c-di-AMP在制备改善口腔问题预防或治疗血管疾病药物中的应用

摘要

本发明公开了c‑di‑AMP在制备改善口腔问题预防或治疗血管疾病药物中的应用，涉及生物医药技术领域。c‑di‑AMP的中文名字为环二腺苷酸，英文全称：Cyclic Diadenosine Monophosphate，本发明发现了该物质同时在改善口腔问题及预防或治疗血管疾病中的作用，特别是在治疗或预防牙周炎及动脉粥样硬化上，为同时治疗或预防牙周炎及动脉粥样硬化提供了一种新的解决方式。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及c-di-AMP在制备改善口腔问题预防或治疗血管疾病药物中的应用。

背景技术

我国口腔问题一直是比较严峻的一个问题，譬如口腔炎症、口腔内部血管以及微生态问题，都是困扰许多人的难题；其中，牙周炎是危害结缔组织和支持牙列牙槽骨的一种慢性炎症性疾病，为口腔中最常见的两种炎症性疾病之一，它被定义为由牙菌斑中的微生物所引起的牙周支持组织慢性感染性疾病，其引发的炎症导致牙周支持组织破坏，如牙周袋形成、进行性附着丧失和牙槽骨吸收，最后可导致牙齿松动、脱落。患病率高达20％-50％。心血管疾病是全球人类发病和死亡的重要原因,约占所有死亡的1/3。

心血管疾病为一系列慢性疾病的总称，它们的病理生理学核心为动脉粥样硬化，其危险因素包括：高血压、高血脂、吸烟、糖尿病、肥胖、遗传等。目前中国心血管疾病患病人数达2.9亿，患病率逐年上升，死亡率超过肿瘤及其他疾病高居首位，占居民疾病死亡构成的40％以上。临床上发现，传统的危险因素并不能完全解释动脉粥样硬化的发生发展，于是，近年来其发生的炎症学说被众多研究强调。

越来越多的研究已经发现牙周炎与动脉粥样硬化风险增加密切相关，牙周炎和心血管疾病同为慢性炎症性疾病,具有多种危险因素,已被许多研究证实具有密切联系。牙周炎患者与非牙周炎患者相比,患心血管疾病的风险显著增加。该两种疾病都是我国重大的公共卫生问题，且严重影响患者的生活质量。慢性牙周炎患者龈沟内的牙周细菌也可以通过血液循环入侵心血管组织，分泌毒力因子，从而加快动脉粥样硬化的进程。

当今治疗牙周炎的方法主要为基础治疗、药物治疗及手术治疗，动脉粥样硬化的方法主要有一般治疗、药物治疗和手术治疗，但由于现有治疗牙周炎的药物较少，大多数抗生素不能穿透由口腔微生物制备的生物膜，药物治疗可能不能有效治疗细菌性牙周炎。而治疗动脉粥样硬化的药物具有出血、肌痛、消化道反应、以及肝脏毒性等不良反应，如能开发新型药物同时用于预防或治疗牙周炎及动脉粥样硬化，对于病人而言将大大减小其治疗难度。

发明内容

针对现有技术中的上述问题，本发明发现了c-di-AMP同时在改善口腔问题及预防或治疗血管疾病中的作用，特别是在治疗或预防牙周炎及动脉粥样硬化上，为同时治疗或预防牙周炎及动脉粥样硬化提供了一种新的解决方式。

其中，c-di-AMP的中文名字为环二腺苷酸，英文全称：Cyclic DiadenosineMonophosphate，是一种细菌分泌的第二信使响应细胞内外的信号物质。

本发明采用的技术方案如下：

c-di-AMP在制备改善口腔问题的药物中的应用。

更优地，所述口腔问题为牙周炎、口腔及血管微生态不良以及口腔免疫环境不良中的一种。

c-di-AMP在制备治疗或预防血管疾病的药物中的应用。

更优地，所述血管疾病为动脉粥样硬化

更优地，所述血管疾病为高血脂症。

综上所述，相比于现有技术，本发明具有如下优点及有益效果：

本发明首次公开了c-di-AMP具有可激活小鼠体内免疫反应、调节口腔以及血管局部微生物、显著缓解小鼠牙周炎及动脉粥样硬化的作用，为牙周炎以及动脉粥样硬化的药物研发提供了新的思路。

