具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物、地龙蛋白自溶酶解/消化产物及制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物、地龙蛋白自溶酶解/消化产物及制备方法与应用。本发明通过新鲜地龙浆加入水或不加水，搅拌进行预酶解，终止反应，冷却；离心，取上清液过滤，取滤液第一次超滤，超滤截留量为5～10kDa，取滤液第二次超滤，超滤截留量为1～3kDa，取滤液透析，透析截留量为100～500Da，再冷冻干燥得地龙蛋白自溶酶解物。预酶解后增加模拟胃肠消化步骤得到地龙蛋白自溶酶解/消化产物。本发明具有生产方法高效、简便和环保等优点；所得产物具有较好的免疫调节活性，能被作为活性成分用于功能性食品的生产，为免疫调节活性类物质提供了新来源。

说明书

技术领域

本发明属于农产品深加工及其副产品综合利用技术领域，具体涉及一种具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物、地龙蛋白自溶酶解/消化产物及制备方法与应用。

背景技术

地龙，也即蚯蚓，有止咳定惊、平喘和降血压等功效。虽然地龙作为中药已有2300年的历史，但是地龙的药理作用直到近几十年才逐渐展开研究。现代研究发现，地龙的生物活性物质主要有氨基酸、蛋白质和脂肪等，其中蛋白类物质含量高达53.5％～63.1％，具有抗凝血、溶血栓、降压、抑菌和免疫调节等生物活性。

对地龙蛋白以及多肽的研究，目前多集中于蚓激酶、地龙蛋白和肽段的提取纯化以及生理活性，而少有对于经过胃肠消化后地龙蛋白酶解物或多肽的探究，这是由于地龙被当成食品的概念目前还未被大众所接受。然而，已有相关综述在关注地龙冻干粉作为一种新型可食用蛋白补充剂的可能性，我国也在2009年发布了地龙蛋白作为新资源食品的公告，地龙蛋白作为食品的生理活性已逐渐成为新的研究方向。

免疫活性肽具有通过调节细胞免疫和体液免疫增强机体免疫功能的效果。免疫调节活性肽多由2～10个氨基酸残基构成，有较好的疏水性。免疫调节肽的特征氨基酸包括疏水性氨基酸、带电荷氨基酸以及等芳香族氨基酸。近年来已有许多研究表明，利用内源酶自溶过程，可以从多种食物蛋白质源中产生具有免疫调节活性的蛋白质水解物或多肽。目前，用于评价免疫调节肽活性的方法包括体外方法(细胞模型)以及体内方法(动物模型)；在细胞模型的活性评价中，小鼠巨噬细胞RAW 264.7是最为常用的一种，评价指标包括TNF-α、IL-6及NO等的表达水平。

已有研究表明，从地龙中提取纯化的蛋白和多肽，可使小鼠巨噬细胞分泌TNF-α和NO的水平显著提升。但是提纯过程并未经过胃肠模拟消化过程释放多肽，因此，地龙蛋白食用后是否具有免疫调节活性仍值得深入研究(傅炜昕,李建华,董占双,梁再赋,秦博,李铁英,贾秀坤,范世光.免疫活性地龙肽的制备及其对小鼠巨噬细胞活性的影响[J].微生物学杂志,2008(01):36-40.)。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物、地龙蛋白自溶酶解/消化产物及制备方法与应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物的制备方法，包括以下步骤：

(1)预酶解：新鲜地龙浆加入水或不加水，搅拌进行预酶解，预酶解结束后沸水浴终止反应，冷却；

(2)超滤分级：步骤(1)所得冷却液离心，取上清液过滤，取滤液第一次超滤，超滤截留量为5～10kDa，取滤液第二次超滤，超滤截留量为1～3kDa，取滤液透析，透析截留量为100～500Da，(透析液)再冷冻干燥得地龙蛋白自溶酶解物。

