公开/公告号CN115575532A
专利类型发明专利
公开/公告日2023-01-06
原文格式PDF
申请/专利权人 德博尔(成都)生物科技有限公司;
申请/专利号CN202211202971.5
申请日2022-09-29
分类号G01N30/02(2006.01);G01N30/34(2006.01);G01N30/74(2006.01);G01N30/89(2006.01);
代理机构成都高远知识产权代理事务所(普通合伙) 51222;成都高远知识产权代理事务所(普通合伙) 51222;
代理人郑勇力;全学荣
地址 610000 四川省成都市温江区永宁镇芙蓉大道二段333号11栋1单元501号
入库时间 2023-06-19 18:19:26
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2023-01-24
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N30/02 专利申请号:2022112029715 申请日:20220929
实质审查的生效
2023-01-06
公开
发明专利申请公布
技术领域
本发明属于仪器分析技术领域,具体涉及一种反相高效液相色谱法测定胰激肽原酶的方法。
背景技术
胰激肽原酶,存在于哺乳动物胰腺等器官及尿液分泌物中,是激肽体系中的一个组成部分,又称血管舒缓素或胰激肽释放酶,从动物胰腺中提取的一种蛋白水解酶,属蛋白水解酶类。由18种氨基酸和4种糖所组成,分子量26800,有扩张血管、改善血液循环和微循环以及防止血栓形成的作用。为了考察用药效果,在临床中有必要对给药后血液中的胰激肽原酶进行检测。
中国药典第二部中提供了使用高效液相色谱法进行胰激肽原酶纯度测试方法,但是该方法仅针对纯品测试,其检测灵敏度低,检测限只能达到50ng/ml。由于动物给药后血液中胰激肽原酶的量非常少,血液中药物浓度达到1ng/ml以下,采用药典方法根本检测不出血浆中药物浓度,无法对药物的生物利用度及其它药效学进行研究分析。因此需要开发新的灵敏度更高的胰激肽原酶检测方法。
发明内容
针对现有技术的问题,本发明提供一种反相高效液相色谱法测定胰激肽原酶的方法,目的在于提供一种灵敏度更高的反相高效液相色谱法测定胰激肽原酶的方法。
一种胰激肽原酶,它的反相高效液相色谱图如图1所示,包括两个色谱峰,保留时间分别为29.289min±5%和30.021min±5%;其色谱条件:以含有体积份数5-15%的乙腈和0.05%-0.15%三氟乙酸的水溶液为A相,以含有体积份数85-95%的乙腈和0.05%-0.15%三氟乙酸的水溶液为B相,色谱柱为C4反相色谱柱。
本发明还提供一种反相高效液相色谱法测定胰激肽原酶的方法,包括如下步骤:
步骤1,将含有胰激肽原酶的待测样品制成供试品溶液;
步骤2,采用反相高效液相色谱法检测供试品溶液中的胰激肽原酶,
其中,色谱条件为:以含有体积份数5-15%的乙腈和0.05%-0.15%三氟乙酸的水溶液为A相,以含有体积份数85-95%的乙腈和0.05%-0.15%三氟乙酸的水溶液为B相,色谱柱为C4反相色谱柱。
优选的,所述色谱条件中,以含有体积份数10%的乙腈和质量份数0.1%三氟乙酸的水溶液为A相,以含有90%乙腈和0.1%的三氟乙酸的水溶液为B相。
优选的,所述色谱条件还包括:洗脱梯度为:
。
优选的,所述色谱条件中,色谱柱为YMC-Triart Bio C4。
优选的,所述色谱条件还包括:柱温为45-65℃。
优选的,所述色谱条件还包括:样品室温度为8-15℃。
优选的,所述色谱条件还包括:检测波长为280nm。
优选的,所述色谱条件还包括:流速为0.25-0.35mL/min。
优选的,所述供试品溶液以乙腈和水的混合溶液为溶剂配制而成。
优选的,所述胰激肽原酶的色谱图包括两个色谱峰,保留时间分别为29.289min±5%和30.021min±5%。
本发明对色谱条件进行了优选,成功获得了能够将胰激肽原酶的色谱峰进行分离的色谱条件,实现了高灵敏度的反相高效液相色谱法测定胰激肽原酶的方法。本发明方法的定量限为6ng/ml,检测限为1ng/ml,显著低于现有技术的方法。因此,本发明具有很好的应用前景。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为实施例1反相高效液相色谱法测定胰激肽原酶得到的色谱图;
