制备细胞外囊泡的方法及细胞外囊泡的用途

摘要

本公开涉及用于制备细胞外囊泡(EV)的改善方法和组合物。本公开还涉及新颖的基于EV的ELISA测定法和用于执行此类测定法的试剂盒，以及使用包含膜结合抗原的EV产生针对特定抗原的抗体的方法。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请主张2020年6月1日申请的美国临时申请号63/033,014的优先权，其内容通过引用方式全文并入。

技术领域

本公开涉及用于制备细胞外囊泡(EV)的改善方法及组合物。本公开还涉及新颖的基于EV的ELISA测定法和用于执行此类测定法的试剂盒，以及使用包含感兴趣的膜结合抗原的EV产生针对特定抗原的抗体的方法。

背景技术

细胞外囊泡(EV)是细胞衍生的膜结构的异质组，该膜结构由脂质双层包裹。EV包括外泌体、微泡、病毒样颗粒(viral-like particle，VLP)和凋亡小体(>1μm)(Théry等人，“Membrane vesicles as conveyors of immune responses,”Nat Rev Immunol.2009；9(8):581-93；Andaloussi等人，“Extracellular vesicles:biology and emergingtherapeutic opportunities,”Nat Rev Drug Discov.2013；12(5):347-357)。EV可以高度浓缩方式在EV表面以天然构像展示膜蛋白。例如，膜蛋白可以以细胞膜的10到100倍的浓度存在于EV表面。

强大的EV产生平台包括以下一个或多个特征：可重复地掺入单程(single-pass)和多程(multi-pass)膜蛋白的能力；产生足够的EV产量(例如，mg含量)；易于以合理的规模(例如，约1L)转染；及产生种类匹配背景的能力。产生EV的现有方法不能满足所有这些要求。

发明内容

本公开涉及用于制备细胞外囊泡(EV)的改善方法及组合物。本公开还涉及新颖的基于EV的ELISA测定法和用于执行此类测定法的试剂盒，以及使用包含感兴趣的膜结合抗原的EV产生针对特定抗原的抗体的方法。

在一个方面，本公开提供了用于产生与蛋白质特异性结合的抗体的方法。在某些实施例中，该方法包括(a)产生包含异源蛋白质的多个EV，其通过(i)在暴露于囊泡因子的细胞中表达异源蛋白质，(ii)在培养基中培养细胞，和(iii)从该培养基中分离包含异源蛋白质的该多个EV，其中囊泡因子选自由Acyl.Hrs、ARRDC1、ARF6及其组合所组成的组；(b)通过向动物施用该多个EV来免疫该动物；以及(c)从该动物中分离与该异源蛋白质结合的抗体。

可替代地和/或另外地，产生与蛋白质特异性结合的抗体的方法可包括(a)产生包含异源蛋白质的多个EV，其通过(i)在细胞中表达异源蛋白质，(ii)在培养基中培养该细胞，并(iii)从该培养基中分离包含蛋白质的该多个EV，其中细胞是非贴壁细胞；(b)通过向动物施用该多个EV来免疫该动物；以及(c)从该动物中分离与该异源蛋白质结合的抗体。在某些实施例中，该方法可进一步包括在细胞中表达囊泡因子，例如，异源囊泡因子，例如，MLGag、Acyl.Hrs、ARRDC1、ARF6或其组合。

在某些实施例中，通过超速离心从培养基中分离多个EV。在某些实施例中，在第0周、第2周和第4周向动物施用多个EV。在某些实施例中，产生抗体的方法进一步包括将佐剂(例如Ribi佐剂)与EV同时施用于动物。在某些实施例中，产生抗体的方法进一步包括向动物施用加强剂以增强动物对蛋白质的免疫应答。在某些实施例中，加强剂包含蛋白质、编码蛋白质的多核苷酸或其组合。

本公开进一步提供通过本公开的方法所产生的抗体。在某些实施例中，抗体为单克隆抗体。在某些实施例中，抗体为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。本公开进一步提供包含抗体或其抗原结合部分和药用载体的药物组合物。在某些实施例中，药物组合物进一步包括另外的治疗剂。在某些实施例中，通过本公开的方法所产生的抗体或其药物组合物可用作药物、可用于治疗疾病和/或可用于制备药物。在某些实施例中，本公开提供治疗患有疾病的受试者的方法，其中该方法包括向个体施用有效量的本文所公开的分离抗体或其抗原结合部分，或其药物组合物。本公开进一步提供编码本文所公开的抗体或其抗原结合部分的分离核酸，及包含该核酸的宿主细胞。本公开进一步提供了通过在适于表达抗体的条件下培养宿主细胞及任选地从宿主细胞分离抗体来产生抗体的方法。

在另一方面，本公开提供一种用于产生多个EV的方法。在某些实施例中，该方法包括(a)在细胞中表达异源蛋白质；(b)在培养基中培养该细胞；以及(c)从该培养基中分离包含异源蛋白质的该多个EV，其中细胞暴露于选自由Acyl.Hrs、ARRDC1、ARF6及其组合所组成的组的囊泡因子，和/或其中细胞为非贴壁细胞。

在某些实施例中，异源蛋白质为膜蛋白，例如，单程膜蛋白或多程膜蛋白。在某些实施例中，膜蛋白为蛋白质复合物的成员。在某些实施例中，膜蛋白不是跨膜蛋白而是具有跨膜蛋白的复合物的成员。在某些实施例中，非贴壁细胞为293S细胞或Expi293F

在另一方面，本公开提供了用于检测抗体的方法。例如，但不限于，该方法可包括(a)用捕获试剂孵育样品，其中该捕获试剂包括包含膜结合抗原的多个EV，且该抗体与该膜结合抗原特异性结合；以及(b)将与捕获试剂结合的抗体与可检测抗体接触以检测结合的抗体，其中该可检测抗体与该抗体特异性结合。在某些实施例中，通过以下产生该多个EV：(i)在细胞中表达该膜结合抗原，(ii)在培养基中体外培养该细胞以产生该展示膜结合抗原的多个EV，并(iii)从该培养基中分离该展示该膜结合抗原的多个EV。在某些实施例中，将细胞暴露于选自由Acyl.Hrs、ARRDC1、ARF6及其组合所组成的组的囊泡因子和/或该细胞为非贴壁细胞。在某些实施例中，该方法可进一步包括(c)测量在(b)中所检测到的抗体的量，其中使用标准曲线对该量进行定量。在某些实施例中，该样品为血浆、血清或尿液样品。在某些实施例中，捕获抗体可固定化于固体支持物上，例如，微量滴定板。在某些实施例中，可检测抗体是经荧光标记的。在某些实施例中，膜结合抗原为膜蛋白或其片段。

本公开提供用于检测样品中的抗体的试剂盒。在某些实施例中，本公开的试剂盒包括(a)捕获试剂，其包括包含膜结合抗原的多个EV，其中该待测的抗体与膜结合抗原特异性结合；以及(b)可检测抗体，其与待测的抗体特异性结合。在某些实施例中，将多个EV固定化于固体支持物上。在某些实施例中，固体支持物为微量滴定板。在某些实施例中，可检测抗体是经荧光标记的。在某些实施例中，抗原为膜蛋白或其片段。

在某些实施例中，本公开进一步提供一种分选产生抗体的细胞的方法。在某些实施例中，该方法包括将该产生抗体的细胞与多个EV一起孵育，其中该多个EV包含：(i)第一EV群体，其包含膜结合抗原和第一可检测标志物，其中该产生抗体的细胞的子组与该膜结合抗原特异性结合；以及(b)第二EV群体，其缺乏膜结合抗原但包含与第一标志物可区分开的第二可检测标志物。在某些实施例中，该方法进一步包括基于该产生抗体的细胞是与该第一EV群体结合还是与该第一EV群体及该第二EV群体的组合结合来分选该产生抗体的细胞。在某些实施例中，通过以下产生该第一EV群体：(i)在第一细胞中表达该膜结合抗原及该第一可检测标志物，(ii)在培养基中体外培养该第一细胞以产生该展示膜结合抗原的多个EV，并(iii)从该培养基中分离该展示膜结合抗原的多个EV。在某些实施例中，其中通过以下产生该第二EV群体：(i)在第二细胞中表达该第二可检测标志物，(ii)在培养基中体外培养该第二细胞以产生包含第二可检测标志物的该多个EV，并(iii)从该培养基中分离该多个EV。在某些实施例中，将细胞暴露于选自由Acyl.Hrs、ARRDC1、ARF6及其组合所组成的组的囊泡因子。在某些实施例中，第一细胞和/或第二细胞为非贴壁细胞。

附图说明

图1.显示细胞外囊泡(EV)形成的示意图。

图2A至图2B.用于EV形成的设计原则。(2A)一般EV成形物及具有EV设计的Acyl.Hrs。(2B)具有EV设计的MLGag和ARRDC1。

图3.显示产生EV的工作流程的示意图。

图4.使用蛋白质印迹鉴定可产生表达MP-X的EV的囊泡因子。

图5.动态光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)显示均匀的囊泡大小。

图6.蛋白质印迹显示囊泡因子MLGag、Acryl.Hrs和鼠ARRDC1(mARRDC1)在鼠细胞中诱导表达MP-X的EV形成。

图7A至图7B.EV产生的挑战：(7A)获得高效EV纯化的挑战；及(7B)获得足够产量的挑战。

图8A至图8C.在收获日测量Expi293F

图9A至图9C.进行ELISA来比较Expi293F

图10A至图10C.(10A)产生明确定义的EV粒子。(10B，10C)基于EV的ELISA可检测抗单程(10B)和多程(10C)膜蛋白的FACS+抗体。

图11A至图11D.鉴定细胞系用于筛选经Expi293F

图12A至图12C.细胞系被鉴定用于筛选经Expi293F

图13.大鼠RBA细胞可产生EV，但与293S细胞相比，产量较低。

图14.蛋白质印迹证实全细胞裂解物和EV中存在MP-1。

图15.蛋白质印迹证实MP-2存在于EV和全细胞裂解物中。

图16.蛋白质印迹证实MP-3存在于ARF-6中，该ARF-6具有由ARF-6但无MLGag转染的细胞所产生的EV。

图17.示意图显示Gag壳体在空间上阻断MP与大细胞内结构域(largeintracellular domain，ICD)的结合。

图18.显示蛋白质ELISA、基于EV的ELISA和FACS的工作机制的示意图。

图19A至图19D.基于EV的ELISA效价(19A)与MP-4的FACS效价(19B)具有良好的相关性。FACS(19C)和基于EV的ELISA(19D)效价与蛋白质ELISA效价没有良好的相关性。

图20A至图20B.抗MP-5血清是使用DNA免疫法从以MP-5免疫的小鼠收集的。显示了基于EV的ELISA效价(20A)和FACS效价(20B)。

图21.对于检测抗MP5抗体，基于EV的ELISA与FACS具有良好的相关性。

图22A至图22C.MP-6EV起始批次的质量控制(QC)分析。(22A)蛋白质印迹显示分离的EV中存在MP-6。(22B)蛋白质印迹显示分离的EV中存在囊泡因子。(22C)将使用重组蛋白标准的定量蛋白质印迹用于量化分离的EV中的MP-6。

图23.使用MP-6EV的免疫方案。

图24A至图24D.(24A)蛋白质印迹显示，从以EV免疫的大鼠所收集的抗血清中存在抗MP-6和抗Gag抗体。(24B)FACS显示，抗血清与转染对照细胞没有显著的非特异性结合。(24C，24D)FACS显示在DNA/蛋白质加强剂前(24C)和DNA/蛋白质加强剂后(24D)所收集的抗血清中与MP-6表达细胞的结合。

图25A至图25B.纯化的初级抗体(25A)和血清(25B)显示出相似的FACS结果。

图26.DNA加强剂选择性地增加来自经EV免疫的大鼠的抗MP-6效价。

图27A至图27C.小鼠抗MP-7初级抗体由以表达MP-7的EV免疫的剔除小鼠所产生，并通过FACS筛选。在最后一次加强剂前(27A)和最后一次加强剂后(27B)所收集的血清中检测到抗MP-7抗体。血清不结合3T3对照细胞(27C)。

图28.通过FACS筛选小鼠抗MP-7杂交瘤。

图29.藉由FACS筛选小鼠抗MP-7融合瘤。

图30.在初代细胞上使用FACS筛选小鼠抗MP-7mAb。

图31A至图31B.将大鼠以包含膜结合MP-1或MP-1DNA的EV免疫，并以蛋白质或DNA加强剂。通过FACS筛选在加强剂前(31A)和加强剂后(31B)从大鼠所收集的抗血清。

