法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2022-10-18
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N 5/09 专利申请号:2022109314916 申请日:20220804
实质审查的生效
2022-09-27
公开
发明专利申请公布
技术领域
本发明涉及一种三维生物打印的胆囊癌模型及其构建方法,属于生物医药技术领域。
背景技术
胆囊癌恶性程度极高,进展迅速,多数患者发现时即为晚期,缺乏有效的治疗方法,预后极差。如在体外可以开展高质量的针对性的研究是突破胆囊癌临床治疗瓶颈的关键。以往针对胆囊癌的研究通常使用二维平面培养的单细胞层模型。但是,失去了三维空间微环境的细胞将会丢失其固有的原始特征和功能,比如细胞与细胞、细胞与基质相互作用关系、时空信号、代谢产物浓度梯度和空间机械力学束缚等。而且,二维模型无法反应体内实体瘤的恶性进展,如缺氧/坏死、干细胞巢特征、缓慢增殖和药物耐受等进程。已有研究表明,三维培养后的肿瘤细胞更接近体内肿瘤组织的生长状态,在基因表达、耐药性及粘附生长方面明显不同于传统二维平面培养的细胞。这些差异使得利用三维胆囊癌模型进行研究更能模拟真实肿瘤,最终促进胆囊癌的诊断与治疗。
现有技术中,三维肿瘤模型建立方法包括肿瘤切片培养、微球培养、支架培养等,但都存在一定的缺陷;例如,中国专利CN113832211A描述了一种三维肿瘤切片模型,但其需要首先从患者体内取得肿瘤,来源有限,难以展开机制层面研究。中国专利CN111599003A描述了一种微球模型,利用富血小板纤维蛋白粉末制备多孔微球,能够创造肿瘤细胞生长所需的三维空间环境,但其微球制作过程对技术设备要求高,且难以做到精确的重复和维持。中国专利CN111304168A描述了一种水凝胶支架模型,使用明胶和海藻酸钠来制作水凝胶支架,搭建三维空间,但此项技术必须依赖交联剂来完成支架固化成型,构建过程较为复杂。此外,尚无公开技术或报道该技术应用于三维胆囊癌模型的构建。
三维生物打印作为一种新兴的工程技术,可用于肿瘤模型构建,能够实现模拟个性化的肿瘤模型尺寸和形态,具有低成本、高通量、高重复性的特点。鉴于三维生物打印技术能较好地弥补现有技术存在的缺陷,本技术领域亟需解决如何利用三维生物打印技术,简便、快速、低廉、大批量地制作三维体外胆囊癌模型的技术问题。
发明内容
本发明的目的是为解决如何能简便、快速、低廉、大批量地利用三维生物打印技术制作三维体外胆囊癌模型的技术问题。
为达到解决上述问题的目的,本发明所采取的技术方案是提供一种三维生物打印胆囊癌模型的方法,包括以下步骤:
步骤1:制备生物墨水;使用PBS平衡液和光引发剂LAP配制引发剂标准溶液;
步骤2:称取所需质量GelMA,使用步骤1配制的引发剂标准溶液,配制GelMA溶液;本步骤需在水浴避光加热条件下进行;
步骤3:收集胆囊癌细胞,用GelMA溶液重悬,配制为生物墨水;
步骤4:进行三维生物打印;调入胆囊癌肿瘤模型格式文件打印完成三维胆囊癌模型,打印完成后使用光对其照射,完成固化。
优选地,所述步骤1中引发剂标准溶液浓度为0.25%。
优选地,所述步骤2中GelMA的氨基取代度为30%,浓度为10%;所述步骤2中配制的GelMA溶液浓度为10%。
优选地,所述步骤2中获得的GelMA溶液需要灭菌处理。
优选地,所述步骤3中生物墨水中的细胞数量为5*10
优选地,所述步骤4中三维生物打印的平台温度在4-30℃;打印参数设置为挤出气压为1-2倍标准大气压,打印速度为6-15mm/秒。
优选地,所述挤出气压为1.5倍标准大气压,打印速度为10mm/秒。
本发明提供一种三维生物打印胆囊癌模型的方法制作的胆囊癌模型。
本发明提供一种三维生物打印胆囊癌模型的应用。
本发明提供一种存储装置,所述存储装置存储有多条指令,所述指令适于执行根据上述的一种三维生物打印胆囊癌模型的方法通过三维生物打印机制作三维生物打印胆囊癌模型。
相比现有技术,本发明具有如下有益效果:
本发明提供的三维生物打印胆囊癌模型提供了一个体外模拟胆囊癌三维微环境的新平台。此模型中有如下优势:1.该模型使用GelMA制备生物墨水体系,固化过程仅30秒,所需细胞浓度仅需达到5*10
附图说明
图1为本发明三维胆囊癌模型的三维生物打印过程图;
图2为本发明三维胆囊癌模型的实物图;
图3为本发明三维胆囊癌模型光学显微镜下结构图;
图4为本发明三维胆囊癌模型电子扫描显微镜下结构图;
图5为本发明不同打印条件下的细胞存活率差异比较图;
图6为本发明优选条件下三维胆囊癌模型活死染色结果图。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂,兹以优选实施例,并配合附图作详细说明如下:
如图1-6所示,本发明所采取的技术方案是提供一种三维生物打印胆囊癌模型的方法,包括以下步骤:
步骤1:制备生物墨水;使用PBS平衡液和光引发剂LAP配制引发剂标准溶液;
步骤2:称取所需质量GelMA,使用步骤1配制的引发剂标准溶液,配制GelMA溶液;本步骤需在水浴避光加热条件下进行;
步骤3:收集胆囊癌细胞,用GelMA溶液重悬,配制为生物墨水;
步骤4:进行三维生物打印;调入胆囊癌肿瘤模型格式文件打印完成三维胆囊癌模型,打印完成后使用光对其照射,完成固化。