优选地，步骤(1)中，所述新鲜地龙浆和水的质量比为1:0～1:2；所述预酶解的温度为25～45℃，时间为2～10h；

进一步优选地，所述新鲜地龙浆和水的质量比为1:1；所述预酶解的温度为37℃，时间为4h；

优选地，步骤(1)中，所述沸水浴的时间为10～20min；进一步优选地，所述沸水浴的时间为10min；

优选地，步骤(1)中，所述冷却的时间为40～60min。进一步优选地，所述冷却的时间为50min。

优选地，步骤(1)中，所述水为蒸馏水；

优选地，步骤(2)中，所述离心的条件为12000～13000rpm，10～20min，4～10℃；

进一步优选地，所述离心的条件为12000rpm，15min，4℃。

优选地，步骤(2)中，所述过滤的条件为0.22～0.45μm滤膜过滤；进一步优选地，步骤(2)中，所述过滤的条件为0.45μm滤膜过滤。

优选地，步骤(2)中，所述第一次超滤的条件为截留量10kDa，取分子量<10kDa部分滤液；

优选地，步骤(2)中，所述第二次超滤的条件为截留量3kDa，取分子量<3kDa部分滤液。

优选地，步骤(2)中，所述透析截留量为100Da，取分子量>100Da的透析液。

优选地，步骤(2)中，所述透析用水温度保持在4℃。

上述的制备方法制备得到的具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物。

优选地，所述地龙蛋白自溶酶解物在浓度为500μg/mL时，促进小鼠巨噬细胞RAW264.7表达细胞因子TNF-α的水平为4.29～6.92ng/mL，较空白组提高了342.66～613.90％。

具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解/消化产物的制备方法，包括以下步骤：

(1)预酶解：新鲜地龙浆加入水，搅拌进行预酶解，预酶解结束后沸水浴终止反应，冷却；

(2)模拟胃肠消化：

模拟胃消化阶段：步骤(1)所得冷却液加入胃蛋白酶搅拌进行第一次酶解反应，调节pH终止模拟胃消化；

模拟肠消化阶段：模拟胃消化后的溶液加入胰酶搅拌进行第二次酶解反应，煮沸终止模拟肠消化；

(3)超滤分级：步骤(2)所得模拟胃肠消化后的溶液离心，取上清液过滤，取滤液第一次超滤，超滤截留量为5～10kDa，取滤液第二次超滤，超滤截留量为1～3kDa，取滤液透析，透析截留量为100～500Da，(透析液)再冷冻干燥得地龙蛋白自溶酶解/消化产物。

优选地，步骤(1)中，所述新鲜地龙浆和水的质量比为1:0～1:2；所述预酶解的温度为25～45℃，时间为2～10h；

进一步优选地，所述新鲜地龙浆和水的质量比为1:1；所述预酶解的温度为37℃，时间为4h；

优选地，步骤(1)中，所述沸水浴的时间为10～20min；进一步优选地，所述沸水浴的时间为10min；

优选地，步骤(1)中，所述冷却的时间为40～60min。进一步优选地，所述冷却的时间为50min。

优选地，步骤(1)中，所述水为蒸馏水；

优选地，步骤(2)中，所述模拟胃消化阶段的第一次酶解反应的pH为1.5～3.0，时间为1～4h，温度为35～38℃；所述模拟肠消化阶段的第二次酶解反应的pH为7.0～7.5，时间为1～4h，温度为35～38℃。

进一步优选地，步骤(2)中，所述模拟胃消化阶段的第一次酶解反应的pH为3.0，时间为2h，温度为37℃；所述模拟肠消化阶段的第二次酶解反应的pH为7.0，时间为2h，温度为37℃。

优选地，步骤(2)中，所述调节pH终止模拟胃消化的pH为7.0～7.5。

优选地，步骤(2)中，所述煮沸的时间为10～20min。进一步优选地，所述煮沸的时间为10min。

优选地，步骤(2)中，所述胃蛋白酶的酶活为2500～3500U/mg，胰酶的酶活为5～10U/mg。进一步优选地，所述胃蛋白酶的酶活为3000U/mg，胰酶的酶活为8U/mg。