图32.通过FACS筛选大鼠抗MP-1杂交瘤。

图33.仅用包含膜结合MP-8的蛋白质、DNA或EV对大鼠进行免疫。显示从每组中发现的ELISA阳性和FACS阳性抗体的数量。

图34.将大鼠和兔以包含MP-9和MP-9DNA的EV免疫。显示以GFP标记的MP-9EV和RFP标记的空EV对大鼠和兔IgG+B细胞进行染色。

图35.将大鼠和兔以包含MP-10或MP-11的EV免疫。显示以RFP标记的MP EV和GFP标记的空EV对兔IgG+B细胞进行染色。

图36A.表面表达需要MP-14、MP-15、MP-16和MP-17(共受体“B”)与MP-12和MP-13(受体“A”)的共表达。

图36B.MP-14、MP-15、MP-16和MP-17(共受体“B”)与MP-12和MP-13(受体“A”)的共同表达导致EV并入。

具体实施方式

本公开涉及用于制备细胞外囊泡(EV)的改善方法及组合物。本公开还涉及新颖的基于EV的ELISA测定法和用于执行此类测定法的试剂盒，以及使用包含感兴趣的膜结合抗原(例如，膜蛋白)的EV产生针对特定抗原的抗体的方法。本公开部分基于以下发现：通过采用某些纯化步骤、囊泡因子和/或产生EV的细胞系，可达成EV的快速且高产量的生成。部分还基于以下发现：以抗原呈现EV免疫动物可开发针对具有挑战性的膜蛋白抗原和复合物的功能性抗体。本文叙述了本公开的非限制性实施例。

为了使本公开明确的目的而非限制的目的，详细描述分为以下子部分：

I.定义；

II.制造EV的方法；

III.基于EV的ELISA测定法和试剂盒；

IV.使用EV产生抗体的方法；

V.用于诊断和检测的方法和组合物；

VI.药物组合物；

VII.治疗方法和施用途径；

VIII.制品；及

IX.示例性实施例。

I.定义

本公开中使用的术语在本公开的上下文中以及在使用每个术语的特定上下文中通常具有其在本技术领域中的普通含义。某些术语在下文或本公开的其他地方讨论，以在描述本公开的组合物和方法以及如何制备和使用它们时为从业者提供另外的指导。

如本文所用，当“一”或“一种”一词的使用与权利要求和/或说明书中的术语“包含”结合使用时，其可意指“一个”，但也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或大于一个”的含义一致。更进一步，术语“具有”、“包括”、“含有”及“包含”是可互换的，且本技术领域中具有通常知识者认识到这些术语是开放式术语。

术语“约”或“大约”意指特定值处于本领域普通技术人员所确定的可接受的误差范围内，其部分地取决于如何测量或确定该值，即，取决于测量系统的局限性。例如，按照本技术领域中的实践，“约”可意指3倍或3倍以上的标准偏差。可替代地，“约”可意指给定值的至多20％、优选至多10％、更优选至多5％并且更优选至多1％的范围。可替代地，特别是关于生物系统或过程，该术语意指数值的一个数量级内，优选地在数值的5倍以内，并且更优选地在数值的2倍以内。

本文中的“受试者”或“个体”为是脊椎动物，诸如人类或非人类动物，例如哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、非人类灵长类动物、农场动物、运动动物、啮齿动物和宠物。非人类动物个体的非限制性实例包括啮齿动物，诸如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；兔；犬；猫；绵羊；猪；山羊；牛；马；及非人类灵长类动物，如猿和猴。在某些实施例中，受试者或个体为人类。

如本文所用，术语“体外”涉及人工环境和在人工环境内发生的过程或反应。体外环境例如为试管和细胞培养物，但不以此为限。

如本文所用，术语“体内”涉及自然环境(例如，动物或细胞)和在自然环境中发生的过程或反应，诸如胚胎发育、细胞分化、神经管形成等。

如本文所用，术语“生物样品”涉及从个体获得的生物材料样品，包括生物流体，例如，血液、血浆、血清、尿液、痰、脊髓液、胸膜液、乳头吸出物、淋巴液、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的液体、泪液、唾液、母乳、来自淋巴系统的液体、精液、脑脊液、器官系统内液体、腹水、肿瘤囊肿液、羊水、支气管肺泡液，胆汁液及其组合。

本文中的术语“抗体”以最广义使用且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展示出所需的抗原结合活性即可。

如本文所用，术语“抗体片段”是指除完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，与该完整抗体所结合的抗原结合。抗体片段的实例包括，但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')

如本文所用，术语“嵌合抗体”涉及其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源自不同来源或物种的抗体。

如本文所用的术语“单克隆抗体”涉及获自基本上同源抗体群体的抗体，即，包含群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了例如含有天然产生的突变或于单克隆抗体制剂产生过程中产生的可能的变异体抗体之外，这种变异体通常是以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体是针对于抗原上的单一决定簇。因此，修饰词“单克隆”表示抗体的特征是获自基本上同质的抗体群体，且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，依据本公开的单克隆抗体可通过多种技术来制造，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、及利用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座的转殖基因动物的方法，本文描述这些方法及用于制备单克隆抗体的其他示例性方法。

“裸抗体”涉及未与异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标志物缀合的抗体。裸抗体可存在于药物组合物中。

抗体的“类别(class)”是指为其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且其中的几种可进一步分为亚类(同种型(isotype))，例如，IgG

如本文所用，术语“框架(framework)”或“FR”涉及除高变区(CDR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3、和FR4。因此，HVR及FR序列通常以如下顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

如本文所用，术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本上类似的结构的抗体或具有含有本文定义的Fc区的重链的抗体。

“分离的”抗体是从其自然环境的组分中分离出来的抗体。在某些实施例中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，通过(例如)电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)来测定。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等人，J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。

“人共有框架”是代表一系列人免疫球蛋白VL或VH框架序列中最常见的氨基酸残基的框架。通常，系列人免疫球蛋白VL或VH序列来源于可变结构域序列的亚组。通常，序列的亚组是如Kabat等人在Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷)中所述的亚组。在某些实施例中，对于VL，亚组为如上述Kabat等人的文献中的亚组κI。在某些实施例中，对于VH，亚组为如上述Kabat等人的文献中的亚组III。

“人源化(humanized)”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基及来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施例中，人源化抗体将包括基本上所有至少一个(且通常两个)可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些HVR，且所有或基本上所有FR对应对于人抗体的那些FR。人源化抗体任选地可包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如，非人抗体)的“人源化形式”涉及已接受人源化的抗体。

如本文所用的术语“高变区”涉及抗体可变结构域的序列中高度可变的每个区(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上确定的环(“高变环”)和/或包含与抗原接触的残基(“抗原接触”)。除非另有说明，否则可变结构域中的CDR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中是根据前述Kabat等人文献中的编号。一般而言，抗体包含六个CDR；三个在VH中(H1、H2、H3)，及三个在VL中(L1、L2、L3)。在本文中，示例性CDR包括：

(a)高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、及96-101(H3)处(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；

(b)CDR存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；

(c)抗原接触存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；及

(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括CDR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。

“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子复合的抗体，其包括但不限于细胞毒性剂。

术语“核酸分子”或“多核苷酸”包括任何包含核苷酸聚合物的化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基具体而言嘌呤或嘧啶碱基(即，胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即，脱氧核糖或核糖)和磷酸基团构成。通常，核酸分子通过碱基序列进行描述，其中所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列通常由5’至3’表示。在本文中，术语核酸分子包括：脱氧核糖核酸(DNA)，其包括例如，互补DNA(cDNA)和基因体DNA；核糖核酸(RNA)，特定而言信使RNA(mRNA)；DNA或RNA的合成形式；以及包含两个或更多个这些分子的混合聚合物。核酸分子可为线性或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链，以及单链和双链形式。此外，本文所述的核酸分子可包含天然存在或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的示例包括带有衍生糖、磷酸主链键或化学修饰残基的经修饰的核苷酸碱基。核酸分子还包括适于在体外和/或体内，例如，在宿主或患者体内直接表达本公开的抗体的载体的DNA和RNA分子。这种DNA(例如，cDNA)或RNA(例如，mRNA)载体可为未修饰的或经修饰的。例如，mRNA可经过化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或编码分子的表达，从而将mRNA注入个体以产生体内抗体(参见例如Stadler等人，NatureMedicine 2017，在线公开于2017年6月12日：10.1038/nm.4356或EP 2101 823B1)。

“分离的”核酸是指已经与其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括通常包含核酸分子的细胞中所含的核酸分子，但是核酸分子存在于染色体外或与自然染色体位置不同的染色体位置。

“编码抗体的分离核酸”涉及编码抗体重链和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括在单个载体或单独载体中的这种核酸分子，且这种核酸分子存在于宿主细胞中的一个或多个位置。

如本文所用，术语“载体”是指能够繁殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入该宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。这种载体在本文中称为“表达载体”。

如本文所用，术语“抗原”和“免疫原”在本文中可互换使用，涉及在用其免疫的动物中诱导免疫应答(优选为抗体反应)的分子或物质。抗原可为蛋白质、肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其他天然存在或合成化合物。在某些实施例中，该抗原为蛋白质。在某些实施例中，抗原为膜蛋白或其片段。在某些实施例中，抗原为单程或多程膜蛋白或其片段。

如本文所用，术语“异源蛋白质”涉及通过将编码异源蛋白质的多核苷酸引入细胞而在细胞中表达的蛋白质。在某些实施例中，异源蛋白质不是细胞天然的。在某些实施例中，异源蛋白质是细胞天然的蛋白质，但由于将编码异源蛋白质的多核苷酸导入细胞而过度表达。

术语“膜结合抗原”和“膜抗原”在本文中可互换使用，涉及直接或间接与膜结合的抗原。

术语“膜结合蛋白”和“膜蛋白”在本文中可互换使用，涉及直接或间接与膜结合的蛋白。膜结合蛋白的非限制性实例包括整合蛋白、脂质锚定蛋白和外周蛋白。在某些实施例中，膜蛋白为跨膜蛋白，例如，单程或多程膜蛋白或其片段。在某些实施例中，膜蛋白不是跨膜蛋白而是具有跨膜蛋白的复合物(例如，辅因子)的一部分的蛋白。如本文实例中使用，缩写字“MP”涉及膜蛋白。

如本文所用，术语“跨膜抗原”涉及跨越膜至少一次的抗原。跨膜抗原的非限制性实例包括单程抗原(例如，跨膜一次的抗原)、脂质锚定蛋白或多程抗原，例如，跨膜至少两次的蛋白质。

如本文所用，术语“跨膜蛋白”涉及跨越膜至少一次的蛋白。跨膜抗原的非限制性实例包括单程蛋白(例如，跨膜一次的蛋白)、脂质锚定蛋白或多程蛋白，例如，跨膜至少两次的蛋白质。在某些实施例中，跨膜蛋白为单程或多程跨膜蛋白或其片段。在某些实施例中，跨膜蛋白是多程跨膜蛋白或其片段。

如本文所用，术语“免疫”涉及向动物施用一种或多种抗原以便在动物中产生抗体的一个或多个步骤。一般而言，免疫包含将一种或多种抗原注射至动物体内。免疫可包含一种或多种抗原的一次或多次施用。在某些实施例中，经由多个表达抗原的EV将抗原施用于动物。

如本文所用，术语“多克隆抗体”或“多克隆抗血清”涉及含有对一种(单价或特异性抗血清)或多种(多价抗血清)抗原具有特异性的抗体混合物的免疫血清，其可从经一种抗原或多抗原免疫动物的血液中制备。

如本文所用，术语“佐剂”涉及免疫应答的非特异性刺激剂。佐剂可为包含一种或两种以下组分的组合物的形式：(a)一种设计用于形成保护抗原免于快速分解代谢的沉积物的物质(例如，矿物油、明矾、氢氧化铝、脂质体或表面活性剂[例如，普朗尼克多元醇(pluronic polyol)])和(b)非特异性刺激免疫宿主动物的免疫应答的物质(例如，通过增加其中的淋巴因子水平)。用于增加淋巴因子水平的分子的非限制性实例包括脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或其脂质A部分、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、百日咳毒素、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和胞壁酰二肽(muramyl dipeptide，MDP)。佐剂的非限制性实例包括弗氏佐剂(Freund's adjuvant)(任选地包含灭活结核分枝杆菌(M.tuberculosis)以形成弗氏完全佐剂(FCA))、氢氧化铝佐剂、Ribi佐剂、Titermax佐剂、specol佐剂、铝盐佐剂和单磷酰基脂质A-合成海藻糖二霉菌酸酯(monophosphorylLipid A-synthetic trehalose dicorynomylcolate，MPL-TDM)。

如本文所用，“治疗”(及其语法变体，诸如“治疗”或“治疗”)是指试图改变待治疗个体的疾病自然进程的临床干预，并且可进行预防或在临床病理学的进程中执行。期望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状态、缓解或改善预后。在某些实施例中，本公开的抗体用于减缓疾病的发展或减慢疾病的进程。

术语“可变区(variable region)”或“可变结构域(variable domain)”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链(分别为VH和VL)的可变结构域通常具有类似的结构，且每个结构域均包含四个保守性框架区(FR)和三个高变区(CDR)。(参见，例如，Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页，2007年。)单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可使用VH或VL结构域从结合抗原的抗体中分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352:624-628(1991)。

如本文所用，术语“筛选”涉及将一种或多种单克隆抗体(例如，纯化的抗体和/或包含该抗体的杂交瘤培养上清液)进行一种或多种测定，以定性和/或定量测定抗体对于感兴趣的抗原结合的能力。

