一种抗包虫病重组疫苗P29表位肽免疫小鼠后产生的免疫应答效应

摘要

本发明公开了一种抗包虫病重组疫苗P29表位肽免疫小鼠后产生的免疫应答效应，属于生物工程技术领域，本申请通过将KLH载体与申请人先前研究中筛选的T细胞和B细胞表位肽耦联构建了三种表位疫苗(rEg.P29T、rEg.P29B和rEg.P29T+B)。此外，这些表位疫苗的免疫原性也在小鼠中进行了评估。本发明肽疫苗免疫后能够诱导对机体具有保护效应的Th1型免疫反应，并且单独B细胞表位疫苗(rEg.P29B)或单独T细胞表位疫苗(rEg.P29T)免疫动物后产生特异性抗体或细胞因子的水平和维持时间均低于T细胞和B细胞表位联合疫苗(rEg.P29T+B)。综合上述检测结果，rEg.P29T+B表位疫苗有望作为一种潜在的、有效的亚单位疫苗。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种抗包虫病重组疫苗P29表位肽 免疫小鼠后产生的免疫应答效应。

背景技术

包虫病(Hydatidosis)，又称细粒棘球绦虫病(Echinococcusgranulosu)，是 由细粒棘球绦虫的幼虫寄生而引起的人畜共患寄生虫病，主要分布在畜牧业发达 地区。它的存在给人们的健康和畜牧业的发展带来了居大的负担。人和食草类动 物(主要指牛羊)因误食虫卵而感染引发疾病。在自然界中，牛羊是包虫病传播 的中间宿主，它也成为包虫病在自然界循环传播是其最重要的环节。

由于包虫病是通过感染而引起的传染性疾病，因此，通过疫苗接种来预防该 病的传播被认为是可行的。就目前全球范围内，包虫病疫苗的研制还没有达到令 人满意的程度。较为成功的是国外研究的Eg.95疫苗(为一种基因工程疫苗)， 现已转化为畜用疫苗上市。在国内的包虫病疫苗研究中，我们前期的研究发现的 细粒棘球绦虫重组蛋白P29(rEg.P29)是最成功的基因工程疫苗分子之一。在模 拟自然感染的绵羊和继发感染的小鼠模型中分别获得94.5％(Wang H,Li Z,Gao F,et al.Immunoprotection of recombinantEg.rEg.P29 against Echinococcus granulosus in sheep.Vet Res Commun.2016.)和96.6％(Shi Z.Cloning,expression, and protective immunity in mice of a geneencoding the diagnostic antigen P-29of Echinococcus granulosus.Acta BiochimBiophys Sin(Shanghai).2009.)的免疫保护 效果，这为rEg.P29作为抗细粒棘球绦虫疫苗的开发打下了良好的基础。

基因工程疫苗是利用现代分子生物学技术，通过基因重组、表达、纯化而人 工制备的一种蛋白质分子疫苗，具有能够大量生产、安全性高、成本低等优势。 它已经在多种传染病的免疫预防中发挥了重要的作用，被认为是最成功的分子疫 苗。但经过多年的实际应用，也显示出基因工程疫苗存在着的一些缺陷。主要表 现在：一是基因工程疫苗是通过细菌来生产，而细菌内的内毒素的清除会为大量 的生产带来极大的困难；另外，蛋白质分子疫苗发挥作用并不是靠一个完整的蛋 白质，仅是靠一个蛋白质中部分有效的肽片段(表位肽)在发挥疫苗的效应。也 就是说，在一个蛋白质中，有的肽段具有表位肽的作用，能够引起宿主的免疫应 答而发挥抗原(疫苗)的作用。而一些由疏水氨基酸构成的肽段则不具备这样的 效应，甚至起相反的作用。这也是一些基因工程蛋白不能起到疫苗作用的原因。 基于这一特点，将一个蛋白质中有效的肽段选择出来，并研究其是否具有疫苗的 效应，就形成了一种新型的分子疫苗——肽疫苗。与传统疫苗相比，多肽疫苗具 有安全、稳定、产量高、免疫原性好、选择性引发多种免疫反应等优点。以表位 为重点的疫苗接种的一些潜在优势主要包括能够将免疫反应集中在关键的中和 表位上，同时避免引发对保护不起作用甚至可能有害的特异性反应。目前，多肽 疫苗已在肿瘤、神经退行性疾病、免疫、肝细胞癌、口蹄疫等疾病的防治背景下 得到广泛研究，代表了疫苗开发的新方向。然而，与任何新方法一样，在表位疫 苗的开发和最终应用方面仍然存在多重挑战。

