一种改进的用于盐酸法舒地尔注射液中高哌嗪的检测方法

摘要

本发明公开了一种改进的用于盐酸法舒地尔注射液中高哌嗪的检测方法，属于药物质量检测技术领域，其步骤如下：(1)液相色谱仪的色谱条件；(2)供试品溶液的配制；(3)对照品溶液的配；(4)溶液量取；(5)测定：精密量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，按内标法以峰面积计算。本发明的改进的用于盐酸法舒地尔注射液中高哌嗪的检测方法，试验操作简单，检测灵敏度和检测限高，对检测仪器、色谱柱选择性好，色谱柱不易损耗，回收率好，耐用性好，稳定性与准确度高，能够反映高哌嗪的真实含量，进而可以对盐酸法舒地尔的质量进行控制。

说明书

技术领域

本发明涉及一种HPLC高效液相检测方法，特别涉及一种改进的用于盐酸法舒地尔注射液中高哌嗪的检测方法，属于药物质量检测技术领域。

技术背景

盐酸法舒地尔是一种具有广泛药理作用的新型药物，它的分子结构为5-异喹啉磺酰胺衍生物，为RHO激酶抑制物，通过增加肌球蛋白轻链磷酸酶的活性扩张血管，降低内皮细胞的张力，改善脑组织微循环，不产生和加重脑的盗血，同时可拮抗炎性因子，保护神经抗凋亡，促进神经再生。结果表明盐酸法舒地尔对促进神经功能的恢复，减轻临床症状，减少病残率有一定疗效。

因此，对于在基层由于受经济条件的制约以及对疾病认识程度，超早期溶栓治疗不能实现，但为减少疾病的进一步进展，在治疗时间窗内重建局部血循环显得至关重要，而盐酸法舒地尔具有对缺血性脑血管病的显著神经保护和治疗作用，值得在临床尤其是基层的使用，减少致残率，提高生活质量。

盐酸法舒地尔是日本Asahi Kasei株式会社于20世纪80年代开发的异喹啉磺胺类药物，是一种蛋白激酶RHO抑制物，通过阻断血管收缩过程的最后阶段，也即通过增加肌球蛋白氢链磷酸酶的活性，扩张血管(抑制血管痉挛)，降低内皮细胞的张力，发挥药效，从而改善脑组织微循环，不产生和加重脑的盗血。其临床上主要用于改善和预防蛛网膜下腔出血后的脑痉挛及引起的脑缺血症状，同时还可保护神经抗凋亡，促进神经再生。盐酸法舒地尔作为高效的血管扩张药物，可以有效缓解脑血管痉挛，是一种具有广泛药理作用的新型药。高哌嗪是盐酸法舒地尔合成工艺中用到的一种原料，同时也是盐酸法舒地尔的降解杂质，《中国药典》2020年版二部，盐酸法舒地尔注射液有关物质检查项下，该色谱系统检不到高哌嗪，即现行标准没有对高哌嗪杂质进行控制。

现有技术中已有文献报道采用气相色谱法对盐酸法舒地尔中的高哌嗪含量进行检测，试验操作繁琐、耗时；检测灵敏度和检测限低、对检测仪器、色谱柱选择性不好，色谱柱易损耗；回收率不好、耐用性不好；同时存在稳定性与准确度较差的问题，导致结果无法反映高哌嗪的真实含量，进而无法对盐酸法舒地尔的质量进行控制。

因此，开发一种改进的用于盐酸法舒地尔注射液中高哌嗪的检测方法，试验操作简单，检测灵敏度和检测限高，对检测仪器、色谱柱选择性好，色谱柱不易损耗，回收率好，耐用性好，稳定性与准确度高，能够反映高哌嗪的真实含量，进而可以对盐酸法舒地尔的质量进行控制，就成为该技术领域急需解决的技术难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改进的用于盐酸法舒地尔注射液中高哌嗪的检测方法，试验操作简单，检测灵敏度和检测限高，对检测仪器、色谱柱选择性好，色谱柱不易损耗，回收率好，耐用性好，稳定性与准确度高，能够反映高哌嗪的真实含量，进而可以对盐酸法舒地尔的质量进行控制。

本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：

一种改进的用于盐酸法舒地尔注射液中高哌嗪的检测方法，其步骤如下：

(1)液相色谱仪的色谱条件：

柱温：10℃～50℃；

流动相：三氟乙酸和乙腈的混合液；

检测波长：激发波长310-350nm；发射波长500-560nm；

流速：0.5ml/min～1.5ml/min；

(2)供试品溶液的配制：移取供试品溶液，置容器中，加水定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液；

(3)对照品溶液的配制：称取高哌嗪溶液，置容器中，加水定容至刻度，摇匀，摇匀，得对照品溶液；

丹磺酰氯溶液：称取丹磺酰氯，置量瓶中，加乙腈超声溶解，并定容至刻度摇匀，得丹磺酰氯溶液；

碳酸钠缓冲液：称取碳酸钠，碳酸氢钠，加水，混匀，用氢氧化钠调至pH至11.00-12.10；

甲胺盐酸盐溶液：称取甲胺盐酸盐，置量瓶中，加水溶解，并定容至刻度，摇匀，得甲胺盐酸盐溶液；

(4)溶液量取

精密量取空白溶液(水)、空辅溶液、供试品溶液与对照溶液，分别置于量瓶中，加入碳酸钠缓冲液和丹磺酰氯溶液，水浴，加热，取出，放冷，加入甲胺盐酸盐溶液，再次水浴，取出，放冷，过滤；