如本文所用，“标志物”涉及允许直接或间接检测组合物。标志物包括但不限于荧光组合物、显色标志物、电子致密标志物、化学发光标志物和放射性标志物。例如，但不限于，特定标记为绿色荧光蛋白(“GFP”)、mCherry、dtTomato或本技术领域已知的其他荧光蛋白(例如，Shaner等人，A Guide to Choosing Fluorescent Proteins,Nature Methods 2(12)905-909(2005年十二月，通过引用并入本文)，

如本文所用，“贴壁细胞”涉及需要附着到表面才能生长的细胞。

如本文所用，“非贴壁细胞”涉及在悬浮液中培养的细胞。在某些实施例中，非贴壁细胞是不需要附着到表面来生长的细胞。

II.制造EV的方法；

在一个方面，本公开涉及制造EV的改良方法。部分基于以下发现：通过采用某些纯化步骤、囊泡因子和/或产生EV的细胞系，可达成EV的快速且高产量的生成。

在某些非限制性实施例中，一种用于产生EV的方法包括：(a)在暴露于囊泡因子的细胞中表达感兴趣的蛋白质，例如，感兴趣的异源蛋白质；(b)在培养基中体外培养细胞以产生多个EV；以及(c)从培养基中分离多个EV。在某些实施例中，将细胞暴露于囊泡因子包含在细胞中表达囊泡因子。

在某些实施例中，在细胞中表达感兴趣的蛋白质包括将编码感兴趣的蛋白质的至少一种多核苷酸导入细胞中。例如，但不限于，一种产生EV的方法包括：(a)在暴露于囊泡因子的细胞中导入编码感兴趣的蛋白质(例如，感兴趣的异源蛋白质)的多核苷酸；(b)在培养基中体外培养细胞以产生多个EV；以及(c)从培养基中分离多个EV。在某些实施例中，可用多核苷酸转染细胞以在细胞中表达感兴趣的蛋白质。

在某些实施例中，将细胞暴露于囊泡因子可包括在细胞中表达囊泡因子，例如，在表达感兴趣的蛋白质的同一细胞中。例如，但不限于，可以将编码囊泡因子的多核苷酸导入细胞中。在某些实施例中，囊泡因子可由编码感兴趣的蛋白质的相同多核苷酸编码。可替代地，感兴趣的蛋白质和囊泡因子可由两种不同的多核苷酸编码。例如，但不限于，在暴露于囊泡因子的细胞中表达感兴趣的蛋白质包括将编码囊泡因子的第一多核苷酸和编码感兴趣的蛋白质的第二多核苷酸导入细胞。

在某些非限制性实施例中，一种用于产生EV的方法包括：(a)提供(i)编码囊泡因子和感兴趣的蛋白质的多核苷酸，和/或(ii)编码囊泡因子的第一多核苷酸和编码感兴趣的蛋白质的第二多核苷酸；(b)用多核苷酸，例如，多核苷酸或第一及第二多核苷酸转染细胞；(c)在培养基中体外培养细胞以产生多个EV；及(d)从培养基中分离多个EV。在某些实施例中，在单个核酸上提供第一多核苷酸和第二多核苷酸。示例性EV生成工作流程如图3所示。

在某些实施例中，将细胞暴露于囊泡因子可包括在不同于表达感兴趣的蛋白质的细胞的细胞中表达囊泡因子。例如，但不限于，产生EV的方法可包括在细胞(例如第一细胞)内表达感兴趣的蛋白质。在某些实施例中，可通过在细胞中导入编码感兴趣的蛋白质的多核苷酸来在细胞中表达感兴趣的蛋白质。在某些实施例中，该方法可进一步包括在不同的细胞(例如，第二细胞)内表达囊泡因子，该不同的细胞与表达感兴趣的蛋白质的细胞(例如，第一细胞)共培养。在某些实施例中，该方法包括将表达感兴趣的蛋白质的细胞(例如，第一细胞)暴露于由另一个细胞(例如，第二细胞)表达的囊泡因子，以产生展示感兴趣的蛋白质的EV。

在某些非限制性实施例中，用于产生EV的方法可包括在没有囊泡因子的情况下在细胞中表达感兴趣的蛋白质。在某些实施例中，该方法包括：(a)在细胞中表达感兴趣的异源蛋白质；(b)在培养基中体外培养细胞以产生多个EV；以及(c)从培养基中分离多个EV，其中细胞为非贴壁细胞。在某些非限制性实施例中，本公开的方法包括：(a)提供编码感兴趣的蛋白质的多核苷酸；(b)用该多核苷酸转染细胞；(c)在培养基中体外培养细胞以产生多个EV；及(d)从培养基中分离多个EV。

在某些实施例中，产生EV的方法可包括在细胞中表达形成蛋白质复合物的两种或多种蛋白质，例如，在细胞中表达形成复合物的两种或多种异源蛋白质。例如，但不限于，本公开的方法可包括在细胞中表现蛋白质复合物的两种或多种蛋白质，例如，蛋白质复合物的三种或更多种蛋白质、四种或更多种蛋白质、五种或更多种蛋白质、六种或更多种蛋白质、七种或更多种蛋白质、八种或更多种蛋白质或九种或更多种蛋白质。在某些实施例中，在细胞中表达的蛋白质复合物的一种或多种蛋白质可为跨膜蛋白质。在某些实施例中，在细胞中表达的蛋白质复合物的一种或多种蛋白质不是跨膜蛋白质。在某些实施例中，在细胞中表达的蛋白质复合物的一种或多种蛋白质可为外周膜蛋白，例如，与跨膜蛋白质相关的蛋白质。在某些实施例中，可通过导入编码蛋白质的多核苷酸或通过导入两种或多种编码蛋白质的多核苷酸，在细胞中表达两种或更多种蛋白质。在某些实施例中，该方法可进一步包括将细胞暴露于囊泡因子，例如，通过在细胞内表达囊泡因子，例如，以产生展示两种或多种蛋白质的复合物的EV。可替代地和/或另外地，感兴趣的蛋白质可在不存在囊泡因子的情况下，在产生大量EV的细胞(例如非贴壁细胞)中表达。

在某些实施例中，囊泡因子是可促进天然囊泡途径或直接诱导囊泡形成的候选蛋白质(图1)。非限制性示例性囊泡因子及其工作机制如表1所示。在某些实施例中，细胞可被遗传修饰以表达本文公开的一种或多种囊泡因子。在某些实施例中，囊泡因子选自MLGag、Acyl.Hrs、ARRDC1、RhoA(例如，RhoA.F30L)、ARF6(例如，ARF6.Q67L)及其组合所组成的组。在某些实施例中，囊泡因子选自MLGag、Acyl.Hrs、ARRDC1和ARF6(例如，ARF6.Q67L)及其组合所组成的组。在某些实施例中，囊泡因子选自由Acyl.Hrs、ARRDC1和ARF6(例如，ARF6.Q67L)及其组合所组成的组。

表1.囊泡因子及其作用机制。

在某些实施例中，囊泡因子为Gag蛋白，例如，嵌合Gag蛋白。HIV病毒Gag蛋白含有一种肽，该肽可将Tsg101/ESCRT复合物结合并补充到膜上以促进病毒出芽(Pornillos等人，“HIV Gag mimics the Tsg101-recruiting activity of the human Hrs protein,”JCell Biol.2003；162(3):425–434)。已显示将单独编码Gag的cDNA导入人类细胞以生成囊泡(参见，例如，Qiu等人，J.Virol.1999,73(11):9145-9152；及Megede等人，J.Virol.2000,74(6):2628-2635)。然而，野生型HIV Gag在非人细胞中不能有效出芽。已显示嵌合Gag蛋白可在人和鼠细胞中诱导EV产生(Hammarstedt等人，“Passive and active inclusion ofhost proteins in human immunodeficiency virus Type 1Gag particles duringbudding at the plasma membrane,”J Virol.2004；78(11):5686-97；Chen等人，“Efficient assembly of an HIV-1/MLV Gag-chimeric virus in murine cells,”ProcNatl Acad Sci U S A.2001；98(26):15239-44)。示例性嵌合Gag(MLGag)公开于Chen等人，“Efficient assembly of an HIV-1/MLV Gag-chimeric virus in murine cells,”ProcNatl Acad Sci U S A.2001；98(26):15239-44，其内容通过引用整体并入。在某些实施例中，嵌合Gag蛋白包含来自不同反转录病毒的一部分HIV Gag和一部分Gag。例如，但不限于，嵌合Gag包含HIV Gag，其中已知指导其定位的HIV Gag的区域以来自莫罗尼(Moloney)鼠白血病病毒(murine leukemia virus，MLV)，鼠反转录病毒的功能同源区取代。在某些实施例中，HIV Gag的取代区域为基质结构域(matrix domain，MA)，以生成本文中称为MLGag的嵌合Gag。在某些实施例中，嵌合和全长Gag蛋白可以从源自任何物种的内源性反转录病毒(endogenous retroviruse，ERV)序列产生，例如，如Stocking等人，Cell Mol.Life Sci.65(21):3383–3398(2008)中所述，其内容通过引用整体并入。在某些实施例中，囊泡因子为MLGag。

在某些实施例中，囊泡因子为含抑制蛋白结构域蛋白1(ARRDC1)。在某些实施例中，囊泡因子为鼠ARRDC1(mARRDC1)。在某些实施例中，囊泡因子为人ARRDC1(hARRDC1)。ARRDC1是辅助蛋白的四肽PSAP基序，且为诱导EV形成的宿主蛋白。已表明ARRDC1的过表达导致增强微泡(MV)的形成。该作用是通过PSAP/PTAP肽补充Tsg101介导的。ATPase VPS4a的过表达导致MV形成的进一步增强(Nabhan等人，“Formation and release of arrestindomain-containing protein 1-mediated microvesicles(ARMMs)at plasma membraneby recruitment of TSG101protein,”Proc Natl Acad Sci U S A.2012；109(11):4146-51)。

在某些实施例中，囊泡因子为ADP核糖基化因子-6(ARF6)。已显示ARF6为一种RhoGTP酶，它以ERK依赖性方式驱动肿瘤细胞中微泡的形成(Muralidharan-Chari等人，“ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles,”CurrBiol.2009；19(22):1875-85)。在某些实施例中，囊泡因子为ARF6的持续性活化形式。例如，但不限于，ARF6的持续性活化形式为ARF6.Q67L(参见例如，Peters等人，J.Cell Biol 128(6):1003-1017(1995)，通过引用将其全文并入本文)。

在某些实施例中，囊泡因子为突变的RhoA/ROCK1，其也可驱动肿瘤细胞中的微囊泡形成(Li等人，“RhoA triggers a specific signaling pathway that generatestransforming microvesicles in cancer cells,”Oncogene.2012；31(45):4740-9)。在某些实施例中，囊泡因子为RhoA的持续性活化形式。例如，但不限于，RhoA的持续性活化形式为RhoA.F30L(参见，例如，Lin等人，JBC 274(33):23633-23641(1999)，通过引用将其全文并入本文)。

在某些实施例中，囊泡因子包含原生质膜(plasma membrane，PM)结合结构域、自组装结构域和转运所需的胞内体分选复合物(endosomal sorting complex required fortransport，ESCRT)补充结构域(图2A)。EV形成的设计原则是能够快速产生新的EV因子/货(cargo)。已显示PM靶向和高阶低聚合驱动EV并入(Fang等人，“Higher-OrderOligomerization Targets Plasma Membrane Proteins and HIV Gag to Exosomes,”PLoS Biol.2007Jun；5(6):e158)。在某些实施例中，囊泡因子为Acyl.Hrs，其包含酰基化标签的PM结合结构域和肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物(Hrs)的C末端结构域，由卷曲螺旋的自组装结构域组成，以及ESCRT补充结构域(图2A)。在某些实施例中，囊泡因子为MLGag，其包含基质(Matrix)的PM结合结构域、壳体的自组装结构域和p6的ESCRT补充结构域(图2B)。在某些实施例中，囊泡因子包含自组装结构域和ESCRT补充结构域。在某些实施例中，囊泡因子为ARRDC1，其包含抑制蛋白结构域的自组装结构域和ESCRT补充结构域(图2B)。可通过本技术领域已知的任何方法鉴定另外的囊泡因子。例如，但不限于，可对所有蛋白质(例如，人蛋白质)的cDNA库进行筛选，以鉴定增加EV产生的单个基因或基因组合。可替代地或另外地，可进行CRISPR或RNAi筛选来鉴定抑制EV产生的单个基因或基因组合。

在某些实施例中，通过本公开的方法所产生的EV包含囊泡因子和/或感兴趣的蛋白质。例如，但不限于，囊泡因子被并入EV中，例如，存在于所产生的EV的内部。在某些实施例中，感兴趣的蛋白质展示在EV的表面上，例如，感兴趣的蛋白质为跨越膜一次或多次的蛋白质，或为与跨越膜的蛋白质相关的蛋白质。在某些实施例中，通过所公开的方法产生的EV包含囊泡因子，例如，MLGag、Acyl.Hrs、ARRDC1和/或ARF6，例如，ARF6.Q67L和感兴趣的蛋白质。例如，但不限于，通过本文公开的方法所产生的EV包含ARF6，例如，ARF6.Q67L，和感兴趣的蛋白质。在某些实施例中，通过本文公开的方法所产生的EV包含MLGag和感兴趣的蛋白质。在某些实施例中，通过本文公开的方法所产生的EV包含Acyl.Hrs和感兴趣的蛋白质。在某些实施例中，通过本文公开的方法所产生的EV包含ARRDC1和感兴趣的蛋白质。

