菲牛蛭素、氨基酸、脂肪酸、微量元素等成分，具有抗凝血、抑制血小板凝聚、抗血栓、降血脂、抗肿瘤等药理作用。临床多用于脑血栓、脑溢血、高黏血症、高脂血症、高血压病、冠心病等疾病的治疗。日本医蛭(Hirudo nipponia)为医蛭科医蛭属的动物，俗名稻田医蛭、蚂蝗、线蚂蝗、水蛭、日本医水蛭。一般栖息于水田及其与之相通的沟渠、池塘和沼泽中以及特别是常年积水或排水不良的沤田和畈心田中数量最多。具有治疗破血，逐瘀，通经。治蓄血，症瘕，积聚，妇女经闭，干血成痨，跌扑损伤，目亦痛，云翳等功效。宽体金线蛭通常为暗绿色，具6条细密的黄黑色斑点组成的纵线，背中线1条较深。腹面淡黄色，杂有许多不规则的茶绿色斑点，前吸盘小，颚齿不发达；主要生活于水田、河流、湖沼中；不吸血，吸食水中浮游生物、小形昆虫、软体动物的幼虫及泥面腐殖质等，全国大部地区均有分布。山蛭俗称旱蚂蟥,，蛭纲(Hirudinea) 环节动物的1属。山蛭常栖息于我国南方潮湿的山区草地或竹林里。又称草蛭。蛭纲，水蛭科。体略呈长椭圆形，长约3cm。常栖息在山林中，当人畜行经其旁时，就附着于胫股部，或钻入皮内吮吸人畜血液，被螫之处易生疮肿，目前记载其具有祛风活络，解毒消肿。用于跌打损伤，风湿性关节炎，腰痛，乳腺炎，毒蛇咬伤等功效。

水蛭提取物是水蛭及其唾液腺中已提取出多种活性成分中活性最显著并且研究得最多的一种成分水蛭提取物对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止所发现最强的凝血酶天然特异抑制剂。目前，有文献记载，水蛭提取物外用凝胶可以渗透皮肤，达到皮下层，发挥水蛭提取物促进创面愈合的作用等，且对于水蛭提取物的抗炎等功效也逐渐被发现。

目前市面上治疗银屑病的药物疗效往往难以维持，且毒副反应较多，尤其对肝脏、肾脏和骨髓的毒性大，长期使用不良反应较重，患者依从性差，易对治疗丧失信心。

发明内容

本发明以水蛭提取物为活性成分，制备凝胶药物和乳膏药物用于银屑病的治疗，在治疗银屑病时有显著效果，且水蛭提取物成分无毒，不会对人体产生药物副作用。

为了达到上述技术目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

水蛭提取物在治疗银屑病药物研制中的应用；

优选的，所述药物包括：凝胶剂、乳膏剂；

优选的，所述凝胶剂由1％～10％的水蛭提取物活性成分和 70％～85％的凝胶与其他必要药用辅料组成；

优选的，所述乳膏剂由1％～10％的水蛭提取物活性成分和凡士林或羊毛脂、鱼肝油等基质与其他必要药用辅料组成；

本发明的另一目的在于提供一种治疗银屑病凝胶剂和乳膏剂的制备方法，包括以下步骤：

S1：水蛭活性多肽的制备方法，包括以下步骤：

S1.1：将水蛭或菲牛蛭粉末溶于Tris-HCl缓冲溶液中，加入三氯乙酸，涡旋后超声，煮沸，待冷却溶解后进行离心，收集提取液；

S1.2：先加入活性炭、白陶土、硅藻土脱腥脱色后采用过滤的方式除去不溶物，再利用半透膜处理；

S1.3：得到分子量在300Da到300000Da之间的大分子成分后通过MPLC和HPLC进行纯化分离得多肽物质；

S2：将S1.1中所述溶液进行过滤；将S1.1中所述滤液放入陶瓷膜过滤中除去小分子不溶物；将S1.2中得到的滤液利用有机膜过滤得到分子量在300Da到300000Da之间的大分子成分多肽；

S3：对步骤S2进行处理，先通过脱脂棉过滤大颗粒不溶物，对通过脱脂棉滤过的溶液进行过滤时滤纸选用20-300μm定量滤纸或无纺布过滤袋过滤；

S4：步骤S2中所述陶瓷膜过滤时控制溶液温度为0-100℃，透过时间为1-5h；陶瓷膜孔径为20-500μm；

S5：将透过陶瓷膜的澄清透明溶液先通过30KDa的有机膜过滤机得到透过液，再通过300Da的有机膜得到分子量在300-300000之间的多肽类物质，使用有机膜透过时每次透过时间为1-6h；

