一种炭疽保护性抗原的亲和多肽的筛选方法

摘要

本发明公开了一种炭疽保护性抗原的亲和多肽的筛选方法，包括理论计算部分和实验验证部分，所述理论计算部分包括构建模板多肽、准备蛋白结构、实施分子对接、确定关键位点、选择突变位点、建立虚拟肽库和筛选亲和多肽；所述试验验证部分包括合成、提纯和鉴定炭疽保护性抗原的亲和多肽和测定亲和多肽与炭疽保护性抗原之间的亲和力。本发明的理论计算部分，采用计算机辅助设计软件，结合炭疽保护性抗原蛋白晶体结构特点，通过分子对接确定高价值突变氨基酸建立虚拟肽库，设计炭疽保护性抗原的亲和多肽。实验验证部分，选取理论亲和力提升较高的多肽序列，经合成、提纯和鉴定后，测定其与炭疽保护性抗原的亲和力。

说明书

技术领域

本发明涉及一种炭疽保护性抗原的亲和多肽的筛选方法，属于亲和多肽筛选技术领域。

背景技术

炭疽杆菌(B.anthracis)具有在土壤中长期生存和在自然界中易于传播的特点，是最危险的A类生物战剂之一。炭疽病患者在感染早期几乎没有典型的临床表现，仅凭经验很难诊断，需要通过检测炭疽保护性抗原(Protective antigen，PA)才能确诊。研究一种亲和力高的生物识别元件，对检测具有十分重要的现实意义。亲和多肽是一种比单克隆抗体体积更小的生物识别元件，可以用于检测各种生物标志物。可以通过构建多肽库(如噬菌体展示肽库、组合化学合成肽库等)进行筛选，获取具有亲和力的多肽序列，但这些方法面临实验周期长、工作量大和耗费多等困难。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种炭疽保护性抗原的亲和多肽的筛选方法。

为了实现第一目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种炭疽保护性抗原的亲和多肽的筛选方法，包括理论计算部分和实验验证部分，所述理论计算部分包括构建模板多肽、准备蛋白结构、实施分子对接、确定关键位点、选择突变位点、建立虚拟肽库和筛选亲和多肽；所述试验验证部分包括合成、提纯和鉴定炭疽保护性抗原的亲和多肽和测定亲和多肽与炭疽保护性抗原之间的亲和力。

优选的，所述构建模板多肽具体为：采用的模板多肽来自炭疽保护性抗原片段PA63的亲和多肽，选取PA63含16个氨基酸序列的亲和多肽中前12个有效序列为模板多肽，记为P1。

采用上述技术方案，采用的模板多肽来自炭疽保护性抗原片段(PA63)的亲和多肽(Gln-Ser-Pro-Val-Asn-His-His-Tyr-His-Tyr-His-Ile-Gly-Cys-Gly-Lys)。为方便计算和后期合成检验，选取PA63含16个氨基酸序列的亲和多肽中前12个有效序列为模板多肽(P1)。运用MOE软件完成对接前模板多肽准备工作，打开MOE软件中Build Protein模块建立P1初始空间构象。选择Amber10：EHT力场，完成Fix Hydrogens、Fix Charges，通过EnergyMinimize工具进行能量梯度优化，Gradient值选择为0.05RMS kcal/mol/

优选的，所述准备蛋白结构具体为：在蛋白质结构数据库获取炭疽保护性抗原蛋白晶体三维结构信息，下载编号为1ACC的炭疽保护性抗原的蛋白晶体结构PDB格式文件。

采用上述技术方案，在蛋白质结构数据库获取炭疽保护性抗原蛋白晶体三维结构信息，下载编号为1ACC的炭疽保护性抗原的蛋白晶体结构PDB格式文件。该结构分辨率达到

优选的，所述实施分子对接具体为：将模板多肽P1与1ACC炭疽保护性抗原的蛋白晶体进行分子对接；无干扰自由对接10000次后，分析评估函数得分最优的10个对接结果，选择最优结果进行下一步设计。

采用上述技术方案，选择General Dock模块，进行P1与1ACC分子对接。受体为：1ACC，不设置固定对接位点，即盲对接，对接位点为整个炭疽保护性抗原表面；配体为：P1。对接参数选择：①Placement：Proxy Triangle；②Refinement：Rigid Receptor；评估函数选择：London dG和GBVI/WSA dG。无干扰自由对接10000次后，分析评估函数得分最优的10个对接结果，选择最优结果进行下一步设计。

