公开/公告号CN115109142A
专利类型发明专利
公开/公告日2022-09-27
原文格式PDF
申请/专利权人 长春西诺生物科技有限公司;
申请/专利号CN202210942770.2
申请日2022-08-08
分类号C07K14/75(2006.01);C12N9/74(2006.01);C07K1/14(2006.01);C07K1/34(2006.01);C07K1/16(2006.01);C07K1/18(2006.01);C07K1/36(2006.01);C07K1/06(2006.01);
代理机构吉林省维民知识产权代理事务所(普通合伙) 22220;
代理人刘微
地址 130000 吉林省长春市高新区普天路528号
入库时间 2023-06-19 17:09:24
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2022-10-18
实质审查的生效 IPC(主分类):C07K14/75 专利申请号:2022109427702 申请日:20220808
实质审查的生效
2022-09-27
公开
发明专利申请公布
技术领域
本发明涉及兽药技术领域,尤其涉及一种从犬血浆中同时分离犬纤维蛋白原和犬凝血酶原复合物的方法。
背景技术
纤维蛋白原(Fg)具有凝血功能的蛋白质,主要作用是促凝血,由肝脏合成,是人体所有凝血因子中含量最大的一种,人血浆中含量2~4g/L,半衰期4~6日。Fg缺乏会导致各类凝血方面的疾病,常见的包括:先天性纤维蛋白原减少或缺乏症,以及因肝损伤、肝硬化、弥散性血管内凝血、外上、产后大出血、大手术、内出血等导致的后天性纤维蛋白原缺乏症。因先天因素引起的Fg减少或缺乏症,补充Fg是目前唯一可靠的治疗方法,而对于后天因素引起的Fg减少或缺乏,根据病因的不同,也需输注不同剂量的Fg。
凝血因子是参与血液凝固过程的各种蛋白质组分,在出血时被激活,和血小板粘连在一起并且补塞血管上的创口。目前凝血因子Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ和凝血酶原复合物(主要含有凝血因子Ⅱ、Ⅸ、Ⅶ、Ⅹ)在人类医学中已经开发成药物,用于甲型或乙型血友病的治疗。
目前,在宠物临床医学中尚无可用的、适于宠物犬、猫的促凝血类产品。犬血浆是一种有限的珍贵资源,我国对犬血浆的利用水平还很低,一般只提取1种产品,如CN113214384 A公开的犬纤维蛋白原的制备方法及其产品,不仅大量宝贵的资源弃之不用,还加大了现有产品的生产成本,效益低,而且浪费大,十分可惜。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的是提供一种从犬血浆中同时分离犬纤维蛋白原和犬凝血酶原复合物的方法,工艺稳定,产品纯度高,收率高,复溶时间短,大大提高犬血资源利用率,降低生产成本。
本发明的从犬血浆中同时分离犬纤维蛋白原和犬凝血酶原复合物的方法,包括以下步骤:
S1、冷沉淀:将新鲜的冰冻血浆融化,在0℃~5℃条件下16000r/min离心,收集上清液并升温至4℃~8℃,用0.22μm滤芯过滤,取上清液,备用;
S2、灭活:取步骤S1的上清液用S/D灭活,步骤S1上清液中加入Tween80至1.0%,TNBP至0.3%,搅匀后升温至24~26℃,保温6-8小时,然后0.45μm滤芯过滤,收集滤液;
S3、向步骤S2中的滤液加入已平衡好的DEAE-Sephadex-A50凝胶进行吸附,每L上清液中加入量为0.5g~2.0g,混匀,吸附50-80分钟;吸附结束后分别收集液体和凝胶;