例如，由于肽的尺寸相对较小，它们本身通常具有弱免疫原性，因此需要载 体分子来增加化学稳定性和佐剂，以诱导强大的免疫反应。血蓝蛋白(KLH)是一 种来自不可食用的大分子海洋软体动物的新抗原，几十年来已在临床试验和动物 研究中进行了研究。它已被用于诱导T细胞依赖性初级反应并作为抗原载体来 制备治疗性疫苗。KLH相关疫苗已被证明在人体试验中是安全和可耐受的，并 通过诱导免疫反应提供持续的治疗效果。因此，选择KLH作为rEg.P29表位疫 苗的载体以增加其免疫原性。

鉴于细粒棘球绦虫病对畜牧业造成巨大的经济影响，并进一步对公众健康构 成巨大威胁，一种更安全有效的抗细粒棘球绦虫疫苗将是一种理想的预防策略。

发明内容

本发明的目的是针对现有的问题，提供了一种抗包虫病重组疫苗P29表位肽 免疫小鼠后产生的免疫应答效应。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种抗包虫病重组疫苗P29表位肽免疫小鼠后产生的免疫应答效应，其研究 包括如下步骤：

S1、多表位疫苗的设计：

筛选出T细胞表位肽和B细胞表位肽的N端耦联KLH载体，构建单独T 细胞或B细胞表位疫苗rEg.P29

S2、实验动物的免疫：

分别使用20μg/ml rEg.P29

S3、肽疫苗免疫小鼠血清特异性抗体检测：

分别于末次免疫后1，2，4，8，16周分离免疫组和对照组血清，使用rEg.P29 或rEg.P29

S4、肽疫苗免疫小鼠血清特异性IgG抗体滴度检测：

末次免疫后2周的免疫血清按照不同比例稀释1:100，1:400，1:1600，1:6400以 及1:25600，然后使用步骤S3的方法检测小鼠血清中抗rEg.P29或rEg.P29