优选地，步骤(3)中，所述离心的条件为12000～13000rpm，10～20min，4～10℃；

进一步优选地，所述离心的条件为12000rpm，15min，4℃。

优选地，步骤3)中，所述过滤的条件为0.22～0.45μm滤膜过滤；进一步优选地，步骤(3)中，所述过滤的条件为0.45μm滤膜过滤。

优选地，步骤(3)中，所述第一次超滤的条件为截留量10kDa，取分子量<10kDa部分滤液；

优选地，步骤(3)中，所述第二次超滤的条件为截留量3kDa，取分子量<3kDa部分滤液。

优选地，步骤(3)中，所述透析截留量为100Da，取分子量>100Da的透析液。

优选地，步骤(3)中，所述透析用水温度保持在4℃。

上述的制备方法制备得到的具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解/消化产物。

上述具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物和具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解/消化产物在制备免疫调节功能性食品和药品中的应用。

本发明通过在不同条件下预酶解以及超滤分级制备具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物，并进行胃肠模拟消化得到自溶酶解/消化产物，工艺高效简便，充分利用地龙自身含有的内源酶，为地龙蛋白的深加工提供了新思路，为新资源食品地龙蛋白的利用提供了新方向。

与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：

(1)本发明采用的原料为新鲜地龙浆，具有来源广泛、营养丰富以及蛋白质含量高的优点。

(2)本发明可以得到两种产品，一是具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物，二是更方便吸收的，具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解/消化产物；具有良好的免疫调节活性。

(3)本发明以新鲜地龙浆为原料，利用不同条件下内源酶酶活差异的特性，自溶酶解地龙蛋白，可按照同一套工艺流程同时制备具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物以及自溶酶解/消化产物。

(4)本发明创新性地利用地龙内源酶自溶，进行预酶解的加工处理方式，在不削弱地龙蛋白免疫调节活性的前提下，提高了地龙蛋白胃肠消化的可消化性。

(5)本发明的制备工艺简单便捷，成本低廉，适合工业化生产，为地龙蛋白的深加工提供了新思路，为新资源食品地龙蛋白的利用提供了新方向。

附图说明

图1为本发明提供的以新鲜地龙浆为原料制备具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物和地龙蛋白自溶酶解/消化产物的工艺流程图。

图2和3为本发明实施例1～5制备的地龙蛋白自溶酶解物对RAW 264.7细胞的存活率及TNF-α表达水平的影响柱状图。

具体实施方式

为了更好地阐述本发明，以下结合实施例对本发明作进一步的描述，但需要说明的是，实施例并不构成对本发明保护范围的限制，对于未特定注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

图1为本发明提供的以新鲜地龙浆为原料制备具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物及其消化产物的工艺流程图。

本发明提供一种具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物的制备方法，包括以下步骤：

(1)预酶解：取新鲜地龙浆为原料，以蒸馏水为溶液，按地龙浆:水(w/w，g/g)＝1:0～1:2的比例，预热水浴锅至25～45℃，磁力搅拌反应，预酶解时间2～10h，反应结束后沸水浴10～20min以终止反应，沸水浴后静置40～60min冷却至室温。

(2)超滤分级：待溶液冷却至室温后离心(12000～13000rpm，10～20min，4～10℃)，取上清液过滤(0.22～0.45μm滤膜)，取滤液第一次超滤，超滤截留量为10kDa，取分子量<10kDa部分滤液进行第二次超滤，超滤截留量为3kDa，取分子量<3kDa部分滤液透析脱盐，透析截留量为100～500Da，将透析液冷冻干燥得地龙蛋白自溶酶解物。

优选地，步骤(1)中所述预酶解条件为：地龙浆:水(w/w，g/g)＝1:1，酶解时间4h，酶解温度37℃，沸水浴10min，静置50min。

优选地，步骤(2)中，所述离心的条件为12000rpm，15min，4℃。

优选地，步骤(2)中，所述过滤的条件为0.45μm滤膜过滤。

优选地，步骤(2)中，所述透析脱盐截留量为100Da，取分子量>100Da的透析液。

优选地，步骤(2)中，所述透析用水温度应保持在4℃。

所得地龙蛋白酶解物在浓度为500μg/mL时，促进小鼠巨噬细胞RAW 264.7表达细胞因子TNF-α的水平为4.29～6.92ng/mL，较空白组提高了342.66～613.90％。

本发明提供一种具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解/消化产物的制备方法，包括以下步骤：

(1)预酶解：取新鲜地龙浆为原料，以蒸馏水为溶液，按地龙浆:水(w/w，g/g)＝1:0～1:2的比例，预热水浴锅至25～45℃，磁力搅拌反应，预酶解时间2～10h，反应结束后沸水浴10～20min以终止反应，沸水浴后静置40～60min恢复至室温。