优选的，所述确定关键位点具体为：对最优对接结果进行Protein Contacts分析。

采用上述技术方案，对最优对接结果进行Protein Contacts分析，将受体与配体之间已形成共价键、芳香键、离子键、金属键和氢键的氨基酸位点标记为关键氨基酸，在后续进行多位点突变时，这些位点氨基酸不参与突变。

优选的，所述选择突变位点具体为：将在一定距离范围内能量为负值，尚未形成有效相互作用力，P1链上的氨基酸位点标记为高价值突变位点，下步进行多位点突变；其余距离较近，但能量为正值的非关键位点，不作为突变位点。

优选的，所述建立虚拟肽库具体为：保留P1链上关键氨基酸，对高价值突变位点进行采样计算，确定各个突变位点氨基酸后，进行完整的多位点突变，建立虚拟肽库，初步评估所有多肽与1ACC之间的亲和力和稳定性分布。

采用上述技术方案，保留P1链上关键氨基酸，对高价值突变位点进行采样计算，确定各个突变位点氨基酸后，进行完整的多位点突变，建立虚拟肽库，初步评估所有多肽与1ACC之间的亲和力和稳定性分布。运用Protein Design中Sample sequence模块，将P1链上标记为高价值突变位点的氨基酸进行10000次多位点随机突变的采样计算。分析采样计算结果，记录各个突变位点引起亲和力变化(ΔAffinity)和稳定性变化(ΔStability)均小于-8的氨基酸。将上述突变位点氨基酸，运用Protein Design中Residue scan模块，建立多位点突变后的虚拟肽库，选择虚拟肽库中所有多肽与1ACC实施分子对接，绘制亲和力和稳定性分布图。

优选的，所述筛选亲和多肽具体为：保留虚拟肽库中与1ACC的ΔAffinity、ΔStability为负值的多肽序列，结合Affinity、ΔAffinity、Affinity all的评估值选择合适的多肽序列，完成亲和多肽设计。

采用上述技术方案，保留虚拟肽库中与1ACC的ΔAffinity、ΔStability为负值的多肽序列。选取虚拟肽库中亲和力提升较大的多肽，将它们与1ACC形成的复合物，在LowMode MD模式下进行分子动力学模拟，结合Affinity、ΔAffinity、Affinity all等评估值选择合适的多肽序列，完成亲和多肽设计。

优选的，所述合成、提纯和鉴定炭疽保护性抗原的亲和多肽具体为：通过Fmoc法合成模板多肽P1和设计的理论亲和力提升较高的多肽；合成与设计的多肽分子量相等的多肽，冷冻干燥成粉末，-20℃保存备用。

采用上述技术方案，通过Fmoc法合成模板肽(P1)和设计的理论亲和力提升较高的多肽。经裂解脱落、离心沉淀、冷冻干燥形成含有杂质的多肽初级产物。将其溶解后，高速离心除去杂质，通过HPLC检测及纯化，纯度大于95％。取纯化后溶液1μL，通过MS检测分析，确定合成的多肽分子量与设计的多肽分子量一致后，将纯化液冷冻干燥成粉末，-20℃保存备用。

优选的，所述测定亲和多肽与炭疽保护性抗原之间的亲和力具体为：运用SPR技术测定多肽与炭疽保护性抗原之间的亲和力。

采用上述技术方案，运用SPR技术测定多肽与炭疽保护性抗原之间的亲和力，通过Biacore T100生物大分子相互作用仪，采用pH scouting实验，结合文献报道重组炭疽保护性抗原的等电点约为5.6，测定亲和力时，炭疽保护性抗原浓度为10μg/mL，pH为5.0进行固定，稀释缓冲液为0.05％PBST为最适偶联条件。注入NHS(60μL)和EDC(60μL)混合溶液活化7分钟，加入炭疽保护性抗原样品420s，在注入Ethanolamine-HCl溶液失活7分钟，完成CM5芯片活化与封闭，最终固定炭疽保护性抗原量为17903RU。根据样品间反应，使用缓冲液梯度稀释多肽冻干粉。按照操作手册选择单循环模式进行多肽亲和力测定，设置进样时间60s，解离时间90s，流速30μL/min。采集实验数据导入Biacore T100评估软件，进行1:1bindingmodel拟合获得解离常数(KD值)，绘制拟合曲线。

本发明的有益效果：

(1)本发明通过理论计算和实验验证两个部分工作。理论计算部分，采用计算机辅助设计软件，结合炭疽保护性抗原蛋白晶体结构特点，通过分子对接确定高价值突变氨基酸建立虚拟肽库，设计炭疽保护性抗原的亲和多肽。实验验证部分，选取理论亲和力提升较高的多肽序列，经合成、提纯和鉴定后，测定其与炭疽保护性抗原的亲和力。