S5、ELISPOT检测rEg.P29或rEg.P29

末次免疫后2周分离小鼠脾脏淋巴细胞，将其接种在rEg.P29或rEg.P29

S6、肽疫苗免疫小鼠血清特异性IgG1/IgG2a抗体比值检测：

分别于末次免疫后1，2，4，8，16周分离免疫组和对照组血清，使用rEg.P29 或rEg.P29

S7、肽疫苗免疫小鼠脾脏淋巴细胞中的特异性细胞因子检测：

分别于末次免疫后1，2，4，8，16周按照实施例5所示方法分离各组小鼠 脾脏淋巴细胞，体外刺激后，37℃，5％CO

S8、ELISPOT检测抗原特异性IFN-γ和IL-4斑点形成细胞数目：

末次免疫后2周分离小鼠脾脏淋巴细胞，体外刺激后将其接种提前包被的ELISPOT板中，37℃，5％CO

S9、流式细胞术分析免疫后脾细胞抗原特异性CD4

末次免疫后2周分离小鼠脾脏淋巴细胞，体外刺激后流式细胞术检测抗原特 异性CD4

S10、记忆B细胞、浆细胞和浆母细胞表型检测：

分别于末次免疫后1，2，4，8，16周按照实施例5所示方法分离各组小鼠 脾脏淋巴细胞，采用步骤S9所示方法检测记忆B细胞、浆细胞和浆母细胞表型；

S11、记忆性CD4

分别于末次免疫后1，2，4，8，16周按照步骤S5所示方法分离各组小鼠脾 脏淋巴细胞，采用步骤S9所示方法检测记忆性CD4

进一步地，步骤S3中所述的ELASA试验步骤为：

(1)用coating buffer稀释rEg.P29

(2)次日，倾倒包被液，用PBST洗3次，拍干后加入含5％脱脂奶粉的 PBST，200μL/well，37℃孵育1h；

(3)倾倒封闭液，用PBST洗5次，然后加入免疫小鼠血清(用含5％脱脂 奶粉的PBST按照1:100的比例进行稀释)，每孔100μL，37℃孵育2h；

(4)倾倒液体，用PBST洗5次，然后加入相应检测抗体，每孔100μL， 37℃孵育1h；

(5)倾倒液体，用PBST洗7次，然后加入TMB显色液每孔100uL，显色 8～10min后加入终止液终止反应，在15min内用酶标仪测定450nm处OD值；

(6)分析数据。

进一步地，步骤S5中所述的ELISPOT法检测rEg.P29或rEg.P29

S501、小鼠脾脏淋巴细胞的分离：

分离脾部周围多余组织，取全脾，放入装有Hank’s的15ml离心管中置于冰 上，提取细胞时先用Hank’s洗涤两遍，于70μm filter中用高压灭菌五毫升注射 器的活塞轻轻研磨，边研磨边加入Hank’s冲洗；将获得的滤液离心弃上清，用 过Hank’s重悬平铺在小鼠脾脏淋巴细胞分离液面上2200转室温离心20min(升 7降0)，离心后吸取白膜层用Hank’s洗涤并再次离心，1800转室温离心8min， 弃上清，用完全1640培养液重悬并计数；

S502、ELISPOT检测rEg.P29或rEg.P29

试剂准备：

包被液(1×PBS)：1LpH 7.2；

8g氯化钠(NaCl)，0.2g氯化钾(KCl)，1.44g磷酸氢二钠(Na

封闭液：细胞培养基(完全1640)；

洗液Ⅰ：1×PBS+0.05％Tween-20；

洗液Ⅱ：1×PBS；

稀释液：1×PBS+10％灭活胎牛血清(FBS)；

无菌滤纸：高压灭菌的滤纸，洗板时用；

(1)紫外灭菌：使用前ELISPOT板照紫外，30min；

(2)捕获抗体(capture antibody)：用包被液稀释捕获抗体rEg.P29或 rEg.P29

(3)洗板：弃液，用封闭液洗板两次，200μL/孔，3-5min/次，最后一次尽 量在无菌滤纸上拍干残留的液体；

(4)封闭：封闭液，200μL/孔，室温2h；

(5)细胞培养：弃液，将加入刺激剂的细胞悬液接种到板内，200μL/孔， 37℃，5％CO

(6)洗板：弃液，去离子水洗板2次，200μL/孔，3-5min/次；洗液Ⅰ洗板 3次，200μL/孔，3-5min/次，最后一次尽量拍干残留的液体；

(7)加检测抗体(Detection antibody)：稀释液1:500倍稀释检测抗体，混 匀后用2μm的滤器过滤，100μL/孔，室温孵育2h；

(8)洗板：弃液，洗液Ⅰ洗板3次，200μL/孔，1-2min/次，最后一次尽量 拍干残留的液体；

(9)加酶：稀释液1:100倍稀释酶，混匀，100μL/孔，室温孵育1h；

(10)洗板：弃液，洗液Ⅰ洗板4次，200μL/孔，1-2min/次；洗液Ⅱ洗板2 次，200μL/孔，1-2min/次，弃掉洗液；

(11)加底物：100μL/孔，第5-60min期间观察点的产生情况，避免产生过 高的背景；

(12)终止：去离子水洗板终止反应；

(13)干燥：室温放置板直至其彻底干燥；

(14)数据分析：ELISPOT Reader读板并进行数据分析。

进一步地，步骤S7中所述的ELISA法步骤如下：

(1)包被捕获抗体(capture antibody)：用包被液1:250倍稀释捕获抗体， 混匀，100μL/孔，96孔板，盖上锡箔纸，湿盒中4℃冰箱过夜；

(2)洗板：弃液，洗液洗3次，摇床，1min/次，最后一次尽量拍干残留的 液体；

(3)封闭：试剂稀释液，200μL/孔，湿盒中，室温1h；

(4)标准品和样本准备：(封闭期间)