图2为实验例1中筛选色谱条件过程中获得的无法分离目标峰的色谱图;
图3为实验例1中筛选色谱条件过程中获得的分峰效果不佳的色谱图;
图4为实验例2中进行线性考察的结果。
具体实施方式
以下实施例和实验例中,未具体说明的试剂和原料均为市售品。
实施例1反相高效液相色谱法测定胰激肽原酶
一、供试品溶液的配制
称量500mg胰激肽原酶的样品装入15mL离心管中,用10mL超纯水溶解,标识为35113-Stock#1,备用。
转移约1000μL 35113-Stock#1溶液至15mL离心管中,加入9000μL44%乙腈(ACN)溶液,混匀。样品标示为:35113-Stock#2.样品浓度为:5mg/mL。
按照下表配制供试品溶液:
二、反相高效液相色谱检测
色谱条件为:
以含有体积份数10%的乙腈和质量分数0.1%的三氟乙酸(TFA)的水溶液为A相,以含有体积份数90%的乙腈和质量分数0.1%的三氟乙酸的水溶液为B相;洗脱梯度为:
色谱柱为YMC-Triart Bio C4;
柱温为60℃;样品室温度为10℃;检测波长为280nm;流速为0.3mL/min。
检测得到的色谱图如图1所示。可以看出目标峰(保留时间分别为29.289min和30.021min,分别对应于胰激态原酶的两个异构体)完全分离,能够达到定量分析的检测要求。
下面通过实验对本发明的技术方案作进一步说明。
实验例1色谱条件筛选实验
一、供试品溶液配制
称量500mg胰激肽原酶的样品装入15mL离心管中,用10mL超纯水溶解,标识为35113-Stock#1,备用。
转移约1000μL 35113-Stock#1溶液至15mL离心管中,加入9000μL44%乙腈(ACN)溶液,混匀。样品标示为:35113-Stock#2.样品浓度为:5mg/mL。
二、色谱条件筛选过程
1、第一组色谱条件
按照下表配制供试品溶液:
色谱条件为:
在上述色谱条件下,分别采用不同的洗脱梯度。
梯度1:
采用该流动相没有检测到样品峰,更换流动相梯度2如下表格:
梯度2:
采用该流动相没有检测到样品峰,更换流动相梯度3如下表格:
梯度3:
采用梯度3检测到目标峰,见图2,但是峰型拖尾,因此上述条件还需要优化。
梯度4:
采用梯度4没有检测到目标峰,且重新配制流动相后,未检测到目标峰,方法无法重现,更换体系后重新分析。
2、第二组色谱条件
按照下表配制供试品溶液:
色谱条件为:
在上述色谱条件下,分别采用不同的洗脱梯度。
梯度1:
梯度2:
梯度3:
采用如上3个条件均没有检测到目标峰。更换色谱柱后进行分析。
3、第三组色谱条件
按照下表配制供试品溶液:
色谱条件为:
在上述色谱条件下,采用不同的参数设置。
参数1:
采用该参数没有检测到目标峰。
参数2:
参数3:
采用参数2和参数3,发现目标峰出峰位置约0.5min,保留时间太短,需要进一步优化方法。
参数4:
采用该参数没有检测到目标峰
参数5:
产生的色谱图见图3,从图中看以看出目标峰保留时间为约24.8min,但是目标峰有三个,且分离度不符合接受标准色谱参数需要进一步优化。
参数6:
参数7:
采用参数6和参数7均没有将目标峰分开。
参数8:
采用参数8得到的不同浓度胰激肽原酶谱图如图1所示,可以看出目标峰完全分离,满足检测的要求。
通过本实验例可以看到,在反相高效液相色谱法测定胰激肽原酶中,对色谱条件的设置有着严格的要求,只有特定的色谱条件能够获得分离度和峰形良好的色谱图。
实验例2方法学考察
本实验例对实施例1的方法进行方法学考察。
一、线性关系
按照如下表格配制线性溶液,按照实施例1的方法检测。
结果如下表和图4所示:
可以看到,本发明方法在较大浓度范围内具有良好的线性关系。
二、灵敏度
计算定量限(LOQ)和检测限(LOD),计算方法为:
LOQ=10×响应值标准偏差/校准曲线的斜率=10×SD/k,
LOD=3×响应值标准偏差/校准曲线的斜率=3×SD/k
计算得到LOQ为6ng/mL,LOD为1ng/mL。计算结果表明本发明方法灵敏度良好。
通过上述实施例和实验例可以看到,本发明通过优选色谱条件,实现了反相高效液相色谱法测定胰激肽原酶,该方法灵敏度优于现有技术,在相关领域的检测中具有很好的应用前景。
机译: 高效反相高效液相色谱法测定加热处理的猪肉类产品中大豆蛋白的方法。
机译: 反相高效液相色谱法测定环丙沙星的方法
机译: 反相高效液相色谱法测定头孢噻肟的方法