S4、步骤S3收集的凝胶用2-3倍凝胶体积量平衡液1洗涤凝胶2-4次,收集流穿液,与步骤S3收集的液体合并,备用,用于制备犬纤维蛋白原;用1-3倍凝胶体积量的洗脱液1洗脱凝胶3-5次,收集洗脱液,用于制备凝犬血酶原复合物;平衡液1为含有50-100mM氯化钠的10-20mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液,pH为6.5-7.5;洗脱液1为含有400-600mM氯化钠的10-20mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液,pH为6.5-7.5;
S5、将步骤S4收集的合并液体浓缩,定为浓缩液1,其蛋白质含量为2-3mg/ml;将收集的洗脱液浓缩,定为浓缩液2,其蛋白质含量为2-3mg/ml;
S6、阴离子交换柱先用平衡液2充分平衡,然后将浓缩液1上柱子,上柱过程中,流速控制在30-40ml/h,收集流穿液;上柱结束后,用2-3倍平衡液2洗涤柱子2-4次,洗涤液与流穿液合并,备用,用于制备纤维蛋白原;将合并液用0.45μm滤芯过滤,收集滤液,滤液按S7A~S10A步骤操作;平衡液2为含有0.01M-0.02M TRIS、10-20mM的枸橼酸-枸橼酸钠、0.1M-0.3M精氨酸盐酸盐,其余为水,pH为6.5-7.5;
另取阴离子交换柱先用平衡液2充分平衡,然后将浓缩液2上柱子,上柱过程中,流速控制在30-40ml/h,上柱结束后,用1-3倍洗脱液2洗脱柱子3-5次,收集洗脱液,备用,用于制备凝血酶原复合物;将洗脱液用0.45μm滤芯过滤,收集滤液,滤液按S7B~S10B步骤操作;洗脱液2为含有0.01M-0.02M TRIS、10-20mM的枸橼酸-枸橼酸钠、400mM-600mM氯化钠其余为水,pH为6.50-7.50;
S7A、步骤S6收集的合并液用凝胶介质为DEAE-Sephadex-A50进行吸附;
S8A、凝胶上柱前用平衡液1平衡,上样吸附,上样速度为30-40ml/h,上样结束后,用2-3倍凝胶体积的平衡液1洗涤凝胶柱2-4次,收集流穿液与洗涤液混合均匀;
S9A、将S8A的混合液用30KD超滤膜超滤浓缩至蛋白质含量为53mg/ml,加入甘氨酸、蔗糖、吐温80和氯化钠作为稳定剂,使甘氨酸终浓度为1%~2%、蔗糖终浓度为4%~6%、吐温80终浓度为0.01%~0.02%、氯化钠终浓度为0.6%~0.9%;
S10A、将步骤S9A的液体除菌过滤、分装、冻干、轧盖,采用干热病毒灭活,得到犬纤维蛋白原;
S7B、步骤S6收集的洗脱液用凝胶介质为DEAE-Sephadex-A50进行吸附;
S8B、凝胶上柱前用平衡液1平衡,上样吸附,上样速度为30-40ml/h,上样结束后,用1-3倍凝胶体积的洗脱液1洗脱凝胶柱3-5次,收集洗脱液;
S9B、将S8B的洗脱液用10KD超滤膜超滤浓缩,使凝血因子Ⅸ、Ⅱ、Ⅹ的效价不低于200IU/ml,凝血因子Ⅶ的效价不低于50IU/ml,然后加入甘氨酸、蔗糖和吐温80作为稳定剂,使甘氨酸终浓度为1%~2%、蔗糖终浓度为4%~6%、吐温80终浓度为0.01%~0.02%;
S10B、将步骤S9B的液体除菌过滤、分装,冻干、轧盖,采用干热病毒灭活,得到凝血酶原复合物。
进一步地,步骤S3中凝胶加入量为1.0g/L血清,吸附时间为70min。
进一步地,步骤S4的凝胶用2倍凝胶体积量平衡液1洗涤凝胶3次。
进一步地,步骤S4用3倍凝胶体积量的洗脱液1洗脱凝胶4次。
进一步地,步骤S6阴离子交换柱选择Capto DAEA或Capto Q。
进一步地,步骤S6上柱时的流速为30ml/h。
进一步地,步骤S9A的稳定剂中,甘氨酸终浓度为1%、蔗糖终浓度为4%、吐温80终浓度为0.01%、氯化钠终浓度为0.9%或者甘氨酸终浓度为1%、蔗糖终浓度为5%、吐温80终浓度为0.02%、氯化钠终浓度为0.6%或者甘氨酸终浓度为2%、蔗糖终浓度为6%、吐温80终浓度为0.01%、氯化钠终浓度为0.9%。