①标准品：用试剂稀释液梯度稀释标准品；

②样本：冻存样本提前复融，避免反复冻融样本；

用试剂稀释液按适宜的比例稀释样本，以保证样本中细胞因子的浓度在检测 范围之内；

(5)洗板：弃液，洗液洗3次，摇床，1min/次，最后一次尽量拍干残留的 液体；

(6)加标准品和样本：根据96孔板布局，在相应的孔中加标准品和样本， 100μL/孔，摇床上混匀，湿盒中，室温2h；

标准品：每个浓度2复孔，一般位置为1B～H，2B～H；

样本：3复孔；

(7)洗板：弃液，洗液洗5次，摇床，1min/次，最后一次尽量拍干残留的 液体；

(8)加检测抗体(Detection antibody)和酶(Sav-HRP)：

用试剂稀释液按1:250倍稀释检测抗体和HRP；混匀，100μL/孔，湿盒中， 室温1h；

(9)洗板：弃液，洗液洗7次，摇床，1min/次，最后一次尽量拍干残留的 液体；

(10)显色：底物TMB，100μL/孔，湿盒中室温，避光，显色时间不超过 30min；

(11)终止：终止液，50μL/孔，摇床上混匀，波长λ＝450nm读板；

(12)数据处理。

进一步地，步骤S9中所述的流式细胞术操作步骤如下：

试剂准备：

1×磷酸盐缓冲液(1×PBS)：10LpH 7.2～7.4；

80.0g氯化钠(NaCl)，11.6g磷酸氢二钠(Na

完全溶解后，调整pH值至7.2～7.4，加双蒸水定容至1L，2～8℃保存；

洗液BufferⅡ：1×PBS+0.1％牛血清白蛋白(BSA)+0.05％叠氮钠(NaN

固定液：4％多聚甲醛PFA，2～8℃保存；

破膜液BufferⅢ：1×PBS+0.1％牛血清白蛋白(BSA)+0.05％叠氮钠 (NaN

S901、离心机4℃提前制冷：

待检测细胞根据实验设计，未刺激和/或刺激处理后，调成浓度为1×10

S902、表面分子染色：

(1)离心：4℃，1800rpm，8min；

(2)重悬：弃上清，加入洗液，2mL/管，4℃，1800rpm离心8min，洗两 遍，用洗液重悬细胞，100μL/管；

(3)表面染色：根据实验设计，加入相应的表面分子染色抗体；

(4)孵育：4℃避光孵育30min；

(5)洗涤：加入洗液，2mL/管，4℃，1800rpm离心8min，洗两遍，弃上 清，加入150-200μL/管的洗液重悬，4℃避光放置，等待上机；

(6)上机检测；

S903、细胞内因子染色：

(1)离心：4℃，1800rpm，8min；

(2)重悬：弃上清，加入洗液，2mL/管，4℃，1800rpm离心8min，洗两 遍，用洗液重悬细胞，100μL/管；

(3)表面染色：根据实验设计，加入相应的表面分子染色抗体；

(4)孵育：4℃避光孵育30min；

(5)洗涤：加入洗液，2mL/管，4℃，1800rpm离心8min，两遍；

(6)固定：弃上清，加入4％多聚甲醛(PFA)，500μL/管，混匀，室温避 光8min；

(7)洗涤：加入洗液，2mL/管，4℃，1800rpm离心8min，一遍；弃上清， 加入破膜液，2mL/管，4℃，1800rpm离心8min，一遍；

(8)破膜：弃上清，用破膜液重悬细胞，200μL/管，4℃，放置至少2h或 者过夜；

(9)洗涤：加入破膜液，2mL/管，4℃，1800rpm离心8min，洗一遍；

(10)重悬：用破膜液重悬细胞，100μL/管；

(11)胞内染色：根据实验设计，加入相应的染色抗体，混匀，4℃避光孵 育30min；

(12)洗涤：加入洗液，2mL/管，4℃，1800rpm离心8min，两遍；

弃上清，用150-200μL的洗液重悬，4℃避光放置，等待上机；

(13)上机检测；

S904、数据分析：

用软件Flowjo分析处理数据。

本发明相比现有技术具有以下优点：

1、本申请通过将KLH载体与申请人先前研究中筛选的T细胞(Lv Yongxue,ZhuYazhou,Chang Liangliang et al.Identification of a dominant murine T-cellepitope in recombinant protein P29 from Echinococcus granulosus[J].ActaBiochim Biophys Sin(Shanghai),2022,54:1-12.)和B细胞(Lv Yongxue,Li Shasha,Zhang Tingrui et al.Identification of B-cell dominant epitopes in therecombinant protein P29 from Echinococcus granulosus.[J].Immun Inflamm Dis,2022,10:e611.)表位肽耦联构建了三种表位疫苗(rEg.P29