附图说明

图1为实施例2中，三组小鼠饲养三个月后的左侧上颌骨扫描图。

图2为实施例2中，三组小鼠饲养三个月后的主动脉全长en face染色结果图；

图3为实施例2中，三组小鼠饲养三个月后的主动脉瓣H&E染色结果图；

图4为实施例2中，三组小鼠饲养三个月后的主动脉瓣油红O染色结果图；

图5为实施例2中，三组小鼠饲养三个月后的主动脉瓣免疫组化染色结果图；

图6为实施例3中，三组小鼠的口腔微生物组成图；

图7为实施例3中，三组小鼠的血管微生物组成图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图以及各实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明利用动物实验检测c-di-AMP在激活小鼠体内炎症反应，调节局部微生态以及缓解牙周炎及牙周炎相关动脉粥样硬化中的作用，干预方法为口腔涂抹，方法简便易行，安全性较高，技术操作性不强。将其衍生至人体时，也可节约医生的操作时间，为患者提供更加安全、方便的治疗程序。同时，本发明通过c-di-AMP影响细菌定植、生长及代谢方面的作用，提供用于制备抗感染药物的思路，另一方面也通过c-di-AMP调节宿主免疫环境，在预防与缓解牙周炎及牙周炎相关的动脉粥样硬化方面的作用，提供用于制备缓解牙周炎及牙周炎相关动脉粥样硬化药物的思路。

实施例1c-di-AMP激活小鼠体内免疫反应

1、动物模型构建

动物种属、品系、年龄、性别、体重、来源、合格证、饲养环境：ApoE-/-基因缺失C57小鼠、6周、雄性、16-18g、SPF级、购自北京华阜康生物科技股份有限公司、合格证编号SCXK(京)2019-0008、饲养于SPF级实验动物房，5只/笼。

动物饲料：高脂饮食，饲料购自Research Diet(美国，货号：D12079B)，给小鼠引用无菌水。

牙周炎模型构建：采用6-0丝线于小鼠左上颌第二磨牙结扎，于腭侧打外科结。

干预措施：对照组100μl PBS/次，实验组100μl 10μM c-di-AMP/次(溶于PBS中)，用口腔粘接棒于小鼠口腔栓丝处涂抹药物，3次/周，共4周。

具体实验步骤：选用20只6周龄雄性ApoE-/-基因缺失C57小鼠，适应性喂养1周后随机分为2组，分别为PBS对照组(PBS组)以及c-di-AMP干预组(cdA10组)，用6-0丝线于对照组及cdA10组小鼠左上第二磨牙栓丝结扎。用100μl PBS及10μM c-di-AMP分别涂抹小鼠口腔丝线结扎处，每周3次。1月后，对小鼠实行安乐死，取小鼠腹主动脉，进行实时定量PCR检测小鼠血管炎症因子表达情况。

2、小鼠血管炎症因子检测

取样：小鼠腹主动脉

检测基因：IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ，MCP-1、CXCL-9、CXCL-10、CXCL-22、NOS-2

RNA提取：取小鼠腹主动脉，于液氮下研磨充分，研磨后的组织收集装有于1mlTrizol的ep管中。使用Trizol法提取RNA。使用NanoDrop 2000分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测RNA浓度及纯度。

逆转录：使用逆转录试剂盒(购自Takara，日本，货号：DRR047A)。按照操作手册配置去除RNA中DNA污染并逆转录为cDNA。

实时定量PCR：以cDNA作为扩增模板，使用TB

表1小鼠血管炎症因子检测结果表(P＜0.05具有显著性差异)

通过表1不难看出，c-di-AMP干预组小鼠的体内免疫反应明显强于PBS对照组，c-di-AMP可激活宿主免疫反应。

实施例2c-di-AMP药物治疗及炎症因子检测

1、动物模型构建

动物种属、品系、年龄、性别、体重、来源、合格证、饲养环境：ApoE-/-基因缺失C57小鼠、6周龄雄性、16-18g、SPF级、购自北京华阜康生物科技股份有限公司、合格证编号SCXK(京)2019-0008、饲养于SPF级实验动物房，5只/笼。

动物饲料：高脂饮食，饲料购自Research Diet(美国，货号：D12079B)，给小鼠引用无菌水。

牙周炎模型构建：采用6-0丝线于小鼠左上颌第二磨牙结扎，于腭侧打外科结。

细菌感染：牙龈卟啉单胞菌W83(Pg)，细菌量100μl 109CFU/ml,溶剂为2％羧甲基纤维素

干预措施：①PBS+CMC组：100μl PBS/次，3次/周，共4周，100μl羧甲基纤维素(CMC)，3次/周，共8周；②PBS+Pg组：100μl PBS/次，3次/周，共4周，100μl 109CFU/ml Pg感染，3次/周，共8周；③cdA10+Pg组：100μl 10μM c-di-AMP/次(溶于PBS中)，3次/周，共4周，100μl 109CFU/ml Pg感染，3次/周，共8周。用口腔粘接棒于小鼠口腔栓丝处涂抹药物及进行Pg牙周感染。