进一步地,步骤S9B的稳定剂中,甘氨酸终浓度为1%、蔗糖终浓度为4%、吐温80终浓度为0.01%或者甘氨酸终浓度为1%、蔗糖终浓度为5%、吐温80终浓度为0.02%或者甘氨酸终浓度为2%、蔗糖终浓度为4%、吐温80终浓度为0.02%或者甘氨酸终浓度为2%、蔗糖终浓度为6%、吐温80终浓度为0.01%。
与现有技术相比,本发明的技术效果:
本发明提供了从犬血浆中同时分离犬纤维蛋白原和犬凝血酶原复合物的方法,首先通过凝胶柱层析、阴离子柱层析两种方法进行粗分离和细分离,然后分别经DEAESephadex A-50凝胶吸附进一步纯化,通过多步工艺及其参数的组合,进而同时从犬血浆中提取出高纯度、高收率的犬纤维蛋白原和凝血酶原等多种成分,犬纤维蛋白原和犬凝血酶原复合物的纯度均可达95%以上,犬纤维蛋白原和凝血酶原复合物的提取率分别达到90%以上和85%以上,大大提升犬血浆的综合利用率;同时,通过调整稳定剂配方和配比,犬纤维蛋白原和犬凝血酶原复合物的冻干成品溶解性良好,溶液澄清,复溶时间短,分别为10~15分钟和5~10分钟。综上,本发明的方法,工艺稳定,原料利用率高,产品质量好,填补了国内宠物犬、猫的促凝血类产品规模化生产的空白。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的方法流程图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案,下面将结合实施例和附图对本发明作进一步的详细介绍。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1凝胶加入量和吸附时间的确定
将新鲜的冰冻血浆融化,在0℃~5℃条件下16000r/min离心,收集上清液并升温至4℃~8℃,用0.22μm滤芯过滤,取上清液。上清液中加入Tween80至1.0%,TNBP(磷酸三丁酯)至0.3%,搅匀后升温至24~26℃,保温6-8小时灭活,然后0.45μm滤芯过滤,收集滤液。向滤液中加入已平衡好的DEAE-Sephadex-A50凝胶进行吸附,凝胶的加入量设定为0.25g/L、0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L,每个凝胶量的吸附时间又设定为40min、50min、60min、70min、80min,吸附结束后测定液体中吸附前后纤维蛋白原(Fg)和凝血因子Ⅶ、Ⅱ、Ⅸ和Ⅳ的含量,通过吸附率确定凝胶的加入量和吸附时间。
Fg的吸附率=(吸附前Fg含量-吸附后Fg含量)/吸附前Fg含量×100%
各凝血因子吸附率=(吸附前各凝血因子含量-吸附后各凝血因子含量)/吸附前各凝血因子含量×100%
筛选的标准:以Fg的吸附率越低越好,各凝血因子的吸附率越高越好。
试验结果表明(如表1所示),随着凝胶用量的增加、吸附时间的延长,凝胶会吸附部分Fg。凝胶用量从0.25g/L到2.0g/L吸附时间从40min到80min对Fg的影响不大。当凝胶加入量为0.25g/L时,随着吸附时间的延长,各凝血因子的吸附率均逐渐升高,但最大吸附率均未达到90%以上。当凝胶加入量为0.5g/L~2.0g/L时,随着吸附时间的延长,各凝血因子的吸附率均逐渐升高,且吸附时间自50min-80min时吸附率均在85%以上。因此,确定加入凝胶的量为0.5g/L~2.0g/L血清,吸附时间为50~80min。
表1凝胶加入量的确定
实施例2凝胶洗涤液用量和洗涤次数的确定