在某些实施例中，囊泡因子为Acyl.Hrs、ARRDC1和ARF6中的一种或多种。在某些实施例中，使用Acyl.Hrs、ARRDC1和ARF6中的一种或多种是有利的，因为使用Gag作为囊泡因子与抗Gag抗体的产生相关。抗Gag抗体的产生可影响被免疫动物的免疫系统产生抗感兴趣的蛋白质的抗体的能力，此可能导致抗感兴趣的蛋白质的抗体效价降低。

如表2所示，Acyl.Hrs、ARRDC1和ARF6产生的EV数量与MLGag相似。表2中显示的结果令人惊讶，因为Gag已经在细胞表面出芽病毒的情况下形成，因此有望有效地产生EV，而其他囊泡因子，例如，Acyl.Hrs、ARRDC1和ARF6，在该情况下没有形成，仍然导致EV的高产量。

在某些实施例中，囊泡因子(例如，Acyl.Hrs、ARRDC1和/或ARF6)可来自用通过表达囊泡因子所产生的EV免疫的相同物种。使用来自同一物种的囊泡因子是有利的，该物种以经表达囊泡因子所产生的EV进行免疫，因为其可降低对囊泡因子而不是免疫动物中感兴趣的蛋白质的免疫应答的风险。例如，但不限于，如果要免疫小鼠以产生抗感兴趣的蛋白质的抗体，则囊泡因子(例如，Acyl.Hrs、ARRDC1和/或ARF6)可来自小鼠，例如，小鼠Acyl.Hrs、小鼠ARRDC1和/或小鼠ARF6。在某些实施例中，如果要免疫大鼠以产生抗感兴趣的蛋白质的抗体，则囊泡因子(例如，Acyl.Hrs、ARRDC1和/或ARF6)可来自大鼠，例如，大鼠Acyl.Hrs、大鼠ARRDC1和/或大鼠ARF6。在某些实施例中，如果要免疫兔以产生抗感兴趣的蛋白质的抗体，则囊泡因子(例如，Acyl.Hrs、ARRDC1和/或ARF6)可来自兔，例如，兔Acyl.Hrs、兔ARRDC1和/或兔ARF6。在某些实施例中，如果要免疫美洲驼以产生抗感兴趣的蛋白质的抗体，则囊泡因子(例如，Acyl.Hrs、ARRDC1和/或ARF6)可来自美洲驼，例如，美洲驼Acyl.Hrs、美洲驼ARRDC1和/或美洲驼ARF6。在某些实施例中，如果要免疫人以产生抗感兴趣的蛋白质的抗体，则囊泡因子(例如，Acyl.Hrs、ARRDC1和/或ARF6)可来自人，例如，人类Acyl.Hrs、人类ARRDC1和/或人类ARF6。

在某些实施例中，细胞被修饰以表达囊泡因子。例如，但不限于，将编码囊泡因子的多核苷酸导入细胞以表达囊泡因子。在某些实施例中，用编码囊泡因子的多核苷酸转染细胞以在细胞中表达囊泡因子。

在某些实施例中，细胞在适于表达囊泡因子的条件下培养。在某些实施例中，细胞在适于产生EV的条件下培养。例如，但不限于，细胞在细胞培养基中培养以表达囊泡因子和/或产生EV。

在某些实施例中，将表达囊泡因子的细胞孵育适当时间以产生EV。在某些实施例中，将表达囊泡因子的细胞孵育约12小时至约72小时以产生EV。在某些实施例中，将表现囊泡因子的细胞孵育约24小时至约64小时以产生EV。在某些实施例中，将表达囊泡因子的细胞孵育约48小时以产生EV。

在某些实施例中，通过孵育表达囊泡因子的细胞所产生的EV随后被纯化。在某些实施例中，EV是从细胞培养基纯化。在某些实施例中，EV的纯化需要约30分钟至约24小时完成。在某些实施例中，EV的纯化需要约30分钟至约12小时完成。在某些实施例中，EV的纯化需要约30分钟至约5小时完成。在某些实施例中，EV的纯化需要约30分钟至约4小时完成，例如，约1小时至约4小时完成。在某些实施例中，EV的纯化需要约3小时完成。在某些实施例中，使用超速离心从细胞培养基中分离EV。

在某些实施例中，本文所述使用囊泡因子产生EV的方法能够产生的纯化EV约0.5mg或更多，例如，0.5-1.0mg；约1.0mg或更多，例如，1.0-1.5mg；约1.5mg或更多，例如，1.5-2.0mg；约2.0mg或更多，例如，2.0-3.0mg；约2.5mg或更多，例如，2.5-3.0mg；约3.0mg或更多，例如，3.0-4.0mg；约3.5mg或更多，例如，3.5-4.0mg；约4.0mg或更多，例如，4.0-5.0mg；约4.5mg或更多，例如，4.5-5.0mg；约5.0mg或更多，例如，5.0-6.0mg；或约5.5mg或更多，例如，5.5-6.0mg。在某些实施例中，本文所述使用囊泡因子产生EV的方法能够产生约3.0mg或更多的纯化EV，例如，3.0-5.0mg。在某些实施例中，本文所述使用囊泡因子产生EV的方法能够在培养表达异源蛋白质的细胞的约24-72小时内产生上述量的EV。在某些实施例中，本文所述使用囊泡因子产生EV的方法能够在培养表现异源蛋白质的细胞的约24-48小时内产生上述量的EV。在某些实施例中，本文所述使用囊泡因子产生EV的方法能够在培养表现异源蛋白质的细胞的约48-72小时内产生上述量的EV。

在某些实施例中，用于本文所公开EV产生的方法中的细胞为哺乳动物细胞。在某些实施例中，细胞为人类细胞。在某些实施例中，细胞为遗传修饰的人类细胞。在某些实施例中，细胞为贴壁细胞。例如，但不限于，细胞可为贴壁生长的HEK293细胞。HEK293为一种源自组织培养中所生长的人胚胎肾细胞的细胞系。在某些实施例中，细胞为CHO细胞。例如，但不限于，细胞为ExpiCHO

在某些实施例中，本文所公开用于EV产生的方法中的细胞不是贴壁细胞。在某些实施例中，本文所公开用于EV产生的方法中的细胞为非贴壁细胞，例如，生长于悬浮液的细胞。在某些实施例中，非贴壁细胞为已适应悬浮培养的HEK293细胞。例如，但不限于，细胞为293S细胞，其为适应悬浮培养的HEK293细胞。在某些实施例中，细胞为Expi293F

对于EV产生，使用非贴壁细胞而不是贴壁细胞有很多好处。例如，使用非贴壁细胞简化了EV产生，因为与生长相同数量的贴壁细胞所需的大量组织培养板相比，在单个摇瓶中生长非贴壁细胞显然较为容易。与贴壁细胞相比，培养非贴壁细胞也更容易且成本更低，需要较少的耗材，且更容易从培养基中分离出来。此外，使用非贴壁细胞系，诸如Expi293F

在某些实施例中，非贴壁细胞被修饰以表达感兴趣的蛋白质。例如，但不限于，将编码感兴趣的蛋白质的多核苷酸导入非贴壁细胞以表达感兴趣的蛋白质。在某些实施例中，非贴壁细胞以编码感兴趣的蛋白质的多核苷酸转染，以在细胞中表达感兴趣的蛋白质。

在某些实施例中，非贴壁细胞在适于表达感兴趣的蛋白质的条件下培养。在某些实施例中，非贴壁细胞在适于EV产生的条件下培养。例如，但不限于，非贴壁细胞在细胞培养基中培养以表达感兴趣的蛋白质和/或产生EV。

在某些实施例中，将表达感兴趣的蛋白质的非贴壁细胞孵育适当时间以产生EV。在某些实施例中，将表达感兴趣的蛋白质的非贴壁细胞孵育约12小时至约72小时以产生EV。在某些实施例中，将表现感兴趣的蛋白质的非黏附细胞孵育约24小时至约64小时以产生EV。在某些实施例中，将表达感兴趣的蛋白质的非贴壁细胞孵育约48小时以产生EV。

在某些实施例中，通过孵育表达感兴趣的蛋白质的非贴壁细胞所产生的EV随后被纯化。在某些实施例中，EV是从细胞培养基纯化。在某些实施例中，EV的纯化需要约30分钟至约24小时完成。在某些实施例中，EV的纯化需要约30分钟至约12小时完成。在某些实施例中，EV的纯化需要约30分钟至约5小时完成。在某些实施例中，EV的纯化需要约30分钟至约4小时完成，例如，约1小时至约4小时完成。在某些实施例中，EV的纯化需要约3小时完成。在某些实施例中，使用超速离心从培养基中分离EV。

在某些实施例中，本文所述使用非贴壁细胞系产生EV的方法，例如，在没有囊泡因子的情况下，能够产生的纯化EV约0.1mg或更多，例如，0.1-1.0mg、0.1-2.0mg、0.1-3.0mg、0.1-4.0mg、0.1-5.0mg或0.1-6.0mg；约0.2mg或更多；约0.3mg或更多；约0.4mg或更多；约0.5mg或更多；约0.6mg或更多；约0.7mg或更多；约0.8mg或更多；约0.9mg或更多；约1.0mg或更多，例如，1.0-2.0mg、1.0-3.0mg、1.0-4.0mg、1.0-5.0mg或1.0-6.0mg；约1.1mg或更多；约1.2mg或更多；约1.3mg或更多；约1.4mg或更多；约1.5mg或更多；约1.6mg或更多；约1.7mg或更多；约1.8mg或更多；约1.9mg或更多；约2.0mg或更多，例如，2.0-3.0mg、2.0-4.0mg、2.0-5.0mg或2.0-6.0mg；约3.0mg或更多，例如，3.0-4.0mg、3.0-5.0mg或3.0-6.0mg；约4.0mg或更多，例如，4.0-5.0mg或4.0-6.0mg；或约5.0mg或更多，例如，5.0-6.0mg。在某些实施例中，本文所述使用非贴壁细胞系产生EV的方法能够产生的纯化EV约1.0mg或更多，例如，1.0-6.0mg。在某些实施例中，本文所述使用非贴壁细胞系产生EV的方法能够在培养表达异源蛋白质的非贴壁细胞约24-72小时内产生上述量的EV。在某些实施例中，本文所述使用非贴壁细胞产生EV的方法能够在培养表达异源蛋白质的非贴壁细胞的约24-48小时内产生上述量的EV。在某些实施例中，本文所述使用非黏附细胞产生EV的方法能够在培养表现异源蛋白质的非黏附细胞的约48-72小时内产生上述量的EV。

在某些实施例中，本文所公开的方法进一步包括从培养基中分离EV，例如，多个EV。在某些实施例中，使用超速离心从培养基中分离EV。在某些实施例中，使用PEG沉淀从培养基中分离EV。在某些实施例中，使用基于盐的沉淀从培养基中分离EV。例如，但不限于，一种产生EV的方法包括：(a)在暴露于囊泡因子的细胞中表达感兴趣的蛋白质，例如，通过在细胞中表达囊泡因子；(b)在培养基中体外培养细胞以产生多个EV；以及(c)通过超速离心、PEG沉淀和/或基于盐的沉淀从培养基中分离EV。在某些实施例中，用于产生EV的方法包括：(a)在暴露于囊泡因子的细胞中表达感兴趣的蛋白质，例如，通过在细胞中表达囊泡因子；(b)在培养基中体外培养细胞以产生多个EV；以及(c)通过超速离心从培养基中分离EV。

在某些实施例中，在分离EV之前将细胞培养至少12小时、至少24小时、至少36小时或至少48小时。在某些实施例中，在分离EV之前将细胞培养至少24小时。在某些实施例中，在分离EV之前将细胞培养至少48小时。例如，但不限于，一种产生EV的方法包括：(a)在暴露于囊泡因子的细胞中表达感兴趣的蛋白质，例如，通过在细胞中表达囊泡因子；(b)在培养基中体外培养细胞至少约24小时或至少约48小时以产生多个EV；以及(c)通过超速离心、PEG沉淀和/或基于盐的沉淀从培养基中分离EV。

在某些实施例中，感兴趣的蛋白质或膜结合抗原(例如，膜蛋白)并不与靶向多肽或肽的外泌体融合。在某些实施例中，感兴趣的蛋白质或膜结合抗原(例如，膜蛋白)并不与靶向多肽或肽的外泌体交联。

在某些实施例中，囊泡因子并不是Gag蛋白。在某些实施例中，囊泡因子并不是MLVGag蛋白。在某些实施例中，囊泡因子并不是未切割的Gag蛋白。在某些实施例中，囊泡因子并不是未修饰的Gag蛋白。在某些实施例中，囊泡因子并不是非嵌合Gag蛋白。

在某些实施例中，细胞培养物或细胞悬浮液不包含Gag蛋白。在使用非贴壁细胞的某些实施例中，在不存在囊泡因子的情况下培养细胞，例如，在不存在Gag蛋白的情况下。在某些实施例中，使用不包含表达囊泡因子的多核苷酸的非贴壁细胞。在某些实施例中，使用不包含表达Gag蛋白的多核苷酸的非贴壁细胞，例如293S细胞或Expi293细胞，无论该Gag蛋白为MLV Gag蛋白、未切割的Gag蛋白、非嵌合Gag蛋白或未修饰的Gag蛋白。