(2)模拟胃肠消化：①模拟胃消化阶段：滴加0.1～1.0mol/L HCl调节体系pH至1.5～3.0，将水浴锅温度调至35～38℃，加入胃蛋白酶，磁力搅拌反应，酶解时间1～4h；②模拟肠消化阶段：滴加0.1～1.0mol/L NaOH调节酶解体系pH至7.0～7.5，抑制胃蛋白酶酶活，终止模拟胃消化阶段，加入胰酶，磁力搅拌反应，酶解时间1～4h，反应结束后，煮沸10～20min以终止反应。

(3)超滤分级：待溶液冷却至室温后离心(12000～13000rpm，10～20min，4～10℃)，取上清液过滤(0.22～0.45μm滤膜)，取滤液第一次超滤，超滤截留量为10kDa，取分子量<10kDa部分滤液进行第二次超滤，超滤截留量为3kDa，取分子量<3kDa部分滤液透析脱盐，透析截留量为100～500Da，将透析液冷冻干燥得地龙蛋白自溶酶解物消化产物。

优选地，步骤(1)中所述预酶解条件为：地龙浆:水(w/w，g/g)＝1:1，酶解时间4h，酶解温度37℃，沸水浴10min，静置50min。

优选地，步骤(2)中，HCl水溶液的浓度为1.0mol/L，NaOH水溶液的浓度为1.0mol/L。

优选地，步骤(2)中，所述胃蛋白酶的酶活需达到3000U/mg，胰酶的酶活需达到8U/mg。

优选地，步骤(2)中，模拟胃消化阶段的条件为：pH为3.0，温度为37℃，反应时间为2h；模拟肠消化阶段的条件为：pH为7.0，温度37℃，反应时间为2h，煮沸10min。

优选地，步骤(3)中，所述离心的条件为12000rpm，15min，4℃。

优选地，步骤(3)中，所述过滤的条件为0.45μm滤膜过滤。

优选地，步骤(3)中，所述透析脱盐截留量为100Da，取分子量>100Da的透析液。

优选地，步骤(3)中，所述透析用水温度应保持在4℃。

实施例1

本实施例为制备一种具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物的方法，具体步骤如下：

(1)预酶解：取新鲜地龙浆为原料，以蒸馏水为溶液，按地龙浆:水(w/w，g/g)＝1:1的比例，预热水浴锅至35℃，磁力搅拌反应，预酶解时间8h，反应结束后沸水浴10min以终止反应，沸水浴后静置50min冷却至室温。

(2)超滤分级：待溶液冷却至室温后离心(12000rpm，15min，4℃)，取上清液过滤(0.45μm滤膜)，取滤液第一次超滤，超滤截留量为10kDa，取分子量<10kDa部分滤液进行第二次超滤，超滤截留量为3kDa，取分子量<3kDa部分滤液透析脱盐，透析截留量为100Da，取分子量>100Da的透析液，将透析液冷冻干燥得地龙蛋白自溶酶解物。

实施例1制备的地龙蛋白自溶酶解物在浓度为500μg/mL时，巨噬细胞RAW 264.7细胞因子TNF-α的表达水平为5.26ng/mL，较空白组提高了441.66％，空白组为不含样品的培养基(89％(v/v)DMEM+10％(v/v)FBS+1％(v/v)双抗，其中双抗为链霉素和青霉素)，如图2中的所示。细胞存活率126.21％，如图3中的所示。实施例1预酶解物可溶性肽含量为60.92％，水解度为32.51％。

实施例2

本实施例为制备一种具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物的方法，具体步骤如下：

(1)预酶解：取新鲜地龙浆为原料，以蒸馏水为溶液，按地龙浆:水(w/w，g/g)＝1:1的比例，预热水浴锅至40℃，磁力搅拌反应，预酶解时间8h，反应结束后沸水浴10min以终止反应，沸水浴后静置50min冷却至室温。