将新鲜的冰冻血浆融化,在0℃~5℃条件下16000r/min离心,收集上清液并升温至4℃~8℃,用0.22μm滤芯过滤,取上清液。上清液中加入Tween80至1.0%,TNBP(磷酸三丁酯)至0.3%,搅匀后升温至24~26℃,保温6-8小时灭活,然后0.45μm滤芯过滤,收集滤液。向滤液中加入已平衡好的DEAE-Sephadex-A50凝胶进行吸附,凝胶的加入量设定为1.0g/L,凝胶量的吸附时间设定为70min。吸附结束后,过滤,取滤液,备用。取凝胶上柱子,分别用1倍柱体积、2倍柱体积、3倍柱体积的洗涤液冲洗柱子,每个柱体积又分别洗涤1、2、3、4、5次,对每次洗涤的洗涤液单独收集,并测定每个柱体积每次收集液体中的纤维蛋白原的含量。
试验结果表明,1倍柱体积洗涤第5次时纤维蛋白原的含量仍很高,为0.11mg,2倍柱体积洗涤第4、第5次时纤维蛋白原的含量较低,分别为0.04和0.008mg,3倍柱体积洗涤第3、4、5次时纤维蛋白原的含量较低,均低于0.01mg。因此确定用2-3倍柱体积洗涤2~4次。如表2所示。
表2洗涤液用量及洗涤次数的确定
实施例3洗脱液-洗脱液的用量和洗脱次数的确定
将新鲜的冰冻血浆融化,在0℃~5℃条件下16000r/min离心,收集上清液并升温至4℃~8℃,用0.22μm滤芯过滤,取上清液。上清液中加入Tween80至1.0%,TNBP(磷酸三丁酯)至0.3%,搅匀后升温至24~26℃,保温6-8小时灭活,然后0.45μm滤芯过滤,收集滤液。向滤液中加入已平衡好的DEAE-Sephadex-A50凝胶进行吸附,凝胶的加入量设定为1.0g/L,凝胶量的吸附时间又设定为70min。吸附结束后,过滤,取滤液,备用。取凝胶上柱子,用2倍柱体积的平衡液1洗涤柱子,共洗涤3次,每次的洗涤液均与滤液合并,备用。
凝胶柱用洗涤液洗涤之后,用洗脱液洗脱。分别用1倍柱体积、2倍柱体积、3倍柱体积的洗脱液洗脱柱子,每个柱体积又分别洗脱1、2、3、4、5次,对每次洗脱的洗脱液单独收集,测定每个柱体积每次收集液体中的凝血因子Ⅶ、Ⅱ、Ⅸ和Ⅳ的含量。
以凝血因子Ⅶ、Ⅱ、Ⅸ和Ⅳ的回收率作为评价指标。
第1次洗脱的回收率=第1次洗脱液中的凝血因子含量/血浆中相应的凝血因子含量×100%
第2次洗脱的回收率=(第1次+第2次洗脱液中的凝血因子含量)/血浆中相应的凝血因子含量×100%
第3次洗脱的回收率=(第1次+第2次+第3次洗脱液中的凝血因子含量)/血浆中相应的凝血因子含量×100%
第4次洗脱的回收率=(第1次+第2次+第3次+第4次洗脱液中的凝血因子含量)/血浆中相应的凝血因子含量×100%
第5次洗脱的回收率=(第1次+第2次+第3次+第4次+第5次洗脱液中的凝血因子含量)/血浆中相应的凝血因子含量×100%
评价指标:与吸附前比较,以各个凝血因子的回收率均达到90%以上,即可确定每个柱体积洗脱时的洗脱次数。
试验结果表明,1倍柱体积洗脱时,当洗脱5次时凝血因子Ⅶ的回收率可达90%以上,其余三个凝血因子的回收率在85%以上;2倍柱体积洗脱时,当洗涤4次时凝血因子Ⅶ的回收率可达90%以上,其余三个凝血因子的回收率在85%以上;3倍柱体积洗脱时,当洗脱3次时凝血因子Ⅶ的回收率可达90%以上,其余三个凝血因子的回收率在85%以上。综合以上分析,确定洗脱用量为1~3倍柱体积,洗脱次数为3~5次。如表3所示。
表3洗脱液用量及洗脱次数的确定
实施例4阴离子交换柱-流穿液流速的确定
将新鲜的冰冻血浆融化,在0℃~5℃条件下16000r/min离心,收集上清液并升温至4℃~8℃,用0.22μm滤芯过滤,取上清液。上清液中加入Tween80至1.0%,TNBP(磷酸三丁酯)至0.3%,搅匀后升温至24~26℃,保温6-8小时灭活,然后0.45μm滤芯过滤,收集滤液。向滤液中加入已平衡好的DEAE-Sephadex-A50凝胶进行吸附,凝胶的加入量设定为1.0g/L,凝胶量的吸附时间又设定为70min。吸附结束后,过滤,取滤液,备用。取凝胶上柱子,用2倍柱体积的平衡液1洗涤柱子,共洗涤3次,每次的洗涤液均与滤液合并,备用。
凝胶柱用洗涤液洗涤之后,用洗脱液洗脱。洗脱液用量为3倍柱体积,洗涤次数为4次。