III.基于EV的ELISA测定法和试剂盒；

本公开还提供了基于EV的酶联免疫吸附测定(ELISA)。在某些实施例中，本公开的基于EV的ELISA测定法具有检测样品中抗体水平的优点，其中该抗体能够结合抗原的天然形式。在某些实施例中，本公开提供用于检测样品中的抗体的方法，其包括：(a)孵育样品与捕获试剂以将抗体与捕获试剂结合，其中捕获试剂包含多个表达抗原的EV，且抗体与抗原特异性结合；(b)通过将结合的抗体与可检测抗体接触来检测与捕获试剂结合的抗体，其中可检测抗体与抗体特异性结合。在某些实施例中，该方法进一步包括(c)测量在(b)中所检测到的抗体的量，其中使用标准曲线对该量进行定量。在某些实施例中，捕获试剂固定化于固相上。

在某些实施例中，抗原为膜蛋白或其片段。在某些实施例中，膜蛋白为单程膜蛋白。在某些实施例中，膜蛋白为脂质锚定蛋白。在某些实施例中，膜蛋白为多程膜蛋白。本技术领域已知的用于产生EV的任何适当方法都可与目前公开的测定一起使用。在某些实施例中，抗原呈现EV根据部分II中所公开的方法产生。例如，但不限于，用于本文所公开的基于EV的ELISA测定法的EV可包含囊泡因子(例如，MLGag、Acyl.Hrs、ARRDC1和/或ARF6，例如，ARF6.Q67L)和抗原。

在某些实施例中，本文所公开的捕获试剂在测定之前固定化于固相上。固定化可通过在测定程序之前不溶解捕获试剂、通过吸附到水不溶性基质或表面(美国专利号3,720,760)或非共价或共价偶合(例如，使用戊二醛或碳二亚胺交联，预先使用或不使用例如硝酸和还原剂活化支持物来完成，如美国专利号3,645,852或Rotmans等人，J.Immunol.Methods57:87-98(1983)中所述)。固定化可通过在测定程序之后不溶解捕获试剂来完成，例如，通过免疫沉淀。

用于固定化的固相可为任何惰性支持物或载剂，其基本上不溶于水且可用于免疫测定。惰性支持物可为例如，表面、颗粒、多孔基质等形式。支持物的非限制性实例包括小片、葡聚糖凝胶(Sephadex)、聚氯乙烯、塑料珠和测定盘(例如，96孔微量滴定板)或由聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等制成的试管，以及微粒材料，诸如滤纸、琼脂糖、交联葡聚糖和其他多糖。另外地，反应性非水溶性基质(诸如经溴化氰活化的碳水化合物)及美国专利号3,969,287；3,691,016；4,195,128；4,247,642；4,229,537和4,330,440中所述的反应性受质可与本公开一起用于捕获试剂固定化，其内容通过引用整体并入。在某些实施例中，固定化的捕获试剂涂布于微量滴定板上。在某些实施例中，固相为可用于一次分析几个样品的多孔微量滴定板。在某些实施例中，固相为96孔ELISA盘。

在某些实施例中，捕获试剂通过非共价或共价相互作用或所需的物理连接而连接至该固相上，以形成包被板。适合的连接技术包括在美国专利号4,376,110及其中所引用的参考文献所述的技术，其全部内容通过引用整体而并入。

在某些实施例中，将板或其他固相与交联剂和捕获试剂一起孵育，以将捕获试剂连接至固相。交联剂的非限制性实例包括例如，1,1-双(重氮乙酰基)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如具有4-叠氮水杨酸的酯类、同双官能酰亚氨酯，包括双琥珀酰亚胺酯，诸如3,3'-二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸酯)和双官能马来亚酰胺，诸如双-N-马来亚酰胺-1,8-辛烷。诸如3-[(对叠氮苯基)二硫代]丙亚胺酸酯的衍化剂产生能够在光存在下形成交联的光活化中间体。

在某些实施例中，然后以阻断剂处理包被板，该阻断剂与结合位点非特异性结合并使结合位点饱和，以防止游离配体与板孔上的过量位点发生不需要的结合。合适的阻断剂的非限制性实例包括明胶、牛血清白蛋白、卵清蛋白、酪蛋白和脱脂牛奶。

在某些实施例中，在将样品与经固定化的捕获试剂一起孵育后，将经固定化的捕获试剂与可检测抗体接触。在某些实施例中，可检测抗体为单克隆抗体。在某些实施例中，可检测抗体为多克隆抗体。在某些实施例中，可检测抗体为可直接检测的。在某些实施例中，可检测抗体包含荧光标志物或比色标志物。在某些实施例中，可检测抗体是生物素化的，且检测方法是生物素蛋白或链霉亲和素-β-半乳糖苷酶和MUG。

本公开还提供了用于进行目前公开的基于EV的ELISA测定法的试剂盒。在某些实施例中，用于检测样品中抗体水平的试剂盒，其包含：(a)含多个抗原呈现EV的捕获试剂，其中抗原与抗体特异性结合；及(b)与捕获的抗体结合的可检测抗体。

在某些实施例中，该试剂盒进一步包含用于捕获试剂的固体支持物。在某些实施例中，固体支持物以单独的元素提供。在某些实施例中，所提供的固体支持物已通过捕获试剂包被。因此，试剂盒中包含膜结合抗原的EV可已经固定化于固体支持物上，或者其可固定化于试剂盒中包含的或与试剂盒分开提供的支持物上。在某些实施例中，捕获试剂包被涂覆在微量滴定板上。在某些实施例中，可检测抗体为可直接检测的经标记抗体。在某些实施例中，可检测抗体为未标记抗体，其可通过针对在不同物种中产生的可检测抗体的经标记抗体进行检测。在某些实施例中，标志物为酶，且试剂盒进一步包含酶所需的底物和辅因子。在某些实施例中，标志物为荧光团，且试剂盒进一步包含提供可检测发色团的染料前体。在某些实施例中，可检测抗体是未标记的，且该试剂盒进一步包含用于可检测抗体的检测工具，例如针对未标记抗体的经标记抗体，优选地为荧光检测形式。

在某些实施例中，试剂盒进一步包含用于进行测定的说明书和/或抗体标准品(例如，纯化的抗体，优选地为重组产生的抗体)，以及其他添加剂，诸如稳定剂、洗涤和孵育缓冲剂等。

在某些实施例中，试剂盒的组分以预定比例提供，各种试剂的相对量适当变化以获得所需的测定灵敏度。在某些实施例中，试剂以干粉形式提供(例如，冻干的形式)。

IV.使用EV产生抗体的方法

在另一方面，本公开提供了用于抗体产生的方法。制造抗某些抗原(例如，膜结合抗原)的抗体可能具有挑战性，因为难以产生足够数量的正确折叠的抗原，部分可由这种抗原的细胞毒性、低表达产量、聚集和折叠不当引发。参见，例如，Katzen等人，TrendsBiotech.27(8):455-460(2009)。例如，由于聚集和二硫化物错误配对，富含二硫键(>2个二硫键)的蛋白质的表达可被限制(参见，例如，Saez等人，Meth.Mol.Biol.1586:155-180(2017)；Crook等人，Nat Comm.8:2244(2017)).此外，膜蛋白复合物(例如，同型二聚体、异二聚体和同型三聚体复合物)的表达可能具有挑战性，因为复合物中一种或多种蛋白质的跨膜结构域通常会稳定高阶复合物，且复合物的蛋白质之间的相互作用可为虚弱的。进一步地，这种膜蛋白复合物在洗涤剂中的溶解可很苛刻，会破坏天然复合物的相互作用或去除与脂质环境的关键相互作用(参见，例如，Birnbaum等人，PNAS111(49):17576-17581(2014)；Henrich等人，eLife 6:e20954(2017))。因此，已经测试了各种免疫方法来产生抗这种挑战性抗原的抗体，包括以编码这种抗原的DNA、表达这种抗原的细胞、大肠杆菌(E.Coli)产生的变性抗原或CHO细胞产生的Fc融合抗原来免疫小鼠。在某些实施例中，本公开的目标针对以包含膜结合抗原(例如，多程膜蛋白)的EV免疫动物，这可导致产生对挑战性抗原具有所需结合特性的抗体。

在某些非限制性实施例中，本公开提供用于免疫动物的方法，包括给动物施用包含膜结合抗原的多个EV以产生与抗原特异性结合的抗体。

在某些实施例中，抗原为膜蛋白或其片段。在某些实施例中，抗原为膜蛋白的片段。在某些实施例中，膜蛋白为单程膜蛋白、脂质锚定蛋白或多程膜蛋白。可与本文公开的方法一起使用的蛋白质类别的非限制性实例包括受体，例如，G-蛋白偶联受体(GPCR)、GPI-锚定蛋白、离子通道、多跨膜蛋白、富含二硫键的细胞外结构域(extracellular domain，ECD)、不稳定的ECD、多组分复合物(例如，同型二聚体蛋白质复合物、异二聚体蛋白质复合物、多蛋白质复合物等)。在某些实施例中，抗原可为与膜蛋白相关的蛋白质，例如，多蛋白质复合物的蛋白质部分。例如，但不限于，与膜蛋白相关的蛋白质可为辅因子。

在某些实施例中，膜蛋白为多程膜蛋白。例如，但不限于，膜蛋白跨越膜至少约两次、至少约三次、至少约四次、至少约五次、至少约六次、至少约七次、至少约八次、至少约九次、至少约十次、至少约十一次或至少约十二次。在某些实施例中，膜蛋白跨越膜至少七次，例如，GPCR。

在某些实施例中，膜蛋白具有细胞内结构域，其包含700个氨基酸或更少、650个氨基酸或更少、600个氨基酸或更少、550个氨基酸或更少、500个氨基酸或更少、450个氨基酸或更少、400个氨基酸或更少、350个氨基酸或更少、300个氨基酸或更少、250个氨基酸或更少、200个氨基酸或更少、150个氨基酸或更少、100个氨基酸或更少、95个氨基酸或更少、90个氨基酸或更少、85个氨基酸或更少、80个氨基酸或更少、75个氨基酸或更少、70个氨基酸或更少、65个氨基酸或更少、60个氨基酸或更少、55个氨基酸或更少、50个氨基酸或更少、45个氨基酸或更少、40个氨基酸或更少、35个氨基酸或更少、30个氨基酸或更少、25个氨基酸或更少、20个氨基酸或更少、15个氨基酸或更少、10个氨基酸或更少或5个氨基酸或更少。例如，但不限于，膜蛋白具有包含400个氨基酸或更少的细胞内结构域。在某些实施例中，若使用Gag(例如，MLGag)囊泡因子产生展现感兴趣的膜蛋白(例如，感兴趣的膜蛋白)的EV，则膜蛋白具有包含700个氨基酸或更少、600个氨基酸或更少、500个氨基酸或更少、400个氨基酸或更少、300个氨基酸或更少、200个氨基酸或更少或100个氨基酸或更少的细胞内结构域。在某些实施例中，若使用Gag(例如，MLGag)囊泡因子来产生展现感兴趣的膜蛋白(例如，感兴趣的膜蛋白)的EV，则膜蛋白具有包含200个氨基酸或更少的细胞内结构域。

在某些实施例中，膜蛋白为离子通道。在某些实施例中，离子通道为阳离子通道。例如，但不限于，膜蛋白为钾离子通道、钠离子通道或钙离子通道。在某些实施例中，离子通道为钠离子通道。

本技术领域已知的用于制造EV的方法可与本文所公开的方法一起使用。例如，但不限于，本技术领域已知的用于制造展现包含抗原的感兴趣的蛋白质的EV的方法可与本文所公开的抗体产生方法一起使用。在某些实施例中，使用本公开的部分II中所公开的方法产生EV。在某些实施例中，抗原位于EV的膜上，其中抗原的构像与其在细胞膜上的构像(例如，天然构像)基本上相似。

在某些非限制性实施例中，本公开提供产生抗感兴趣的蛋白质的抗体的方法。在某些实施例中，该方法包括通过向动物施用包含抗原(例如，感兴趣的蛋白质，例如，感兴趣的膜蛋白)的多个EV以产生与抗原特异性结合的抗体来免疫动物。

在某些实施例中，免疫动物包含将EV注射至动物体内。免疫可涉及向动物施用一次或多次EV。在某些实施例中，该方法包括向动物施用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多次EV。在某些实施例中，向动物施用约3至约6次EV。在某些实施例中，在第0周、第2周和第4周向动物施用EV。

在某些实施例中，动物的免疫可通过FACS监测以检测产生的靶特异性抗体的水平。如果检测到合适的效价(例如，通过在1:1000血清稀释度下检测FACS反应)，单克隆抗体的产生可如本文所述开始，例如，通过B细胞克隆或杂交瘤产生。