(2)超滤分级：待溶液冷却至室温后离心(13000rpm，10min，4℃)，取上清液过滤(0.45μm滤膜)，取滤液第一次超滤，超滤截留量为10kDa，取分子量<10kDa部分滤液进行第二次超滤，超滤截留量为3kDa，取分子量<3kDa部分滤液透析脱盐，透析截留量为100Da，取分子量>100Da的透析液，将透析液冷冻干燥得地龙蛋白自溶酶解物。

实施例2制备的地龙蛋白自溶酶解物在浓度为500μg/mL时，巨噬细胞RAW 264.7细胞因子TNF-α的表达水平为6.93ng/mL，较空白组提高了613.90％，空白组为不含样品的培养基(89％(v/v)DMEM+10％(v/v)FBS+1％(v/v)双抗，其中双抗为链霉素和青霉素)，如图2中的所示。细胞存活率100.49％，如图3中的所示。实施例2预酶解物可溶性肽含量为64.70％，水解度为27.29％。

实施例3

本实施例为制备一种具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物的方法，具体步骤如下：

(1)预酶解：取新鲜地龙浆为原料，以蒸馏水为溶液，按地龙浆:水(w/w，g/g)＝1:1的比例，预热水浴锅至25℃，磁力搅拌反应，预酶解时间8h，反应结束后沸水浴10min以终止反应，沸水浴后静置50min冷却至室温。

(2)超滤分级：待溶液冷却至室温后离心(12000rpm，15min，4℃)，取上清液过滤(0.45μm滤膜)，取滤液第一次超滤，超滤截留量为10kDa，取分子量<10kDa部分滤液进行第二次超滤，超滤截留量为3kDa，取分子量<3kDa部分滤液透析脱盐，透析截留量为100Da，取分子量>100Da的透析液，将透析液冷冻干燥得地龙蛋白自溶酶解物。

实施例3制备的地龙蛋白自溶酶解物在浓度为500μg/mL时，巨噬细胞RAW 264.7细胞因子TNF-α的表达水平为4.29ng/mL，较空白组提高了342.66％，空白组为不含样品的培养基(89％(v/v)DMEM+10％(v/v)FBS+1％(v/v)双抗，其中双抗为链霉素和青霉素)，如图2中的所示。细胞存活率105.86％，如图3中的所示。实施例3预酶解物可溶性肽含量为74.03％，水解度为23.92％。

实施例4

本实施例为制备一种具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物的方法，具体步骤如下：

(1)预酶解：取新鲜地龙浆为原料，以蒸馏水为溶液，按地龙浆:水(w/w，g/g)＝1:1的比例，预热水浴锅至30℃，磁力搅拌反应，预酶解时间8h，反应结束后沸水浴10min以终止反应，沸水浴后静置50min冷却至室温。

(2)超滤分级：待溶液冷却至室温后离心(12000rpm，15min，4℃)，取上清液过滤(0.45μm滤膜)，取滤液第一次超滤，超滤截留量为10kDa，取分子量<10kDa部分滤液进行第二次超滤，超滤截留量为3kDa，取分子量<3kDa部分滤液透析脱盐，透析截留量为100Da，取分子量>100Da的透析液，将透析液冷冻干燥得地龙蛋白自溶酶解物。

实施例4制备的地龙蛋白自溶酶解物在浓度为500μg/mL时，巨噬细胞RAW 264.7细胞因子TNF-α的表达水平为5.77ng/mL，较空白组提高了495.03％，空白组为不含样品的培养基(89％(v/v)DMEM+10％(v/v)FBS+1％(v/v)双抗，其中双抗为链霉素和青霉素)，如图2中的所示。细胞存活率95.32％，如图3中的所示。实施例4预酶解物可溶性肽含量为66.25％，水解度为27.39％。

实施例5

本实施例为制备一种具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物的方法，具体步骤如下：

(1)预酶解：取新鲜地龙浆为原料，以蒸馏水为溶液，按地龙浆:水(w/w，g/g)＝1:1的比例，预热水浴锅至45℃，磁力搅拌反应，预酶解时间8h，反应结束后沸水浴10min以终止反应，沸水浴后静置50min冷却至室温。