具体实验步骤：选用36只6周龄雄性ApoE-/-基因缺失C57小鼠，适应性喂养1周后随机分为3组，分别为PBS+CMC组、PBS+Pg组、cdA10+Pg组，用6-0丝线于小鼠左上第二磨牙栓丝结扎。前4周，用100μl PBS及10μM c-di-AMP分别涂抹小鼠口腔丝线结扎处，每周3次，后8周，对小鼠感染100μl 109CFU/ml Pg。3月后，对小鼠实行安乐死，取小鼠上颌骨观察牙周炎缓解情况，取小鼠血清用全自动血清生化分析仪测定血脂及用ELISA检测小鼠IL-6、IL-1β、TNF-α及IFN-β分泌，取小鼠全长主动脉及心脏主动脉瓣检测小鼠动脉粥样硬化缓解情况，取小鼠口腔栓丝丝线及升主动脉检测口腔及局部微生物组成，取小鼠主动脉进行实时定量PCR检测小鼠血管炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α，金属基质蛋白酶MMP-2、MMP-9及粘附分子ICAM-1、VCAM-1表达情况。

2、小鼠牙周炎程度检测

取样：小鼠上颌骨

检测方法：使用Scanco Medical Micro-CT 50扫描小鼠左侧上颌骨，分析第二磨牙釉牙骨质界与第一、二磨牙间牙槽嵴顶的距离(CEJ-ABC)，左上颌骨进行3D重建，选取第二磨牙两牙根同时出现的区域连续截图30张，并分析该区域松质骨相关参数骨小梁相对骨体积BV/TV，结果如图1、表2所述。

表2三组小鼠的CEJ-ABC、BV/TV情况

说明：P＜0.05具有显著性差异，都与对照组PBS+CMC比较，*在PBS+Pg组中代表与对照组有统计学差异；#在cdA10+Pg组中代表与PBS+Pg组有差异但与对照组无差异；$在cdA10+Pg组中代表与PBS+Pg组与对照组都有统计学差异。

由图1、表2不难得出结论：c-di-AMP可有效缓解小鼠牙周炎。

3、小鼠血浆炎症因子分泌情况检测

取样：取小鼠全血约0.5ml于EDTA抗凝管中，4℃条件下，3500rpm离心15min，取上清液

检测方法：使用ELISA试剂盒，根据操作手册对小鼠血浆IL-6、IL-1β、TNF-α及IFN-β进行测定

4、小鼠血浆血脂检测

取样：同上

检测方法：使用全自动生化仪检测血清样本中的总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)，结果如表3所示。

表3三组小鼠的TC、TG、HDL、LDL情况

说明：P＜0.05具有显著性差异，都与对照组PBS+CMC比较，*在PBS+Pg组中代表与对照组有统计学差异；#在cdA10+Pg组中代表与PBS+Pg组有差异但与对照组无差异；$在cdA10+Pg组中代表与PBS+Pg组与对照组都有统计学差异。

由表3不难得出结论：c-di-AMP可降低小鼠血脂。

5、小鼠动脉粥样硬化程度检测

小鼠主动脉全长en face染色

取样：小鼠主动脉全长(升主动脉至髂动脉分叉)

检测方法：将主动脉放置于体式显微镜下，用显微器械剥离血管周围脂肪组织，从中间剖开主动脉，固定于黑色泡沫上，置于油红O染液中染色15min。染色结果如图2所示，计算主动脉斑块染色面积占血管总面积的百分比。

小鼠主动脉瓣H&E染色

取样：小鼠主动脉瓣

检测方法：使用H&E染色试剂盒，根据操作手册对主动脉瓣横切面石蜡切片进行染色。染色结果如图3所示，计算主动脉斑块染色面积占血管总面积的百分比。

小鼠主动脉瓣油红O染色

取样：小鼠主动脉瓣

检测方法：使用油红O染色试剂，根据操作手册对主动脉瓣横切面冰冻切片进行染色。染色结果如图4所示，计算主动脉斑块中游离脂肪染色面积占血管总面积的百分比。

由图2～4不难得出结论：c-di-AMP可降低小鼠主动脉斑块面积。

6、小鼠血管炎症因子表达水平检测

小鼠主动脉瓣免疫组化染色

取样：小鼠主动脉瓣

检测方法：使用ICAM-1、VCAM-1一抗及二抗试剂盒，根据操作手册对主动脉瓣横切面石蜡切片进行免疫组化染色。染色结果如图5所示，计算主动脉斑块阳性面积及着色深度。

小鼠主动脉

取样：小鼠腹主动脉

检测基因：IL-6、IL-1β、TNF-α，MMP-2、MMP-9、ICAM-1、VCAM-1

RNA提取、逆转录、实时定量PCR及基因表达量计算方法同上，结果如表4所示。

表4小鼠血管炎症因子表达水平情况

由图5、表4不难得出结论，c-di-AMP在3月最终时间点显示炎症因子表达量降低。

实施例3c-di-AMP调节口腔及血管局部微生物情况检测

取样：小鼠口腔栓丝丝线及小鼠升主动脉

检测方法：样本置于2mL无菌离心管内。使用

根据97％的相似度对序列进行OTU聚类，比对silva138/16S_bacteria数据库，对每条序列进行物种分类注释。使用生物信息学分析方法对小鼠口腔及血管微生物的物种组成、特征性物种、Alpha多样性、Beta多样性进行分析，结果如图7所示，说明c-di-AMP可调节小鼠血管微生物组成。

以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。