(2)本发明利用计算机辅助设计软件，根据蛋白质晶体结构特点，进行亲和多肽设计方法。该方法既可提高亲和多肽的筛选成功率，又具有可大幅缩短实验周期、减小工作量和降低成本的优势。

附图说明

图1为模板多肽(P1)结构式；

图2为通过LowMode MD模式获得的模板多肽空间构象；

图3为炭疽保护性抗原与模板多肽的最佳对接结果空间构象；

图4为炭疽保护性抗原与模板多肽之间相互作用力的平面图；

图5为模板多肽的高价值突变位点空间构象；

图6为虚拟肽库中所有多肽与炭疽保护性抗原的亲和力、稳定性分布情况图；

图7为通过LowMode MD模式获得的多肽亲和力分布图；

图8为多肽的高效液相色谱图；

图9为多肽的质谱图；

图10为多肽与炭疽保护性抗原之间的亲和力测定结果图。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

实施例1

1、模板多肽空间结构

模板多肽(P1)结构式，如图1所示。

将建立的P1经能量优化后，选择LowMode MD模式，对P1进行10000次最优空间构象搜索，最终生成一系列空间构象，选择能量最小的结构为对接空间构象。通过LowMode MD模式获得的模板多肽空间构象，如图2所示。能量值最小的模板多肽空间构象如图2(a)所示；模板多肽的8个不同空间构象，如图2(b)所示。

2、蛋白-模板多肽对接

经10000次不设定固定结合位点自由对接后，产生一系列对接结果，选择处于能量最低、空间结构最契合的1ACC与P1空间构象为最佳对接结果。炭疽保护性抗原与模板多肽的最佳对接结果空间构象，如图3所示。炭疽保护性抗原主要结合位点位于第4结构域，尤其是在小孔处结合可能性最高。组成最佳对接受体腔的氨基酸包括：Val-303、Val-320、Gly-386、Lys-387、Glu-441、Lys-444、Thr-445、Gln-447、Asp-593、Lys-594、Phe-596、His-597、Tyr-598、Asp-599、Arg-600、Asn-601、Val-605、Lys-703、Glu-704、Thr-706、Ile-707、Lys-722。

3、关键氨基酸位点

炭疽保护性抗原与模板多肽之间相互作用力的平面图，如图4所示，图4右上角为炭疽保护性抗原与模板多肽最佳对接结果。

由图4可见，图中虚线椭圆中标记了5个关键氨基酸作用位点，P1的关键氨基酸分别是：Gln-1、His-6、His-9、Tyr-10、Ile-12；右上角空间构象蓝色曲面为受体腔氨基酸空间结构的表面，粉色区域为1ACC与P1之间有相互作用力的氨基酸位点。

炭疽保护性与模板多肽之间相互作用力分布，如表1所示。主要有3种类型作用力，能产生相互作用的氨基酸距离均小于

表1炭疽保护性抗原与模板多肽之间相互作用力分布

4、突变氨基酸位点

1ACC与P1两者之间氨基酸距离近，尚未形成相互作用力的为非关键位点。选择能量值小于0的非关键位点作为高价值突变位点。模板多肽的高价值突变位点空间构象，如图5所示，图5的右上角为炭疽保护性抗原与模板多肽最佳对接结果。

由图5可见，图中蓝色曲面为受体腔氨基酸空间结构的表面，粉色区域为1ACC与P1距离较近，适合进行氨基酸突变的位点。

炭疽保护性抗原与模板多肽之间氨基酸位点的能量和距离，如表2所示。P1上Pro-3、Val-4、Asn-5、His-7、Tyr-8、His-11氨基酸与受体的Gly-386、Lys-387、Thr-445、Gln-447、Asp-599、Asn-601、Glu-704、Lys-722氨基酸距离均小于

表2炭疽保护性抗原与模板多肽之间氨基酸位点的能量和距离

5、高价值突变氨基酸分布

1个突变位点有20种突变结果，n个突变位点进行全位点突变会有20n种突变结果。P1有12个氨基酸位点，如进行全位点氨基酸突变，则突变结果高达2012种，以当前算力难以在短时间内获得所需结果。故需要保留关键氨基酸，仅选择高价值位点氨基酸进行突变。

P1含有6个高价值突变位点，此时进行全位点氨基酸突变，突变结果仍然会高达206种，即需要计算6.4×107条多肽。为均衡算力和结果精度，选择进行多位点随机突变。经采样10000次高价值位点氨基酸随机突变结果，将其中ΔAffinity和ΔStability均小于-8的氨基酸标记为高价值突变氨基酸。高价值突变氨基酸分布，如表3所示。