上述步骤1中引发剂标准溶液浓度为0.25%。
上述步骤2中GelMA的氨基取代度为30%,浓度为10%;所述步骤2中配制的GelMA溶液浓度为10%。
上述步骤2中获得的GelMA溶液需要灭菌处理。
上述步骤3中生物墨水中的细胞数量为5*10
上述步骤4中三维生物打印的平台温度在4-30℃;打印参数设置为挤出气压为1-2倍标准大气压,打印速度为6-15mm/秒。
上述优选的挤出气压为1.5倍标准大气压,打印速度为10mm/秒。
本发明提供一种三维生物打印胆囊癌模型的方法制作的胆囊癌模型。
本发明提供一种三维生物打印胆囊癌模型的应用。
本发明提供一种存储装置,存储装置存储有多条指令,指令适于执行根据上述的一种三维生物打印胆囊癌模型的方法通过三维生物打印机制作三维生物打印胆囊癌模型。
实施例
一、本发明使用以下方法构建:
1.所需细胞培养:
人胆囊癌细胞系(NOZ、GBC-SD、EH-GB-1)来自上海市胆道疾病研究重点实验室。
2.所需试剂:
DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰酶、PBS平衡液购自美国Gibco公司,甲基丙烯酰化明胶(Gelatin Methacryloyl,GelMA)、光引发剂phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate(LAP)、细胞活死染色试剂盒购自中国苏州永沁泉智能设备有限公司。GelMA有多种氨基取代度(30%、60%、90%)和浓度(5-30%(w/v)),本发明优选氨基取代度30%,浓度10%(w/v)的GelMA。
3.生物墨水制备:
步骤1:使用PBS平衡液和光引发剂LAP配制0.25%(w/v)引发剂标准溶液;
步骤2:称取所需质量GelMA,使用步骤1配制的引发剂标准溶液,配制10%(w/v)GelMA溶液;
步骤3:步骤2需在60-70℃水浴避光加热条件下进行,溶解30分钟,期间需振荡数次;
步骤4:所获的GelMA溶液需使用0.22μm无菌针头过滤器灭菌;
步骤5:收集胆囊癌细胞,用37℃预热的GelMA溶液重悬,配制为生物墨水。生物墨水中细胞数量为5*10
4.三维生物打印过程:
三维生物打印使用杭州捷诺飞生物科技股份有限公司(Regenovo)
调入胆囊癌肿瘤模型.cli格式文件,预设为直径10mm、高度4mm的圆柱形结构,条宽及间距均为1mm,模型层厚2mm,打印层数2层。打印参数设置:挤出气压为1-2倍标准大气压,打印速度为6-15mm/秒。本发明优选条件为:挤出气压为1.5倍标准大气压,打印速度为10mm/秒。
三维胆囊癌模型打印完成后使用405nm蓝光对其照射30秒,完成固化。
5.细胞活死染色:
模型制备完成后,随机选取样品进行细胞活/死染色。配制2μM钙黄素(AM)和8μM碘化丙啶(PI)的工作液。将三维胆囊癌模型放入工作液中室温孵育15min后吸出工作液,用PBS平衡液洗涤一遍,置于荧光显微镜下观察。在荧光显微镜200×视野下,每个样品随机选择5个视野拍照,重复3遍,分别记录每个视野下AM和PI染色阳性的细胞数,计算活性细胞占总细胞数的比例。
6.体外培养:
在三维胆囊癌模型所在培养皿中,加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基,置于37℃、5%CO2培养箱进行培养。每两天更换新鲜培养基。
如图1所示,为本发明三维胆囊癌模型的三维生物打印过程图;
如图2所示,为本发明三维胆囊癌模型的实物图;
如图3所示,为本发明三维胆囊癌模型光学显微镜下结构图;
如图4所示,为本发明三维胆囊癌模型电子扫描显微镜下结构图;
如图5所示,为本发明不同打印条件下的细胞存活率差异比较图;其中图A中为不同氨基取代度的GelMA对三维生物打印胆囊癌模型中细胞存活的影响;图B中为不同打印温度对三维生物打印胆囊癌模型中细胞存活的影响。
如图6所示,为本发明优选条件下三维胆囊癌模型活死染色结果图。优选条件为氨基取代度30%,浓度10%(w/v)GelMA,细胞浓度5*10
本发明使用最常见的光固化生物材料GelMA和最简单的挤出式三维生物打印技术来制作三维胆囊癌模型,具备简便、快速、低廉、可大批量制作等优点。附表:几种模型制作技术比较表:
以上所述,仅为本发明的较佳实施例,并非对本发明任何形式上和实质上的限制,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明的前提下,还将可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化,均为本发明的等效实施例;同时,凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变,均仍属于本发明的技术方案的范围内。
机译: 一种测量空心物体的内表面的形状,尺寸和弹性性能的方法,一种构建空心物体的内表面的三维模型的方法,一种用于测量内部物体的形状,尺寸和弹性性能的装置空心物体的表面,以及建立空心物体内表面的三维模型
机译: 三维数据评估模型的构建与评估方法,三维数据评估模型的构建装置,三维数据评估装置和计算机程序
机译: 内表面空物体的形状,尺寸和弹性性能的测量方法,内表面空物体的三维模型的构建方法,内表面空物体的形状,尺寸和弹性性能的测量装置以及三维模型的构建内表面空洞