在某些实施例中，该方法进一步包括在施用EV后，从动物收集抗血清，其中抗血清包含由动物产生的抗体。

在某些实施例中，EV与佐剂一起施用于动物。佐剂的非限制性实例包括弗氏佐剂(任选地包含分枝杆菌或其组分以形成弗氏完全佐剂(FCA))、Ribi佐剂、Titermax佐剂、specol佐剂和铝盐佐剂。在某些实施例中，佐剂为Ribi佐剂。Ribi佐剂为水包油乳剂，其中抗原(例如，抗原呈现EV)与可代谢油(角鲨烯)混合，该可代谢油在含油酸聚醇山梨酯(Tween 80)的食盐溶液中乳化。在某些实施例中，Ribi佐剂还包含用作免疫刺激剂的精制分枝杆菌产物和革兰氏阴性细菌产物单磷酰脂质A。在某些实施例中，Ribi与免疫细胞的膜相互作用导致细胞因子诱导，从而增强抗原摄取、加工和呈递。在某些实施例中，产生抗感兴趣蛋白质的抗体的方法包括向动物施用展示感兴趣的蛋白质的多个EV与佐剂的组合。

在某些实施例中，该方法进一步包括向动物施用加强剂。例如，但不限于，产生抗感兴趣蛋白质的抗体的方法包括向动物施用展示感兴趣的蛋白质的多个EV与加强剂的组合。加强剂可增强动物的免疫应答，因此增加动物产生的抗体的数量和质量。在某些实施例中，加强剂包含编码抗原或抗原片段的多核苷酸。在某些实施例中，多核苷酸为DNA。在某些实施例中，加强剂包含多肽或蛋白质，该多肽或蛋白质包含抗原或其片段。在某些实施例中，加强剂与EV同时施用。在某些实施例中，在向动物施用EV后约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天，约13天，约14天，约15天，约16天，约17天，约18天，约19天，约20天，约21天，约22天，约23天、约24天、约25天、约26天、约27天、约28天、约29天和/或约30天，施用加强剂。在某些实施例中，在向动物施用第一剂量的EV后约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天，约13天，约14天，约15天，约16天，约17天，约18天，约19天，约20天，约21天，约22天，约23天、约24天、约25天、约26天、约27天、约28天、约29天和/或约30天，施用加强剂。例如，但不限于，在向动物施用EV(例如，第一剂量的EV)后约14天，施用加强剂。在某些实施例中，在向动物施用EV(例如，第一剂量的EV)后约21天，施用加强剂。在某些实施例中，EV可与佐剂和加强剂组合施用于动物。

本技术领域已知的用于免疫和抗体产生的任何动物都可与本文所公开的方法一起使用。可与本文所公开的方法一起使用的动物的非限制性实例包括诸如旧大陆猴(Old-World monkey)的非人类灵长类动物(例如，狒狒或猕猴，包括恒河猴(Rhesus monkey)和食蟹猴(cynomolgus monkey)，参见美国专利号5,658,570)、鸟类(例如，鸡)、兔、山羊、绵羊、牛、马、猪、驴、美洲驼、羊驼和犬。在某些实施例中，该动物为啮齿动物。“啮齿动物”属于胎盘哺乳动物的啮齿目动物。可用于本文的啮齿动物的非限制性实例包括小鼠、大鼠、豚鼠、松鼠、仓鼠和雪貂。在某些实施例中，用于免疫的动物为小鼠。

包含膜结合抗原的EV可递送至动物体的各种细胞，包括例如肌肉、皮肤、脑、肺、肝脏、脾脏，或递送至血液细胞。施用包含膜结合抗原的EV并不限于特定途径或位置。施用途径的非限制性实例包括肌肉内、皮内、表皮、耳廓内、口腔、阴道和鼻内。在某些实施例中，将包含膜结合抗原的EV经肌肉内、皮内或表皮施用动物。在某些实施例中，EV被递送至肌肉、皮肤或粘膜组织。

在某些实施例中，本文所公开的方法进一步包括由上述公开的免疫动物获得免疫细胞，其中该免疫细胞产生或能够产生多克隆抗体。然后可使用合适的融合剂(例如聚乙二醇或仙台病毒(Sendai virus))，将这种免疫细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Godmg,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice，第59-103页，学术出版社(Academic Press)，1986年)。可替代地或另外地，本文所公开的方法可包括通过B细胞培养克隆或免疫噬菌体库的产生来产生抗体。参见，例如，Bazan等人，Hum.Vaccin.Immunother.8(12):1817-1828(2012)；Carbonetti等人，J.Immunol.Methods448:66-73(2017)，其内容通过引用并入本文。

如此制备的杂交瘤细胞可接种并生长于合适的培养基中，该培养基优选含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤-鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase，HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨喋呤(aminopterin)和胸苷(thymidine)(HAT培养基)，这些物质会阻止HGPRT缺陷细胞的生长。骨髓瘤细胞系的非限制性实例为鼠骨髓瘤细胞系，诸如源自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些，以及P3X63AgU.1、SP-2或X63-Ag8-653细胞；大鼠骨髓瘤细胞系210-RCY3.Agl.2.3；及人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。

可替代地，杂交瘤细胞系可在其他方法中从经免疫的动物的免疫细胞制备，例如，通过以病毒(例如，以爱泼斯坦巴尔病毒(Epstein Barr Virus))或以致癌基因使免疫细胞永生化，以产生制造感兴趣的单克隆抗体的永生化细胞系。也可见于Babcock等人，PNAS(USA),93:7843-7848(1996)，关于通过从产生特异性抗体的单细胞克隆免疫球蛋白cDNA来产生单克隆抗体，此为使用经免疫动物的免疫细胞制备单克隆抗体的另一种策略。

在某些实施例中，本文所公开的方法进一步包含筛选步骤以鉴定能够结合每种抗原的一种或多种单克隆抗体。在某些实施例中，该方法进一步包含筛选与抗原结合的经免疫动物的抗体。在某些实施例中，可使用来自克隆的杂交瘤细胞的培养上清液和/或纯化的抗体进行筛选。例如，杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性例如可在免疫测定中确定。免疫测定的非限制性实例包括ELISA、放射免疫测定(RIA)和FACS测定。在某些实施例中，本文所公开的基于EV的ELISA可用于抗体筛选。

在某些实施例中，本文所公开的方法允许分选产生抗体的细胞。例如，在某些实施例中，产生抗体的细胞可与多个EV一起孵育，其中该多个EV包含：(1)第一EV群体，其包含膜结合抗原和第一可检测标志物，其中该产生抗体的细胞的亚群与该膜结合抗原特异性结合；以及(2)第二EV群体，其缺乏第一EV群体的膜结合抗原，但包含与第一标志物可区分开的第二可检测标志物。在某些实施例中，然后可基于产生抗体的细胞与含第一标志物的第一EV群体或与含第一标志物的第一EV群体和含第二标志物的第二EV群体的组合的结合来分选产生抗体的细胞。在某些实施例中，第一和第二可检测标志物为荧光标志物。在某些实施例中，第一和第二荧光标志物为荧光蛋白。在某些实施例中，该分选通过FACS进行。在某些实施例中，产生抗体的细胞为B细胞。在某些实施例中，产生抗体的细胞为杂交瘤细胞。

V.用于诊断和检测的方法和组合物

在某些实施例中，本文所公开的抗体，例如，通过本文所公开的方法产生的抗体，可用于检测生物样品中抗原的存在。如本文所用的术语“检测”，涵盖定量或定性检测。

在某些实施例中，提供用于诊断或检测方法的抗体，例如，使用本文所公开的方法产生的抗体。在另一方面，提供了一种检测生物样品中是否存在抗原的方法。在某些实施例中，该方法包括在允许抗体与其对应抗原结合的条件下，使生物样品与本文所述的抗体接触，并检测抗体与相关抗原之间是否形成复合物。这种方法可为体外或体内方法。在某些实施例中，使用抗体来选择适合使用抗体治疗的个体，例如，其中抗原为用于选择患者的生物标记。

在某些实施例中，提供经标记的抗体。标志物包括但不限于直接检测的标志物或部分(诸如荧光、发色、电子致密、化学发光和放射性标志物)，以及间接检测(例如，通过酶促反应或分子相互作用)的部分，例如酶或配体。示例性标记包括但不限于：放射性同位素

VI.药物组合物

在另一方面，本公开提供包含本文所公开的任何抗体的药物组合物，例如，用于以下任何治疗方法。例如，但不限于，使用本文所公开的方法产生抗体。在一个方面，药物组合物包含本文所提供的任何抗体和药用载体。在另一方面，药物组合物包含本文所提供的任何抗体和至少一种另外的治疗剂，例如，如下所述。

通过混合具有所需纯度的这种抗体与一种或多种任选地的药用载体，来制备如本文所述抗体的呈冻干组合物或水溶液形式的药物组合物(Remington's PharmaceuticalSciences，第16版，Osol,A.主编，1980年)。药用载体在采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，其包括但不限于：缓冲剂，诸如组氨酸、磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基芐基氯化铵；氯化六羟季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或芐醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂(诸如EDTA)；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中示例性药用载体进一步包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人类可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(

示例性冻干抗体组合描述于美国专利号6,267,958。水溶性抗体组合物包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，后者所述的组合物包括组氨酸-醋酸盐缓冲剂。

本文所述的药物组合物还可包含适于所治疗的特定适应症的多于一种活性成分，优选为相互无不利影响的具有互补活性成分的那些。这些活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。

活性成分可包载在例如通过凝聚技术或通过接口聚合制备的微胶囊(例如，分别为羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中、胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中或粗滴乳液中。这种技术公开于Remington'sPharmaceutical Sciences(第16版，Osol,A.主编，1980年)。

可制备用于缓释的药物组合物。缓释制剂的合适的实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是成形物品的形式，例如膜或微胶囊。

用于体内的施用药物组合物通常为无菌的。无菌性可易于例如通过无菌滤膜过滤来达成。

VII.治疗方法及施用途径；

本文提供的任何抗体均可用于治疗方法中。例如，但不限于，本公开提供通过本公开的方法所产生的用于治疗方法的抗体。

在一个方面，提供本文所公开的用为药物的抗体，例如，通过本公开的方法所产生的抗体。在其他方面，提供用于治疗疾病的本文所公开的抗体，例如，通过本公开的方法所产生的抗体。在某些实施例中，提供用于治疗方法中的本文所公开的抗体。

在某些实施例中，本公开提供本文所公开的抗体(例如，通过本公开的方法所产生的抗体)用于治疗患有疾病的受试者的方法。在某些实施例中，该方法包括向受试者施用有效量的本文所公开的抗体。在某些实施例中，该方法进一步包含将有效量的至少一种另外的治疗剂(例如，一种、两种、三种、四种、五种或六种另外的治疗剂)施用于该受试者。

在另一方面，本公开提供本文所公开的抗体(例如，通过本公开的方法所产生的抗体)在制造或制备药物上的用途。在某些实施例中，该药物用于治疗疾病。在某些实施例中，该药物用于治疗疾病的方法中，该方法包括向患有疾病的受试者施用有效量的药物。在某些实施例中，该方法进一步包括将有效量的至少一种另外的治疗剂施用于受试者。

在另一方面，本公开提供了一种治疗疾病的方法。在某些实施例中，该方法包括向患有此类疾病的受试者施用有效量的本文所公开的抗体。在某些实施例中，该方法进一步包括将有效量的至少一种另外的治疗剂施用于受试者。

根据上述任一实施例的“受试者”可以是人。

在另一方面，本公开提供包含本文所提供的任何抗体的药物组合物，例如，用于以上任何的治疗方法。在某些实施例中，药物组合物包含本文所提供的任何抗体和药用载体。在某些实施例中，药物组合物包含本文所提供的任何抗体及至少一种另外的治疗剂，例如，如下所述。

本公开的抗体可单独或与其他药剂组合用于治疗。例如，本公开的抗体可与至少一种另外的治疗剂共同施用。

上述提及的该组合疗法涵盖组合施用(其中两种或多种治疗剂包含在同一或单独的药物组合物中)，以及分开施用，在这种情况下，本公开的抗体的施用可在施用另外的一种或多种另外的治疗剂之前、同时和/或之后发生。在某些实施例中，施用本公开的抗体与施用另外的治疗剂彼此发生在约一个月内，或发生在约一周、两周或三周内，或发生在约一天、两天、三天、四天、五天、或六天内。在某些实施例中，在治疗的第1天将本公开的抗体及另外的治疗剂施用于患者。本公开的抗体也可与放射疗法组合使用。

本公开的抗体(及任何另外的治疗剂)可通过任何适当方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内施用，且若需要局部治疗，则可采用病灶内施用。肠胃道外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。可通过任何适当途径给药，例如，通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于短暂施用还是长期施用。本文中考虑各种给药方案，其包括但不限于在多种时间点单次或多次施用、快速注射施用和脉冲输注。

本公开的抗体将按照与良好医学实践一致的方式进行调配、给药及施用。这种情况下考虑的因素包括待治疗的具体障碍、待治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床病症、疾病的原因、递送药物的部位、施用方法、施用日程及医疗从业者已知的其他因素。该抗体并非必须、但可以任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所述疾病的药剂一起配制。这些其他药物的有效量取决于药物组合物中存在的抗体的量、疾病或治疗的类型以及上文讨论的其他因素。这些药物通常以与本文中所述相同的剂量和施用途径，或本文中所述剂量的约1％至99％，或以经验上/临床上确定为合适的任意剂量和通过任意途径使用。