2、本发明肽疫苗免疫后能够诱导对机体具有保护效应的Th1型免疫反应， 并且单独B细胞表位疫苗(rEg.P29

附图说明

图1为多表位疫苗的设计；

图2为小鼠免疫实验方案，各组小鼠分别皮下注射PBS、CpG、 rEg.P29

图3：肽疫苗免疫小鼠血清特异性抗体检测结果；

图4：肽疫苗免疫小鼠血清特异性IgG抗体滴度检测结果；

图5：rEg.P29或rEg.P29

图6：肽疫苗免疫小鼠血清特异性IgG1/IgG2a抗体比值检测结果；

图7：肽疫苗免疫小鼠脾脏淋巴细胞中的特异性细胞因子检测结果；

图8：抗原特异性IFN-γ和IL-4斑点形成细胞检测；

图9：流式细胞术分析免疫后脾细胞抗原特异性CD4

图10：记忆B细胞、浆细胞和浆母细胞表型检测；

图11：记忆性CD4

具体实施方式

一种抗包虫病重组疫苗P29表位肽免疫小鼠后产生的免疫应答效应，其研究 包括如下步骤：

S1、多表位疫苗的设计：

如图1所示，筛选出T细胞表位肽和B细胞表位肽的N端耦联KLH载体， 构建单独T细胞或B细胞表位疫苗rEg.P29

S2、实验动物的免疫：

如图2所示，分别使用20μg/ml rEg.P29

备注：免疫动物所用肽均为耦联载体后的肽；

S3、肽疫苗免疫小鼠血清特异性抗体检测：

分别于末次免疫后1，2，4，8，16周分离免疫组和对照组血清，使用rEg.P29 或rEg.P29

ELASA试验步骤为：

(1)用coatingbuffer稀释rEg.P29

(2)次日，倾倒包被液，用PBST洗3次，拍干后加入含5％脱脂奶粉的 PBST，200μL/well，37℃孵育1h；

(3)倾倒封闭液，用PBST洗5次，然后加入免疫小鼠血清，每孔100μL， 37℃孵育2h；

(4)倾倒液体，用PBST洗5次，然后加入相应检测抗体，每孔100μL，37℃孵育1h；

(5)倾倒液体，用PBST洗7次，然后加入TMB显色液每孔100uL，显色 8～10min后加入终止液终止反应，在15min内用酶标仪下测定450nm处OD值；

(6)分析数据；

结果显示：肽疫苗免疫后特异性抗体IgM，IgG，IgE和IgA含量明显高于 对照组，差别具有统计学意义。但是单独B细胞表位疫苗(rEg.P29

图3中：*代表显著性差异，其个数代表显著性差异程度，各图标分别代表 用PBS、CpG、rEg.P29

S4、肽疫苗免疫小鼠血清特异性IgG抗体滴度检测：

末次免疫后2周的免疫血清按照不同比例稀释1:100，1:400，1:1600，1:6400 以及1:25600，，然后使用步骤S3的方法检测小鼠血清中抗rEg.P29或rEg.P29

结果显示：单独B细胞表位疫苗(rEg.P29

图4中：各图标分别代表用PBS、CpG、rEg.P29

S5、ELISPOT检测rEg.P29或rEg.P29

末次免疫后2周分离小鼠脾脏淋巴细胞，将其接种在rEg.P29或rEg.P29

S501、小鼠脾脏淋巴细胞的分离：

分离脾部周围多余组织，取全脾，放入装有Hank’s的15ml离心管中置于冰 上，提取细胞时先用Hank’s洗涤两遍，于70μm filter中用高压灭菌五毫升注射 器的活塞轻轻研磨，边研磨边加入Hank’s冲洗；将获得的滤液离心弃上清，用 过Hank’s重悬平铺在小鼠脾脏淋巴细胞分离液面上2200转室温离心20min，离 心后吸取白膜层用Hank’s洗涤并再次离心，1800转室温离心8min，弃上清，用 完全1640培养液重悬并计数；