收集的洗涤液和洗脱液分别浓缩、过滤,使其蛋白质含量为2~3mg/ml。
将洗脱液的浓缩液上阴离子交换柱进行层析,柱子预先用平衡液2充分平衡,平衡后上柱,上柱时的流速分别设定为20ml/h、30ml/h、40ml/h、50ml/h,收集流穿液,以流穿液中的凝血因子Ⅶ的吸附率为评价指标。若流速过低,会延长试验的时间,若流速过快则会导致凝血因子吸附不完全。
试验结果表明,当流速设定为20ml/h,因速度较慢,试验时间较长,当速度设定为50ml/h,流速过快,导致凝血因子Ⅶ的吸附率降低,因此确定最佳的流速为30~40ml/h。如表4所示。
表4流穿液流速的确定
实施例5冻干保护剂的选择依据及用量的确定依据
将新鲜的冰冻血浆融化,在0℃~5℃条件下16000r/min离心,收集上清液并升温至4℃~8℃,用0.22μm滤芯过滤,取上清液。上清液中加入Tween80至1.0%,TNBP(磷酸三丁酯)至0.3%,搅匀后升温至24~26℃,保温6-8小时灭活,然后0.45μm滤芯过滤,收集滤液。向滤液中加入已平衡好的DEAE-Sephadex-A50凝胶进行吸附,凝胶的加入量设定为1.0g/L,凝胶量的吸附时间又设定为70min。吸附结束后,过滤,取滤液,备用。取凝胶上柱子,用2倍柱体积的平衡液1洗涤柱子,共洗涤3次,每次的洗涤液均与滤液合并,备用。
收集的液体洗涤液和平衡液浓缩,定为浓缩液1,其蛋白质含量为2-3mg/ml;将收集的洗脱液浓缩,定为浓缩液2,其蛋白质含量为2-3mg/ml。
(1)纤维蛋白原冻干保护剂的筛选阴离子交换柱先用平衡液2充分平衡,然后将浓缩液1上柱子,上柱过程中,流速控制在30-40ml/h,收集流穿液,上柱结束后,用2-3倍平衡液2洗涤柱子2-4次,洗涤液与流穿液合并,备用。制备纤维蛋白原。将合并液用0.45μm滤芯过滤,收集滤液。
滤液用凝胶介质为DEAE-Sephadex-A50进行吸附。凝胶上柱前用平衡液1平衡,上样吸附,上样速度为30-40ml/h,上样结束后,用2倍凝胶体积的平衡液1洗涤凝胶柱3次,收集流穿液与洗涤液混合均匀。将流穿液与洗涤液用30KD超滤膜超滤浓缩至蛋白质含量为53mg/ml,然后按下表设计筛选纤维蛋白原冻干保护剂的处方。
筛选甘氨酸、蔗糖、吐温80、氯化钠作为产品的冻干保护剂,以正交试验三因素三水平设计9个试验方案,以冻干后的外观和溶解性评价所选择冻干保护剂的类型及其用量。
试验结果表明:从冻干后溶液的外观、溶解性为考察指标,以A
表5纤维蛋白原正交试验因素水平
表6纤维蛋白原正交试验结果
(2)凝血酶原复合物冻干保护剂的筛选另取阴离子交换柱先用平衡液2充分平衡,然后将浓缩液2上柱子,上柱过程中,流速控制在30-40ml/h,上柱结束后,用3倍洗脱液2洗脱柱子4次,收集洗脱液,备用,制备凝血酶原复合物。将洗脱液用0.45μm滤芯过滤,收集滤液。
滤液用凝胶介质为DEAE-Sephadex-A50进行吸附。凝胶上柱前用平衡液1平衡,上样吸附,上样速度为30-40ml/h,上样结束后,用2倍凝胶体积的洗脱液1洗脱凝胶柱3次,收集洗脱液。洗脱液用10KD超滤膜超滤浓缩至Ⅸ、Ⅱ、Ⅹ因子的效价不低于200IU/ml,Ⅶ因子的效价不低于50IU/ml,然后按下表设计筛选凝血酶原复合物冻干保护剂的处方。
筛选甘氨酸、蔗糖、吐温80作为产品的冻干保护剂,以正交试验三因素三水平设计9个试验方案,以冻干后的外观和溶解性评价所选择冻干保护剂的类型及其用量。
从冻干后溶液的外观、溶解性等考察,以A
表7凝血酶原复合物正交试验因素水平
表8凝血酶原复合物正交试验结果
实施例6阴离子交换柱填料的确定依据
Capo DAEA,Q-Sepharose FF,Q-Sepharose 4FF,Q-Sepharose HP及Capo Q作为阴离子交换柱填料,取5份新鲜的冰冻血浆,融化。每份血浆均按下述方法纯化。