S6：所述有机膜过滤后的多肽物质冻干后得到深色粉状冻干多肽物；

S7：称取纯化后的水蛭提取物粉末适量溶于无菌水中，离心；

S8：取占总量20％～30％的凝胶粉末于离心管中，将离心后水蛭提取物上清液加于离心管中，溶解凝胶粉末；

或将冻干粉末取30g～50g于离心管中，加入基质如凡士林、羊毛脂、鱼肝油等，与粉末混合均匀成乳膏状，加热至80℃左右，取出冷却；

S9：溶解后的凝胶于2～8℃保存；冷却后的乳膏于常温保存。

优选的，所述Tris-HCl缓冲溶液pH为6-10，温度为0-100℃；三氯乙酸含量为1％-5％；水蛭干粉溶液浓度为5～30mg/mL。

优选的，所述S8中的凝胶粉末包括但不限于泊洛沙姆、卡波姆。

本发明的有益效果是：

1)本发明由水蛭提取物制备而成的药物凝胶或乳膏在治疗皮肤疾病时有显著效果，且本发明所采用的水蛭提取物低廉无毒，不仅安全有效，且易于产业化生产，后续能取得更好的经济收益和社会效益。

2)本发明的水蛭提取物凝胶及乳膏是一种治疗银屑病等皮肤疾病的潜在新药，其有效成分不同于现有的抗炎药物，涉及天然小分子化合物领域，水蛭提取物在治疗皮肤疾病尤其是银屑病中的应用较好。

附图说明

图1是小鼠背部皮损进行PASI评分记录图；

图2是PASI评分趋势线图；

图3是PASI评分柱状图；

图4是小鼠背部皮损HE染色图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

治疗银屑病的外用凝胶剂，由含水蛭提取物有效成分的泊洛沙姆、卡波姆、甘油、透明质酸、纯净水等制成。该制备方法包括以下步骤：将水蛭提取物冻干粉溶于超纯水中，配制为水蛭提取物浓度为 5％～7％的水溶液，震荡混匀后，进行离心，取上清液1。称量适量的泊洛沙姆或卡波姆等凝胶颗粒，将液体1加入颗粒中，再加入适量甘油、透明质酸，防腐剂等，混合后制得凝胶含量浓度为20％～30％的含水蛭提取物有效成分的凝胶外用剂。

实施例2

治疗银屑病的外用凝胶剂，由含水蛭提取物有效成分的泊洛沙姆、卡波姆、甘油、透明质酸、纯净水等制成。将水蛭提取物冻干粉溶于超纯水中，配制为水蛭提取物浓度为3％～5％的水溶液，震荡混匀后，进行离心，取上清液2。称量适量的泊洛沙姆或卡波姆等凝胶颗粒，将液体2加入颗粒中，再加入适甘油、透明质酸、防腐剂等，混合后制得凝胶含量浓度为20％～30％的含水蛭提取物有效成分的凝胶外用剂。

实施例3

治疗银屑病的外用凝胶剂，由含水蛭提取物有效成分的泊洛沙姆、卡波姆、甘油、透明质酸、纯净水等制成。将水蛭提取物冻干粉溶于超纯水中，配制为水蛭提取物浓度为1％～3％的水溶液，震荡混匀后，进行离心，取上清液3。称量适量的泊洛沙姆或卡波姆等凝胶颗粒，将液体3加入颗粒中，再加入适甘油、透明质酸、防腐剂等，混合后制得凝胶含量浓度为20％～30％的含水蛭提取物有效成分的凝胶外用剂。

实施例4

治疗银屑病的外用乳膏剂，由水相和油相两部分混合组成。水相成分配制：取冻干粉末取50g～70g于离心管中，过10目筛，加入10 倍药粉质量的90％乙醇，超声提取1h，抽滤后得药液A；药渣加8 倍量60％乙醇，超声提取1h，抽滤后，药渣加10倍超纯水，超声提取1h，抽滤后将最后两次滤液混合得药液B。将A、B药液减压浓缩，使二者混合后形成浓度为1g/mL的药液(含生药量)。油相组分配制：加入基质如凡士林、羊毛脂、鱼肝油、，硬脂酸、十六醇、水和少量防腐剂(如凯松CG)等，将其混合均匀。取上述基质处方中油相成分和水相成分分别在80℃水浴条件下加热熔化。搅拌条件下将药液与油相缓慢加至水相之中，进行乳化，待基质乳化完全后，降温凝固，制成相应基质的乳膏。

实施例5

治疗银屑病的外用乳膏剂，由水相和油相两部分混合组成。水相成分配制：取冻干粉末取30g～50g于离心管中，过10目筛，加入10 倍药粉质量的90％乙醇，超声提取1h，抽滤后得药液A；药渣加8 倍量60％乙醇，超声提取1h，抽滤后，药渣加10倍超纯水，超声提取1h，抽滤后将最后两次滤液混合得药液B。将A、B药液减压浓缩，使二者混合后形成浓度为1g/mL的药液(含生药量)。油相组分配制：加入基质如凡士林、羊毛脂、鱼肝油、，硬脂酸、十六醇、水和少量防腐剂(如凯松CG)等，将其混合均匀。取上述基质处方中油相成分和水相成分分别在80℃水浴条件下加热熔化。搅拌条件下将药液与油相缓慢加至水相之中，进行乳化，待基质乳化完全后，降温凝固，制成相应基质的乳膏。