S502、ELISPOT检测rEg.P29或rEg.P29

(1)紫外灭菌：使用前ELISPOT板照紫外，30min；

(2)捕获抗体：用包被液稀释捕获抗体rEg.P29或rEg.P29

(3)洗板：弃液，用封闭液洗板两次，200μL/孔，3-5min/次，最后一次尽 量在无菌滤纸上拍干残留的液体；

(4)封闭：封闭液，200μL/孔，室温2h；

(5)细胞培养：弃液，将加入刺激剂的细胞悬液接种到板内，200μL/孔， 37℃，5％CO

(6)洗板：弃液，去离子水洗板2次，200μL/孔，3-5min/次；洗液Ⅰ洗板 3次，200μL/孔，3-5min/次，最后一次尽量拍干残留的液体；

(7)加检测抗体：稀释液1:500倍稀释检测抗体，混匀后用2μm的滤器过 滤，100μL/孔，室温孵育2h；

(8)洗板：弃液，洗液Ⅰ洗板3次，200μL/孔，1-2min/次，最后一次尽量 拍干残留的液体；

(9)加酶：稀释液1:100倍稀释酶，混匀，100μL/孔，室温孵育1h；

(10)洗板：弃液，洗液Ⅰ洗板4次，200μL/孔，1-2min/次；洗液Ⅱ洗板2 次，200μL/孔，1-2min/次，弃掉洗液；

(11)加底物：100μL/孔，第5-60min期间观察点的产生情况，避免产生过 高的背景；

(12)终止：去离子水洗板终止反应；

(13)干燥：室温放置板直至其彻底干燥；

(14)数据分析：ELISPOT Reader读板并进行数据分析；

结果显示：rEg.P29或rEg.P29

图5中：*代表显著性差异，其个数代表显著性差异程度，各图标分别代表 用PBS、CpG、rEg.P29

S6、肽疫苗免疫小鼠血清特异性IgG1/IgG2a抗体比值检测：

分别于末次免疫后1，2，4，8，16周分离免疫组和对照组血清，使用rEg.P29 或rEg.P29

结果显示：各免疫组小鼠血清中特异性IgG1/IgG2a抗体比值在检测时间范 围内几乎均低于1，也就是说肽疫苗诱导的免疫反应倾向于Th1型；

图6中：各图标分别代表用PBS、CpG、rEg.P29

S7、肽疫苗免疫小鼠脾脏淋巴细胞中的特异性细胞因子检测：

分别于末次免疫后1，2，4，8，16周按照实施例5所示方法分离各组小鼠 脾脏淋巴细胞，体外刺激后，37℃，5％CO

ELISA法步骤如下：

(1)包被捕获抗体：用包被液1:250倍稀释捕获抗体，混匀，100μL/孔， 96孔板，盖上锡箔纸，湿盒中4℃冰箱过夜；

(2)洗板：弃液，洗液洗3次，摇床，1min/次，最后一次尽量拍干残留的 液体；

(3)封闭：试剂稀释液，200μL/孔，湿盒中，室温1h；

(4)标准品和样本准备：

①标准品：用试剂稀释液梯度稀释标准品；

②样本：冻存样本提前复融，避免反复冻融样本；

用试剂稀释液按适宜的比例稀释样本，以保证样本中细胞因子的浓度在检测 范围之内；

(5)洗板：弃液，洗液洗3次，摇床，1min/次，最后一次尽量拍干残留的 液体；

(6)加标准品和样本：根据96孔板布局，在相应的孔中加标准品和样本， 100μL/孔，摇床上混匀，湿盒中，室温2h；

标准品：每个浓度2复孔，一般位置为1B～H，2B～H；

样本：3复孔；

(7)洗板：弃液，洗液洗5次，摇床，1min/次，最后一次尽量拍干残留的 液体；

(8)加检测抗体和酶：

用试剂稀释液按1:250倍稀释检测抗体和HRP；混匀，100μL/孔，湿盒中， 室温1h；

(9)洗板：弃液，洗液洗7次，摇床，1min/次，最后一次尽量拍干残留的 液体；

(10)显色：底物TMB，100μL/孔，湿盒中室温，避光，显色时间不超过 30min；