(2)超滤分级：待溶液冷却至室温后离心(12000rpm，15min，4℃)，取上清液过滤(0.45μm滤膜)，取滤液第一次超滤，超滤截留量为10kDa，取分子量<10kDa部分滤液进行第二次超滤，超滤截留量为3kDa，取分子量<3kDa部分滤液透析脱盐，透析截留量为100Da，取分子量>100Da的透析液，将透析液冷冻干燥得地龙蛋白自溶酶解物。

实施例5制备的地龙蛋白自溶酶解物在浓度为500μg/mL时，巨噬细胞RAW 264.7细胞因子TNF-α的表达水平为5.01ng/mL，较空白组提高了416.08％，空白组为不含样品的培养基(89％(v/v)DMEM+10％(v/v)FBS+1％(v/v)双抗，其中双抗为链霉素和青霉素)，如图2中的所示。细胞存活率101.62％，如图3中的所示。实施例5预酶解物可溶性肽含量为61.58％，水解度为31.18％。

实施例6

本实施例为制备一种具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解/消化产物的方法，具体步骤如下：

(1)预酶解：取新鲜地龙浆为原料，以蒸馏水为溶液，按地龙浆:水(w/w，g/g)＝1:1的比例，预热水浴锅至37℃，磁力搅拌反应，预酶解时间4h，反应结束后沸水浴10min以终止反应，沸水浴后静置50min冷却至室温。

(2)模拟胃肠消化：①模拟胃消化阶段：滴加1.0mol/L HCl调节体系pH至3.0，将水浴锅温度调至37℃，加入胃蛋白酶，磁力搅拌反应，酶解时间2h；②模拟肠消化阶段：滴加1.0mol/L NaOH调节酶解体系pH至7.0，抑制胃蛋白酶酶活，终止模拟胃消化阶段，加入胰酶，磁力搅拌反应，酶解时间2h，反应结束后，煮沸10min以终止反应。

(3)超滤分级：待溶液冷却至室温后离心(12000rpm，15min，4℃)，取上清液过滤(0.45μm滤膜)，取滤液第一次超滤，超滤截留量为10kDa，取分子量<10kDa部分滤液进行第二次超滤，超滤截留量为3kDa，取分子量<3kDa部分滤液透析脱盐，透析截留量为100Da，取分子量>100Da的透析液，将透析液冷冻干燥得地龙蛋白自溶酶解物。

实施例6制备的地龙蛋白自溶酶解物在浓度为500μg/mL时，巨噬细胞RAW 264.7细胞因子TNF-α的表达水平为3.65ng/mL，较空白组提高了276.59％，空白组为不含样品的培养基(89％(v/v)DMEM+10％(v/v)FBS+1％(v/v)双抗，其中双抗为链霉素和青霉素)。实施例6预酶解物模拟消化后可溶性肽含量为81.36％，水解度为30.87％。

对比例1

(1)预处理：取新鲜地龙浆为原料，以蒸馏水为溶液，按地龙浆:水(w/w，g/g)＝1:1的比例，沸水浴10min灭酶，沸水浴后静置50min冷却至室温。

(2)模拟胃肠消化：①模拟胃消化阶段：滴加1.0mol/L HCl调节体系pH至3.0，将水浴锅温度调至37℃，加入胃蛋白酶，磁力搅拌反应，酶解时间2h；②模拟肠消化阶段：滴加1.0mol/L NaOH调节酶解体系pH至7.0，抑制胃蛋白酶酶活，终止模拟胃消化阶段，加入胰酶，磁力搅拌反应，酶解时间2h，反应结束后，煮沸10min以终止反应。

(3)超滤分级：待溶液冷却至室温后离心(12000rpm，15min，4℃)，取上清液过滤(0.45μm滤膜)，取滤液第一次超滤，超滤截留量为10kDa，取分子量<10kDa部分滤液进行第二次超滤，超滤截留量为3kDa，取分子量<3kDa部分滤液透析脱盐，透析截留量为500Da，将透析液冷冻干燥得地龙蛋白自溶酶解物。

对比例1制备的地龙蛋白胃肠消化产物在浓度为500μg/mL时，巨噬细胞RAW 264.7细胞因子TNF-α的表达水平为2.71ng/mL，较空白组提高了124.50％，空白组为不含样品的培养基(89％(v/v)DMEM+10％(v/v)FBS+1％(v/v)双抗，其中双抗为链霉素和青霉素)。

以上实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。