表3高价值突变氨基酸分布

由表3可见，高价值突变氨基酸在P1第3位突变氨基酸有4种(Pro、Asn、Arg、Leu)、第4位突变氨基酸有3种(Glu、Try、Asn)、第5位突变氨基酸有3种(Phe、Ile、Leu)、第7位突变氨基酸有3种(Phe、His、Val)、第8位突变氨基酸有2种(Arg、Trp)、第11位突变氨基酸有4种(Tyr、Glu、Trp、Leu)。

6、虚拟肽库的建立

选择P1中高价值突变位点，确定各位点中高价值突变氨基酸，进行全位点饱和突变，形成容量为27000条多肽的肽库。将肽库中所有多肽与1ACC对接后，将其亲和力、稳定性与P1对比，此时进行的分子对接是理想状态下可以进行。虚拟肽库中所有多肽与炭疽保护性抗原的亲和力、稳定性分布情况，如图6所示。亲和力变化(ΔAffinity)负值越大代表亲和力提高越大；稳定性变化(ΔStability)负值越大代表稳定性提高越大。

7、亲和多肽的筛选

为更好评估虚拟肽库中多肽与炭疽保护性抗原的对接结果，需要进行含溶液环境下的分子动力学模拟。如果将肽库中所有多肽与炭疽保护性抗原的复合物进行分子动力学模拟，会耗费大量算力。为均衡算力，选取肽库中ΔAffinity小于20的多肽序列，在LowModeMD模式下进行分子动力学模拟。通过LowMode MD模式获得的多肽亲和力分布，如图7所示。

由图7可见，在LowMode MD模式下部分多肽与1ACC的Affinity和Affinity all具有一致性在图中呈线性分布，另一部分多肽则波动很大。结合Affinity、ΔAffinity和Affinity all分布情况，在呈线性分布的多肽中选取Affinity变化较大的1条设计多肽序列为最优多肽。其中编号为P24的Affinity分别为-115.88，多肽序列为Gln-Ser-Arg-Trp-Ile-His-Leu-Arg-His-Tyr-Trp-Ile。

8、炭疽保护性抗原的亲和多肽合成、提纯和鉴定

将合成的模板肽(P1)和设计的理论亲和力提升较高的多肽(P24)经HPLC进行纯化，获得纯度大于95％纯化液。多肽的高效液相色谱图，如图8所示。P1、P24高效液相色谱图，如图8(a)、(b)所示。图8(a)、(b)分别为P1、P24的高效液相色谱图。

取纯化液1μL经MS检测分析，确定合成的多肽分子量与设计的多肽分子量一致后，将其余纯化液冷冻干燥。多肽的质谱图，如图9所示。P1、P24的质谱图，如图9(a)、(b)所示。图9(a)、(b)分别为P1、P24的质谱图。

9、炭疽保护性抗原与亲和多肽之间的亲和力测定

运用SPR技术分别测定P1、P24与炭疽保护性抗原之间的解离常数值(KD，KD＝Kd/Ka)，解离常数越小，亲和力越高。4条多肽与炭疽保护性抗原之间的亲和力测定结果，如图10所示。P1、P24与炭疽保护性抗原之间的亲和力测定结果，如图10(a)、(b)所示。图10(a)、(b)分别为P1、P24与炭疽保护性抗原之间的亲和力测定结果

由图10可见，1条模板多肽(P1)和1条设计多肽(P24)与炭疽保护性抗原之间的解离常数值分别为：3.72×10

本发明以炭疽保护性抗原的蛋白晶体结构为基础，结合文献设计模板多肽，运用分子对接软件完成了构建模板多肽、准备蛋白结构、实施分子对接、确定关键位点、选择突变位点、建立虚拟肽库和筛选亲和多肽等亲和多肽的设计，获得了1条理论亲和力提升较高的多肽序列。使用多肽固相合成仪完成了1条模板多肽(P1)和1条设计多肽(P24)的合成。使用生物大分子相互作用仪完成了提纯后的多肽与炭疽保护性抗原之间的亲和力测定。通过分析得到如下结论：

(1)通过计算机辅助设计软件获得的1条设计多肽与模板多肽相比，理论亲和力分别提高了19.18％，表明本研究中提出的计算机辅助设计亲和多肽的方案具有可行性。

(2)通过实验分别测定了1条设计多肽、模板多肽与炭疽保护性抗原的亲和力，结果表明设计多肽的亲和力都有所提高，其中理论亲和力提升最高编号为P24的设计多肽，实验测定的亲和力也提升最高，KD值达到了nM级，可以用于检测炭疽保护性抗原。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。