(1)在0℃~5℃条件下16000r/min离心,收集上清液并升温至4℃~8℃,用0.22μm滤芯过滤,取上清液,备用。
(2)灭活:步骤(1)的上清液用S/D灭活,步骤(1)上清液中加入Tween80至1.0%,TNBP(磷酸三丁酯)至0.3%,搅匀后升温至24~26℃,保温6-8小时,然后0.45μm滤芯过滤,收集滤液。
(3)向步骤(2)中的上清液中加入已平衡好的DEAE-Sephadex-A50凝胶进行吸附,每L上清液中加入量为1.0g/L,混匀,吸附60分钟。吸附结束后分别收集液体和凝胶。
(4)步骤(3)收集的凝胶用3倍凝胶体积量平衡液1洗涤凝胶4次,收集洗涤液,与步骤3收集的液体合并,备用,用于制备犬纤维蛋白原;用2倍凝胶体积量的洗脱液1洗脱凝胶4次,收集洗脱液,用于制备凝血酶原复合物。
(5)将步骤(4)收集的液体洗涤液和平衡液浓缩,其蛋白质含量为2-3mg/m。
(6)将取含Capo DAEA,Q-Sepharose FF,Q-Sepharose 4FF,Q-Sepharose HP及Capo Q的阴离子交换柱,分别先用平衡液2充分平衡,然后将上述5份浓缩液分别上柱子,上柱过程中,流速控制在30-40ml/h,收集流穿液,上柱结束后,用2倍平衡液2洗涤柱子3次,洗涤液与流穿液合并,备用。制备纤维蛋白原。将合并液用0.45μm滤芯过滤,收集滤液。
(7)步骤(6)收集滤液分别用凝胶介质为DEAE-Sephadex-A50进行吸附。凝胶上柱前用平衡液1平衡,上样吸附,上样速度为30-40ml/h,上样结束后,用2倍凝胶体积的平衡液1洗涤凝胶柱3次,收集流穿液与洗涤液。将流穿液与洗涤液用30KD超滤膜超滤浓缩至蛋白质含量为53mg/ml,加入甘氨酸、蔗糖、吐温80和氯化钠作为稳定剂,使甘氨酸终浓度为1%,蔗糖终浓度为5%,吐温80终浓度为0.02%、氯化钠终浓度为0.6%。将液体除菌过滤、分装、冻干、轧盖,采用干热病毒灭活(100℃30min)。
通过不同色谱柱纯化后成品的外观和纯度来判定最适合的填料。从外观和纯度分析,纯化纤维蛋白原时的阴离子色谱柱选择的填料以Capto DAEA和Capto Q最好(纤维蛋白原在复溶的过程中允许有少量的颗粒物)。结果如表9所示。
表9纤维蛋白原的填料筛选结果
实施例7按制定的制备工艺制备3批产品
S1、冷沉淀:取三份新鲜的冰冻血浆,每份50kg,在0℃~5℃条件下16000r/min离心,收集上清液并升温至4℃~8℃,用0.22μm滤芯过滤,取上清液,备用;
S2、灭活:取步骤S1的上清液用S/D灭活,步骤S1上清液中加入Tween80至1.0%,TNBP至0.3%,搅匀后升温至24~26℃,保温6-8小时,然后0.45μm滤芯过滤,收集滤液;
S3、向步骤S2中的滤液中加入已平衡好的DEAE-Sephadex-A50凝胶进行吸附,每L上清液中加入量为1.0g/L,混匀,吸附70分钟;吸附结束后分别收集液体和凝胶;
S4、步骤S3收集的凝胶用2倍凝胶体积量平衡液1洗涤凝胶3次,收集流穿液,与步骤S3收集的液体合并,备用,用于制备犬纤维蛋白原;用3倍凝胶体积量的洗脱液1洗脱凝胶4次,收集洗脱液,用于制备犬凝血酶原复合物;平衡液1为含有50-100mM氯化钠的10-20mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液,pH为6.5-7.5;洗脱液1为含有400-600mM氯化钠的10-20mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液,pH为6.5-7.5;
S5、将步骤S4收集的合并液体浓缩,定为浓缩液1,其蛋白质含量为2-3mg/ml;将收集的洗脱液浓缩,定为浓缩液2,其蛋白质含量为2-3mg/ml;