对于疾病的预防或治疗，本公开的抗体的适当剂量(单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和病程、为了预防或是治疗目的施用该抗体、之前的治疗、患者的临床病史及对该抗体的反应及主治医师的判断。在一次或一系列的治疗中适当地向患者施用抗体。根据疾病的类型和严重程度不同，约1μg/kg至15mg/kg(例如，0.1mg/kg至10mg/kg)的抗体可为例如通过一次或多次分开施用或通过连续输注来向患者施用的初始候选剂量。根据上述因素，一种典型的日剂量可在约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围内。对于在几天或更长时间内重复施用，根据病情，治疗通常将持续直至出现所需的疾病症状抑制。抗体的一种示例性剂量将在从0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任意组合)的一种或多种剂量。这种剂量可间歇施用，例如每周或每三周施用(例如，使得患者接受约2个至约20个，或例如，约6个剂量的抗体)。可施用初始较高的负荷剂量，然后施用一个或多个较低的剂量。示例性的给药方案包括施用。然而，可使用其他给药方案。通过常规技术和测定很容易监测此治疗的进展。

VIII.制品

在本公开的另一方面，提供包含用于治疗、预防和/或诊断上述疾病的制品。制成品包括容器及容器上或与容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如，瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。该等容器可由多种材料形成，例如，玻璃或塑料。该容器可容纳一种组合物，该组合物本身或与有效治疗、预防和/或诊断症状的另一组合物结合使用，并可具有无菌入口(例如，容器可为具有可通过皮下注射针头穿孔的塞子的静脉内溶液袋或小管)。

组合物中的至少一种活性剂为本公开的抗体，例如，通过本公开的方法所产生的抗体。标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的疾病。此外，该制品可包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中该组合物包含本公开的抗体，例如，通过本公开的方法所产生的抗体；及(b)其中含有组合物的第二容器，其中该组合物包含其他细胞毒性剂或其他治疗剂。本公开的此实施例中的制品可进一步包含指示组合物可以用于治疗特定症状的包装插页。可替代地或另外地，制品可进一步包含第二(或第三)容器，该容器包含药用缓冲剂，例如抑菌注射用水(bacteriostatic water for injection，BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和葡萄糖溶液。从商业和使用者的角度来看，可进一步包含其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。

IX.示例性实施例。

A.在某些非限制性实施例中，目前公开的目标提供一种产生与蛋白质特异性结合的抗体的方法，其中该方法包括：

(a)产生包含异源蛋白质的多个细胞外囊泡(EV)，该产生是通过(i)在暴露于囊泡因子的细胞中表达该异源蛋白质，(ii)在培养基中培养该细胞，并(iii)从该培养基中分离包含异源蛋白质的该多个EV，其中该囊泡因子选自由Acyl.Hrs、ARRDC1、ARF6及其组合所组成的组；

(b)通过向动物施用该多个EV来免疫该动物；以及

(c)从动物中分离与蛋白质结合的抗体。

A1.如前述A的方法，其中该细胞为非贴壁细胞。

A2.如前述A和A1的方法，其中在细胞中表达该囊泡因子和该蛋白质包括在该细胞中导入一种或多种编码该囊泡因子及该蛋白质的多核苷酸。

A3.如前述A2的方法，其中该囊泡因子和该蛋白质由单个多核苷酸编码。

A4.如前述A2的方法，其中该囊泡因子由第一多核苷酸编码且蛋白质由第二多核苷酸编码。

B.在某些非限制性实施例中，目前公开的目标提供一种产生与蛋白质特异性结合的抗体的方法，其中该方法包括：(a)产生包含异源蛋白质的多个细胞外囊泡(EV)，该产生是通过(i)在细胞中表现该异源蛋白质，(ii)在培养基中培养该细胞，并(iii)从该培养基中分离包含异源蛋白质的该多个EV，其中该细胞为非贴壁细胞；(b)通过向动物施用该多个EV来免疫该动物；以及(c)从该动物中分离与该异源蛋白质结合的抗体。

B1.如前述B的方法，其中产生该多个EV进一步包含在该细胞中表达异源囊泡因子。

B2.如前述B1的方法，其中该囊泡因子选自由MLGag、Acyl.Hrs、ARRDC1、ARF6及其组合所组成的组。

B3.如前述A-B2的方法，其中该异源蛋白质为膜蛋白。

B4.如前述B3的方法，其中该膜蛋白为单程膜蛋白。

B5.如前述B3的方法，其中该膜蛋白为多程膜蛋白。

B6.如前述B3的方法，其中该膜蛋白为蛋白质复合物的成员。

B7.如前述B3的方法，其中该膜蛋白并不是跨膜蛋白而是蛋白质复合物的成员。

B8.如前述A1-B7的方法，其中该非贴壁细胞为293S细胞或Expi293F

B9.如前述A-B8的方法，其中通过超速离心从该培养基中分离该EV。

B10.如前述A-B9的方法，其中在第0周、第2周和第4周向该动物施用该多个EV。

B11.如前述A-B10的方法，其进一步包括将佐剂与该EV同时施用至该动物。

B12.如前述B11的方法，其中该佐剂为Ribi佐剂。

B13.如前述A-B12的方法，其进一步包括向该动物施用加强剂以增强该动物对该蛋白质的免疫应答。

B14.如前述B13的方法，其中该加强剂包含该蛋白质、编码该蛋白质的多核苷酸或其组合。

B15.如前述B14的方法，其中该加强剂包含该蛋白质。

B16.如前述B14的方法，其中该加强剂包含编码该蛋白质的多核苷酸。

B17.如前述A-B16的方法，其中该抗体为单克隆抗体。

B18.如前述A-B17的方法，其中该抗体为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

C.在某些非限制性实施例中，目前公开的目标提供通过A-B18中任一种的方法所产生的分离抗体或其抗原结合部分。

D.在某些非限制性实施例中，目前公开的目标提供编码C的抗体或其抗原结合部分的分离核酸。

E.在某些非限制性实施例中，目前公开的目标提供包含D的核酸的宿主细胞。

F.在某些非限制性实施例中，目前公开的目标提供产生抗体或其抗原结合部分的方法，其中该方法包括在适合表达抗体的条件下培养E的宿主细胞。

F1.如前述F的方法，其进一步包括从该宿主细胞回收该抗体。

G.在某些非限制性实施例中，目前公开的目标提供了一种药物组合物，其包含C的分离抗体或其抗原结合部分及药用载体。

G1.如前述G的药物组合物，其进一步包含另外的治疗剂。

H.用为药物的前述C的分离抗体或其抗原结合部分。

I.用于治疗疾病的前述C的分离抗体或其抗原结合部分。

J.在某些非限制性实施例中，目前公开的目标提供C的分离抗体或其抗原结合部分在药物制造上的用途。

K.在某些非限制性实施例中，目前公开的目标提供治疗患有疾病的受试者的方法，其中该方法包括向该受试者施用有效量的C的分离抗体或其抗原结合部分。

K1.如前述K的方法，其进一步包括向该受试者施用另外的治疗剂。

L.在某些非限制性实施例中，目前公开的目标提供治疗患有疾病的受试者的方法，包括向该受试者施用G或G1的药物组合物。

M.在某些非限制性实施例中，目前公开的目标提供了一种用于检测样品中的抗体的方法，其中该方法包括：

(a)用捕获试剂孵育样品，其中该捕获试剂包括包含膜结合抗原的多个EV，且该抗体与该膜结合抗原特异性结合；以及

(b)将与该捕获试剂结合的该抗体与可检测抗体接触以检测经结合的抗体，其中该可检测抗体与该抗体特异性结合，

其中通过以下产生该多个EV：(i)在细胞中表达该膜结合抗原，(ii)在培养基中体外培养该细胞以产生该展示膜结合抗原的多个EV，并(iii)从该培养基中分离该展示膜结合抗原的多个EV，且

其中将该细胞暴露于选自由Acyl.Hrs、ARRDC1、ARF6及其组合所组成的组的囊泡因子，和/或该细胞为非贴壁细胞。

M1.如前述M的方法，其进一步包括(c)测量在(b)中所检测到的该抗体的量，其中使用标准曲线对该量进行定量。

M2.如前述M或M1的方法，其中该样品为血浆、血清或尿液样品。

M3.如前述M-M2的方法，其中该捕获试剂固定化于固体支持物上。

M4.如前述M3的方法，其中该固体支持物为微量滴定板。

M5.如前述M-M4的方法，其中该可检测抗体是经荧光标记的。

M6.如前述M-M5的方法，其中该膜结合抗原为膜蛋白或其片段。

N.在某些非限制性实施例中，目前公开的目标提供了一种分选产生抗体的细胞的方法，其中该方法包括：

(a)将该产生抗体的细胞与多个EV一起孵育，其中该多个EV包含：第一EV群体，其包含膜结合抗原和第一可检测标志物，其中该产生抗体的细胞的子组与该膜结合抗原特异性结合；以及ii.第二EV群体，其缺乏该膜结合抗原但包含与该第一标志物可区分开的第二可检测标志物；及

(b)基于该产生抗体的细胞是与该第一EV群体结合还是与该第一EV群体和该第二EV群体的组合结合来分选该产生抗体的细胞，

其中通过以下产生该第一EV群体：(i)在第一细胞中表达该膜结合抗原和该第一可检测标志物，(ii)在培养基中体外培养该第一细胞以产生该展示膜结合抗原的多个EV，并(iii)从该培养基中分离该展示膜结合抗原的多个EV，

其中通过以下产生该第二EV群体：(i)在第二细胞中表达该第二可检测标志物，(ii)在培养基中体外培养该第二细胞以产生包含第二可检测标志物的该多个EV，并(iii)从该培养基中分离该多个展现第二可检测标志物的EV，且

其中(i)将第一细胞和/或第二细胞与选自由Acyl.Hrs、ARRDC1、ARF6及其组合所组成的组的囊泡因子接触，且/或(ii)该第一和/或第二细胞为非贴壁细胞。

N1.如前述N的方法，其中该第一可检测标志物和该第二可检测标志物为荧光标志物。

N2.如前述N1的方法，其中该第一荧光标志物和该第二荧光标志物为荧光蛋白。

N3.如前述N-N2的方法，其中通过荧光活化细胞分选来执行该分选。

N4.如前述N-N3的方法，其中该产生抗体的细胞为B细胞。

N5.如前述N-N4的方法，其中该产生抗体的细胞为杂交瘤细胞。

O.在某些非限制性实施例中，目前公开的目标提供了一种用于产生多个展现异源蛋白质的细胞外囊泡(EV)的方法，其中该方法包括：

(a)在细胞中表达异源蛋白质；

(b)在培养基中培养该细胞；以及

(c)从该培养基中分离包含异源蛋白质的该多个EV，

其中将细胞暴露于选自由Acyl.Hrs、ARRDC1、ARF6及其组合所组成的组的囊泡因子和/或该细胞为非贴壁细胞。

O1.如前述O的方法，其中该异源蛋白质为膜蛋白。

O2.如前述O1的方法，其中该膜蛋白为单程膜蛋白。

O3.如前述O1的方法，其中该膜蛋白为多程膜蛋白。

O4.如前述O1-O3的方法，其中该膜蛋白为蛋白质复合物的成员。

O5.如前述M-O4的方法，其中该非贴壁细胞为293S细胞或Expi293F

O6.如前述M-O5的方法，其中通过超速离心从该培养基中分离该多个EV。

P.在某些非限制性实施例中，目前公开的目标提供了一种用于检测样品中的抗体的试剂盒，其中该试剂盒包含：

(a)捕获试剂，其包括包含膜结合抗原的多个EV，其中待测的该抗体与该抗原特异性结合；及

(b)可检测抗体，其与待测的抗体特异性结合，

其中通过以下产生该多个EV：(i)在细胞中表达该膜结合抗原，(ii)在培养基中体外培养该细胞以产生该展示膜结合抗原的多个EV，并(iii)从该培养基中分离该展示膜结合抗原的多个EV，且

其中将该细胞暴露于选自由Acyl.Hrs、ARRDC1、ARF6及其组合所组成的组的囊泡因子，和/或该细胞为非贴壁细胞。

P1.如前述P的试剂盒，其中将该多个EV固定化于固体支持物上。

P2.如前述P或P1的试剂盒，其中该固体支持物为微量滴定板。

P3.如前述P-P2的试剂盒，其中该可检测抗体是经荧光标记的。

P4.如前述P-P3的试剂盒，其中该膜结合抗原为膜蛋白或其片段。

通过参考以下实例将更好地理解目前公开的主题，这些实例是作为目前公开的主题的例示而不是作为限制而提供的。

实例1：以MP-X鉴定产生囊泡的囊泡因子

以靶蛋白人G蛋白偶联受体(膜蛋白(MP)-X)和选自hARRDC1、Acyl-Hrs、ARF6.Q67L、RhoA.F30L、持续性活化ROCK、MemPro和MLGag的囊泡因子共转染293T细胞。EV的产生如图3所示。收集细胞裂解物用于测试靶蛋白和囊泡因子的表达。收集和处理培养基。通过超速离心从培养基中收集EV。使用抗FLAG抗体(1:1000稀释M2 Sigma F3165)经蛋白质印迹分析纯化的EV。