实施例6

治疗银屑病的外用乳膏剂，由水相和油相两部分混合组成。水相成分配制：取冻干粉末取10g～30g于离心管中，过10目筛，加入10 倍药粉质量的90％乙醇，超声提取1h，抽滤后得药液A；药渣加8 倍量60％乙醇，超声提取1h，抽滤后，药渣加10倍超纯水，超声提取1h，抽滤后将最后两次滤液混合得药液B。将A、B药液减压浓缩，使二者混合后形成浓度为1g/mL的药液(含生药量)。油相组分配制：加入基质如凡士林、羊毛脂、鱼肝油、，硬脂酸、十六醇、水和少量防腐剂(如凯松CG)等，将其混合均匀。取上述基质处方中油相成分和水相成分分别在80℃水浴条件下加热熔化。搅拌条件下将药液与油相缓慢加至水相之中，进行乳化，待基质乳化完全后，降温凝固，制成相应基质的乳膏。

实施例7

银屑病样小鼠模型建立：将Toll样受体7/8的激动剂咪喹莫特乳膏外涂于小鼠皮肤，可诱导小鼠皮肤出现银屑病样皮损及组织学改变，如引起角质细胞的增生和免疫细胞的浸润，产生银屑病样皮炎，与人的银屑病皮损处病理特征很相似。该动物模型已经被广泛用于银屑病药物的筛选及机制研究。

动物实验1

将60只2-4周龄大小的雄性BALB/c小鼠，根据体重编号，随机分成6组，每组10只。分为正常对照组(A组)、银屑病样小鼠空白凝胶组(B组)、阳性药卡泊三醇组(C组)、银屑病样小鼠7％水蛭提取物凝胶组1(D组)(实例1)、银屑病样小鼠5％水蛭提取物凝胶组(E 组)(实例2)、银屑病样小鼠3％水蛭提取物凝胶组(F组)(实例3)。 A组为空白对照组，在实验过程中不作其他处理；B组在第0-6天连续在背部涂抹咪喹莫特乳膏，间隔3小时后在背部涂抹空白凝胶剂基质；C组在第0-6天连续在背部涂抹咪喹莫特乳膏，间隔3小时后在背部涂抹卡泊三醇乳膏；D组在第0-6天连续在背部涂抹咪喹莫特乳膏，间隔3小时后在背部涂抹7％水蛭提取物凝胶。E组在第0-6天连续在背部涂抹咪喹莫特乳膏，间隔3小时后在背部涂抹5％水蛭提取物凝胶。F组在第0-6天连续在背部涂抹咪喹莫特乳膏，间隔3小时后在背部涂抹3％水蛭提取物凝胶。第7天对小鼠背部银屑病皮损的严重程度进行评价。

PASI(Psoriasis Area and Severity Index)评分是银屑病皮损程度评分的缩写，它是一套国际通行的评价银屑病皮损面积及严重程度的客观方法。每天对小鼠背部皮损进行PASI评分，并对小鼠背部皮损拍照进行记录，具体如图1所示，由图1可知，A组小鼠皮肤未见红斑、鳞屑、增厚；B组、C组小鼠背部皮肤在涂抹咪喹莫特2～3天后，开始出现红斑，并有少量鳞屑，随着时间的延长逐渐加重，皮肤增厚，到第7天达到高峰；C组、D组、E组和F组小鼠背部皮肤红斑较B 组减轻，鳞屑减少，随着时间延长，与B组区别渐增大，到第7天时明显。待6组实验完成后(第7天)处死小鼠，取小鼠背部皮损处的皮肤组织进行炎症细胞因子检测和包埋切片，进行HE染色观察皮损组织的病理表现，

将6组小鼠的PASI评分制成趋势线，并将6组小鼠的第7天的 PASI评分制成柱状图，并进行统计学分析，如图2和图3所示，D 组和E组、F组与B组、C组差异有统计学意义(P＜0.0001)。

参照图4，在100倍放大倍数下，HE染色发现B组、C组小鼠第7天背部皮损HE染色显示角化过度伴角化不全，棘层肥厚，真皮浅层血管扩张充血，管周稀疏淋巴细胞浸润，基本符合银屑病病理改变；A组小鼠背部皮肤HE染色则无上述变化；说明银屑病样小鼠模型构建成功。D组和E组、F组较A组存在角化过度和角化不全，但棘层厚度较B组明显减轻。

由此可知，水蛭提取物凝胶可局部用药治疗减轻银屑病样皮损，通过抑制角质形成细胞的增殖达到治疗银屑病的作用，对于银屑病具有显著的治疗功效。