S6、阴离子交换柱先用平衡液2充分平衡,然后将浓缩液1上柱子,上柱过程中,流速控制在30-40ml/h,收集流穿液;上柱结束后,用2倍平衡液2洗涤柱子3次,洗涤液与流穿液合并,备用,用于制备犬纤维蛋白原;将合并液用0.45μm滤芯过滤,收集滤液,定为滤液1,滤液1按S7A~S10A步骤操作;平衡液2为含有0.01M-0.02M TRIS、10-20mM的枸橼酸-枸橼酸钠、0.1M-0.3M精氨酸盐酸盐,其余为水,pH为6.5-7.5;
另取阴离子交换柱先用平衡液2充分平衡,然后将浓缩液2上柱子,上柱过程中,流速控制在30-40ml/h,上柱结束后,用3倍洗脱液2洗脱柱子4次,收集洗脱液,备用,用于制备犬凝血酶原复合物;将洗脱液用0.45μm滤芯过滤,收集滤液,定为滤液2,滤液2按S7B~S10B步骤操作;洗脱液2为含有0.01M-0.02M TRIS、10-20mM的枸橼酸-枸橼酸钠、400mM-600mM氯化钠,其余为水,pH为6.50-7.50;
S7A、步骤S6收集的滤液1用凝胶介质为DEAE-Sephadex-A50进行吸附;
S8A、凝胶上柱前用平衡液1平衡,上样吸附,上样速度为30-40ml/h,上样结束后,用2倍凝胶体积的平衡液1洗涤凝胶柱3次,收集流穿液与洗涤液,混合均匀;
S9A、将S8A的混合液用30KD超滤膜超滤浓缩至蛋白质含量为53mg/ml,加入甘氨酸、蔗糖、吐温80和氯化钠作为稳定剂,使甘氨酸终浓度为1%~2%、蔗糖终浓度为4%~6%、吐温80终浓度为0.01%~0.02%、氯化钠终浓度为0.6%~0.9%;
S10A、将步骤S9A的液体除菌过滤、分装、冻干、轧盖,采用干热病毒灭活(100℃30min),得到犬纤维蛋白原;
S7B、步骤S6收集的滤液2用凝胶介质为DEAE-Sephadex-A50进行吸附;
S8B、凝胶上柱前用平衡液1平衡,上样吸附,上样速度为30-40ml/h,上样结束后,用3倍凝胶体积的洗脱液1洗脱凝胶柱4次,收集洗脱液;
S9B、将S8B的洗脱液用10KD超滤膜超滤浓缩,使凝血因子Ⅸ、Ⅱ、Ⅹ的效价不低于200IU/ml,凝血因子Ⅶ的效价不低于50IU/ml,然后加入甘氨酸、蔗糖和吐温80作为稳定剂,使甘氨酸终浓度为1%~2%、蔗糖终浓度为4%~6%、吐温80终浓度为0.01%~0.02%;
S10B、将步骤S9B的液体除菌过滤、分装,冻干、轧盖,采用干热病毒灭活(100℃30min),得到凝血酶原复合物。
三批血浆制备的纤维蛋白原和凝血酶原复合物的检测指标均包括收率、冻干粉外观、溶解性、复溶时间、纯度。结果如表10所示。
表10试制制剂的收率及关键技术指标一览表
以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例,毋庸置疑,对于本领域的普通技术人员,在不偏离本发明的精神和范围的情况下,可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此,上述附图和描述在本质上是说明性的,不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。
机译: 组合物,为犬接种犬传染性呼吸道疾病疫苗,在犬中治疗cird,刺激免疫应答,制备和获得抗体,被动免疫犬以cird免疫以及确定犬是否已暴露于衣原体物种的方法与cird相关,或狗是否患有cird或易受cird影响,使用抗体,抗体,疫苗组合物的试剂盒零件,抗体,免疫吸附测定和固相底物
机译: 的方法和装置在楚格芬克犬的祖格芬克犬中翻转古怪犬标志
机译: 分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段,犬化抗体或其抗原结合片段,犬化单克隆抗体或其抗原结合片段,分离的核酸,表达载体,宿主细胞,分离的肽,融合蛋白,药物组合物和方法降低免疫细胞的活性?