如图4所示，MP-X在由囊泡因子hARRDC1、Acyl.Hrs、ARF6.Q67L或MLGag转染的细胞所产生的EV中表达，但在由囊泡因子RhoA.F30L、持续性活化ROCK和MemPro转染的细胞所产生的EV中不表达。此外，动态光散射(DLS)显示由hARRDC1、Acyl.Hrs或MLGag转染的细胞所产生的EV具有均匀的囊泡大小(图5)。

接下来，用鼠细胞测试这些囊泡因子在诱导EV方面的有效性。以MP-X和选自MLGag、Acyl.Hrs和mARRDC1的囊泡因子共转染小鼠结肠癌细胞MC38和小鼠成肌细胞C2C12，以产生EV。通过超速离心机从培养基中纯化EV后，通过蛋白质印迹(抗FLAG初级抗体，1:1000稀释M2Sigma F3165)分析EV，以检测MP-X的存在。图6显示MP-X含量在由囊泡因子MLGag、Acyl.Hrs或mARRDC1转染的细胞所产生的EV中较高。在由未转染囊泡因子的细胞产生的EV中未检测到MP-X。

实例2：改良方法以实现高产量的快速EV产生

EV产生的一项挑战是有效地从培养基中纯化EV(图7A)。PEG沉淀法回收率很差，没有明显的沉淀物产生，且需要过夜的步骤。基于盐的沉淀只需要一个小时，但产生不溶性颗粒。本研究发现，超速离心纯化在所有三种方法中的纯化效率最高，且仅需要3小时。

EV产生的另一挑战是选择具有足够产量的细胞系。在比较多种细胞系的产量后，本研究发现Expi293F

本研究还比较了Expi293F

Expi293F

另外地，使用ELISA测量EV中每种靶蛋白的存在。图9A至图9C显示，来自Expi293F

本研究还测试了大鼠RBA细胞是否可用于EV产生。RBA细胞系是来源于SD大鼠的乳腺腺癌细胞系。发现RBA细胞可产生EV，但与293S细胞系相比，产量非常低(图13)。

实例3：EV实现基于ELISA的抗复合物膜蛋白的FACS+抗体检测

本研究发现，囊泡因子MLGag、Acyl.Hrs、ARRDC1和ARF6有助于使用Expi293F

实例4：鉴定用于筛选来自Expi293F

本研究筛选了兔、美洲驼/骆驼、大鼠和小鼠细胞系的转染效率及其与EV免疫的大鼠或小鼠抗血清的结合能力。SD大鼠、兔、美洲驼和小鼠在第0周、第2周和第4周以Expi293F

实例5：开发抗具有EV抗原的挑战性膜蛋白的功能性单克隆抗体

以囊泡因子MLGag和膜蛋白-1(MP-1，一种多程膜蛋白)构建体共转染Expi293F

也以囊泡因子MLGag或ARF6和膜蛋白2(MP-2，一种不具有包含超过110个氨基酸的细胞内结构域的多程膜蛋白)构建体共转染Expi293F

也以囊泡因子MLGag或ARF6和膜蛋白3(MP-3，一种具有包含超过700个氨基酸的细胞内结构域的多程膜蛋白)构建体共转染Expi293F

实例6：基于EV的ELISA筛选抗天然形式抗原的初级抗体

本研究比较了使用基于EV的ELISA和基于细胞的FACS来筛选抗天然形式的膜蛋白的初级抗体的方法。蛋白质ELISA、基于EV的ELISA和FACS的工作机制显示于图18。

两种膜蛋白MP-4和MP-5用作本研究的结合抗原。MP-4为单程膜蛋白，而MP-5为多程膜蛋白。

抗MP-4杂交瘤是使用蛋白质免疫由以MP-4免疫的小鼠所产生的。使用基于EV的ELISA的MLGag产生包含膜结合MP-4的EV。图19A至图19D显示，基于EV的ELISA效价与针对MP-4的FACS效价具有很好的相关性，且基于EV的ELISA的结果与FACS的结果一致。相较之下，基于蛋白质的ELISA与基于EV的ELISA或FACS之间的相关性非常差。

抗MP-5血清和杂交瘤是使用DNA免疫法从以MP-5免疫的小鼠所产生的。类似地，基于EV的ELISA与FACS具有良好的相关性(图20A至图20B、图21)。

因此，本研究显示，EV能够基于ELISA检测抗复合物膜蛋白的抗体，且基于EV的ELISA可用于筛选抗天然形式抗原的初级抗体。

实例7：使用抗原表达EV来发现抗挑战性抗原MP-6的单克隆抗体。

MP-6是用于多种癌症的高价值抗体-药物缀合物(antibody-drug-conjugate，ADC)靶标，且为开发抗MP-6抗体的具有挑战性的靶标。包含膜结合MP-6的EV通过以MLGag、Acyl.Hrs、ARF6或ARRDC1和MP-6构建体的囊泡因子共转染293S细胞所产生的。通过超速离心分离EV。EV的产量显示于表2。MP-6的相对水平以蛋白质印迹测量。

表2.以每种囊泡因子转染细胞中EV的产量

对初始批次MP-6EV的分析显示在分离的EV中表达MP-6(图22A)。另外地，蛋白质印迹分析证实每个囊泡因子也被并入囊泡中(图22B)。将使用重组蛋白标准品的定量蛋白质印迹用于测量并入囊泡中的MP-6的绝对量(图22C)。

SD大鼠用产生的EV以及DNA或蛋白质加强剂免疫。用于免疫的EV在PBS或Ribi(佐剂)中制备。免疫方案显示于图23。在DNA或蛋白质加强剂之前或之后从大鼠收集抗血清。从收集的抗血清中纯化抗体，最终浓度为250、50、10或2μg/ml。通过FACS或蛋白质印迹测量纯化的抗体中抗MP-6抗体的水平。使用Lipofectamine 3000(Lipofectamine：DNA＝3：1)，以或不以MP-6表达构建体转染RBA细胞2天。这些RBA细胞用于FACS分析。

蛋白质印迹显示，在DNA或蛋白质加强剂后，从大鼠收集的抗血清中抗MP-6抗体和抗Gag抗体的含量(图24A)。发现在DNA或蛋白质加强剂后，从大鼠收集的抗血清与RBA细胞没有显著结合(图24B)。本研究还使用基于RBA的FACS测量收集的抗血清中的抗体水平。FACS结果与蛋白质印迹资料具有很好的相关性(图24C和图24D)。因此，其表明免疫的初级抗体不显示与RBA细胞的背景结合，且天然SD大鼠的IgG不与以MP-6转染的RBA结合。只有从以表达MP-6的EV免疫的大鼠所收集的抗体显示出与以MP-6转染的RBA结合。因此，基于RBA的FACS可用于筛选经EV免疫大鼠所产生的MP-6抗体。

本研究发现，是DNA加强剂而不是蛋白质加强剂增加了以表达EV的MP-6免疫的大鼠的抗MP-6抗体效价(图24A至图24D、图26)。另外地，在免疫过程中并入佐剂(Ribi)也增加抗MP-6抗体的效价(图24A至图24D、图25A至图25B)。

该研究显示，Ribi作为佐剂增加了抗体效价，且Acyl.Hrs EV产生的抗体反应弱于MLGag EV(图25A)。图25B显示血清适于以FACS检测抗体效价，而不需要纯化IgG。

实例8：使用抗原表达EV来发现抗MP-7的单克隆抗体。

本研究使用实例7中开发的免疫方法来发现并产生抗膜蛋白MP-7(一种多程膜蛋白)的单克隆抗体。由以包含MP-7的EV免疫的剔除小鼠产生小鼠抗MP-7初级抗体，并通过FACS筛选。抗MP-7杂交瘤选自小鼠，其中抗血清在FACS中显示出与MP-7表达细胞的显著结合(图27A至图27C)。通过FACS进一步筛选杂交瘤以选择抗MP-7抗体殖株，该克隆在COS7稳定细胞和内源性细胞中显示出与MP-7的强结合(图28至图30)。

实例9：使用包含抗原的EV用于发现抗MP-1的单克隆抗体。

本研究使用实施例7中开发的免疫方法来产生抗膜蛋白MP-1的单克隆抗体。以包含膜结合MP-1或MP-1DNA的EV免疫大鼠，以蛋白质或DNA加强剂。产生另外的EV，其中MP-1与来自破伤风类毒素(MP-8TCE4)的通用T细胞表位的4次重复融合(Demotz等人，J Immunol1989；142)。通过表达MLGag作为囊泡因子来产生EV。

从大鼠收集的抗血清通过FACS筛选(图31A至图31B)。显示DNA加强剂总体上比蛋白质加强剂在增加抗体效价上较为有效，且T细胞表位的添加并无效果。蛋白质加强剂增加了DNA免疫的大鼠的FACS效价，表明蛋白质加强剂与细胞表面MP-1之间的表位有一些重叠。通过FACS筛选大鼠抗MP-1杂交瘤(图32)。以具有Lipofectamine 3000的MP-1DNA转染RBA细胞1天，然后以大鼠抗MP-1杂交瘤上清液染色，然后以AF647抗大鼠IgG染色。

实例10：使用包含膜结合抗原的EV来发现抗MP-8的单克隆抗体。

本研究使用实例7中开发的免疫方法来发现并产生抗膜蛋白MP-8(一种单程膜蛋白)的单克隆抗体。仅以蛋白质、编码MP-8的DNA或包含膜结合MP-8的EV(通过使用MLGag作为囊泡因子产生的)免疫大鼠。ELISA和FACS结果显示于图33。结果显示，虽然EV免疫导致比蛋白质免疫更少的ELISA+克隆，但EV免疫可产生比蛋白质免疫更高百分比的FACS+抗体。

实例11：使用包含膜结合抗原的荧光EV从经免疫的动物中分选B细胞。

本研究使用实例7中开发的免疫方法来发现并产生抗膜蛋白MP-9(一种多程膜蛋白)的单株抗体。将大鼠和兔以包含MP-9和MP-9DNA的EV免疫。通过表达MLGag作为囊泡因子来产生EV。

PBMC取自大鼠和兔，并以含EV的GFP标志物的MP-9和不含MP-9的RFP标志物的EV染色。IgG+B细胞的染色显示于图34。结果显示被EV染色的两群B细胞。GFP/RFP+群代表检测EV中非MP-9蛋白的B细胞。仅GFP标志物的群(以框表示)代表特异性检测MP-9的B细胞。使用两种其他MP(MP-10和MP-11)，其显示兔IgG+B细胞可用RFP标志物的MP EV和GFP标志物的空EV染色(图35)。在每种情况下，都有可特异性检测MP的仅RFP标志物的B细胞明确群体。

实例12：使用EV产生抗蛋白质复合物膜蛋白的单克隆抗体。

本研究使用实例7中开发的免疫方法来发现并产生抗蛋白质复合物中膜蛋白的单克隆抗体。蛋白质复合物包含6种不同的膜蛋白(MP-12、MP-13、MP-14的2种拷贝、MP-15、MP-16和MP-17的2种拷贝)。MP-12和MP-13二聚化以形成受体(在本文中称为受体“A”，在图36A至图36B中)，而MP-14、MP-15、MP-16和MP-17形成复合物(在本文中称为共受体“B”，在图36A至图36B中)，作为由MP-12与MP-13所形成的受体的共受体。产生两种多顺反子表现的载体，编码MP-12及MP-13二者或MP-14、MP-15、MP-16及MP-17的所有四种。为了确认在细胞表面处形成复合物，以(i)编码MP-12和MP-13的cDNA，(ii)编码MP-14、MP-15、MP-16和MP-17的cDNA，或(i)和(ii)瞬时转染Expi293细胞。当所有蛋白质共表达时，通过流式细胞术检测MP-14、MP-15、MP-16和MP-17的表达与MP-12和MP-13的表达，证实了完整复合物的组装(图36A)。产生含完整蛋白质复合物的EV，并通过ELISA确认并入(图36B)。通过MLGag的表达产生EV。

以包含6种膜蛋白(MP-12、MP-13、MP-14、MP-15、MP-16和MP-17)的复合物的EV免疫大鼠。随后对源自大鼠的单克隆抗体的表征显示成功发现与复合物中蛋白质(例如，MP-12/MP-13、MP-14、MP-14/MP-16或MP-14/MP-15)结合的FACS+抗体(表3)。这些数据显示，EV可用于产生抗膜蛋白的抗体，该膜蛋白存在于蛋白质复合物中。

表3.复合物特异性结合抗体的鉴定

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尽管已详细描述目前公开的主题及其优点，但应理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可在本文中进行各种改变、替换和变更。此外，本案的范围不旨在限于说明书中所述的制程、机器、制造和物质组成、手段、方法和步骤的特定实施例。本领域普通技术人员将容易地从目前公开的主题的发明中轻易理解，可根据目前公开的主题，利用目前存在或今后将开发的执行与在本文描述的对应实施例基本上相同的功能或实现基本上相同的结果的制程、机器、制造、物质组成、手段、方法或步骤。因此，所附的权利要求书旨在将这些制程、机器、制造、物质组成、手段、方法或步骤包括在其范围内。

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