(11)终止：终止液，50μL/孔，摇床上混匀，波长λ＝450nm读板；

(12)数据处理；

结果显示：肽疫苗免疫后rEg.P29

图7中：*代表显著性差异，其个数代表显著性差异程度，各图标分别代表 用PBS、CpG、rEg.P29

S8、ELISPOT检测抗原特异性IFN-γ和IL-4斑点形成细胞数目：

末次免疫后2周分离小鼠脾脏淋巴细胞，体外刺激后将其接种提前包被的ELISPOT板中，37℃，5％CO

结果显示：肽疫苗免疫后能够促进IFN-γ的产生而不产生IL-4，并且单独T 细胞表位疫苗(rEg.P29

图8中：*代表显著性差异，其个数代表显著性差异程度，各图标分别代表 用PBS、CpG、rEg.P29

S9、流式细胞术分析免疫后脾细胞抗原特异性CD4

末次免疫后2周分离小鼠脾脏淋巴细胞，体外刺激后流式细胞术检测抗原特 异性CD4

流式细胞术操作步骤如下：

S901、离心机4℃提前制冷：

待检测细胞根据实验设计，未刺激和/或刺激处理后，调成浓度为1×10

S902、表面分子染色：

(1)离心：4℃，1800rpm，8min；

(2)重悬：弃上清，加入洗液，2mL/管，4℃，1800rpm离心8min，洗两 遍，用洗液重悬细胞，100μL/管；

(3)表面染色：根据实验设计，加入相应的表面分子染色抗体；

(4)孵育：4℃避光孵育30min；

(5)洗涤：加入洗液，2mL/管，4℃，1800rpm离心8min，洗两遍，弃上 清，加入150-200μL/管的洗液重悬，4℃避光放置，等待上机；

(6)上机检测；

S903、细胞内因子染色：

(1)离心：4℃，1800rpm，8min；

(2)重悬：弃上清，加入洗液，2mL/管，4℃，1800rpm离心8min，洗两 遍，用洗液重悬细胞，100μL/管；

(3)表面染色：根据实验设计，加入相应的表面分子染色抗体；

(4)孵育：4℃避光孵育30min；

(5)洗涤：加入洗液，2mL/管，4℃，1800rpm离心8min，两遍；

(6)固定：弃上清，加入4％多聚甲醛，500μL/管，混匀，室温避光8min；

(7)洗涤：加入洗液，2mL/管，4℃，1800rpm离心8min，一遍；弃上清， 加入破膜液，2mL/管，4℃，1800rpm离心8min，一遍；

(8)破膜：弃上清，用破膜液重悬细胞，200μL/管，4℃，放置至少2h或 者过夜；

(9)洗涤：加入破膜液，2mL/管，4℃，1800rpm离心8min，洗一遍；

(10)重悬：用破膜液重悬细胞，100μL/管；

(11)胞内染色：根据实验设计，加入相应的染色抗体，混匀，4℃避光孵 育30min；

(12)洗涤：加入洗液，2mL/管，4℃，1800rpm离心8min，两遍；

弃上清，用150-200μL的洗液重悬，4℃避光放置，等待上机；

(13)上机检测；

S904、数据分析：

用软件Flowjo分析处理数据；

结果显示：rEg.P29

图9中：*代表显著性差异，其个数代表显著性差异程度；

S10、记忆B细胞、浆细胞和浆母细胞表型检测：

分别于末次免疫后1，2，4，8，16周按照实施例5所示方法分离各组小鼠 脾脏淋巴细胞，采用步骤S9所示方法检测记忆B细胞、浆细胞和浆母细胞表型；

结果显示：rEg.P29

图10中：*代表显著性差异，其个数代表显著性差异程度；

S11、记忆性CD4

分别于末次免疫后1，2，4，8，16周按照步骤S5所示方法分离各组小鼠脾 脏淋巴细胞，采用步骤S9所示方法检测记忆性CD4

结果显示：图11A，记忆T细胞的门控策略，数据显示三个免疫组诱导 CD44

图11中：*代表显著性差异，其个数代表显著性差异程度。