(5)测定

精密量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，按内标法以峰面积计算。

优选地，步骤(1)中，所述柱温为30℃。

优选地，步骤(1)中，所述流速为1.0ml/min。

优选地，步骤(1)中，所述流动相：0.1％三氟乙酸：乙腈(55:45)。

优选地，步骤(1)中，所述激发波长330nm；发射波长530nm。

优选地，步骤(1)中，所述色谱柱为Agilent zorbax Eclipse xdb-C8 4.6*250mm5μm(AN-HC143)。

优选地，步骤(3)中，对照品溶液的浓度为0.6μg/ml。

优选地，步骤(3)中，丹磺酰氯溶液的浓度为9μg/ml。

优选地，步骤(3)中，甲胺盐酸盐溶液的浓度为20mg/ml。

优选地，步骤(3)中，用氢氧化钠调至pH至11.50。

优选地，步骤(5)中，水浴60℃，加热，1小时后，取出，放冷，加入甲胺盐酸盐溶液，再次水浴15分钟，取出，放冷，过滤。

优选地，步骤(5)中，稀释剂为注射用水。

优选地，步骤(5)中，结束时间为30分钟。

有益效果：

本发明的改进的用于盐酸法舒地尔注射液中高哌嗪的检测方法，试验操作简单，检测灵敏度和检测限高，对检测仪器、色谱柱选择性好，色谱柱不易损耗，回收率好，耐用性好，稳定性与准确度高，能够反映高哌嗪的真实含量，进而可以对盐酸法舒地尔的质量进行控制。

下面通过附图和具体实施例对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。

附图说明

图1是本发明实施例1中空白辅料图谱。

图2是本发明实施例1中对照溶液图谱。

图3是本发明实施例1供试品溶液图谱。

图4是对比例1中空白溶剂图谱。

图5是对比例1中对照品溶液定位图谱。

图6是对比例1中内标物质溶液图谱。

图7是对比例1中供试品溶液图谱。

具体实施方式

除非特别说明，本发明实施例中所用原料、助剂或设备均为市场上可购之产品，其型号为本领域常规之型号；所用测试方法均为本领域的常规方法。

实施例1

一种改进的用于盐酸法舒地尔注射液中高哌嗪的检测方法，其步骤如下：

(1)溶液配制

空辅溶液：精密移取空辅溶液1ml，置50ml量瓶中加水定容支刻度，摇匀；

供试品溶液：精密移取1ml供试品溶液，置50ml量瓶中，加水定容至刻度，摇匀；

对照溶液：称取高哌嗪溶液30mg，置100ml量瓶中，加水定容至刻度，摇匀；再精密移取上述溶液2ml，置100ml量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，再精密移取上述溶液5ml置50ml量瓶中，加水定容至刻度，摇匀(0.6μg/ml)；

丹磺酰氯溶液：称取丹磺酰氯900mg，置100ml量瓶中，加乙腈超声溶解，并定容至刻度摇匀(9μg/ml)；

碳酸钠缓冲液：称取碳酸钠1g，碳酸氢钠0.1g，加水100ml，混匀，用氢氧化钠调至pH至11.50；

甲胺盐酸盐溶液：称取甲胺盐酸盐2g，置100ml量瓶中，加水溶解，并定容至刻度，摇匀(20mg/ml)；

(2)溶液量取

精密量取空辅溶液、供试品溶液与对照溶液各1ml，分别置于20ml量瓶中，加入1ml碳酸钠缓冲液和5ml丹磺酰氯溶液，水浴60℃，加热1小时(15min振摇一次)，1小时后，取出，放冷，加入1ml甲胺盐酸盐溶液，水浴15分钟，取出，放冷，过滤；

(3)色谱条件见下表1：

表1

(4)检测

精密量取空辅溶液、供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入色谱仪，照上述色谱条件分析，记录色谱图。

本发明的验证研究内容：

1、专属性

表2

如图1所示，是本发明实施例1中空白辅料图谱；空辅溶液在主峰出峰位置基线平稳，没有空白峰的干扰。

如图2所示，是本发明实施例1中对照溶液图谱，对照品出峰时间约21分钟，出峰时间适宜，峰形好，拖尾因子小，且没有溶剂和辅料峰干扰。

如图3所示，是本发明实施例1中供试品溶液图谱，供试品溶液0h中未检出杂质高哌嗪。

2、线性范围

表3：线性范围试验结果

高哌秦在0.12-0.85μg/ml范围内与其峰面积成显著线性关系，线性方程y＝34530.2814x-988.0690，相关系数r＝0.9998；符合线性范围研究的要求；

3、定量限

表4：定量限结果

实验结论：定量限信噪比均大于10，RSD％小于10％符合要求。

4、准确度

表5：高哌嗪回收率溶液测试结果

实验结论：回收率均在80.0％-120.0％间，RSD(n＝9)均小于10％，符合要求，证明该方法准确度良好。

5、溶液稳定性：

表6：稳定性结果统计表

供试品溶液在24小时内均未检测出高哌嗪，说明供试品溶液在24小时内稳定。对照溶液在七天内峰面积RSD小于5％，说明对照溶液在七天内稳定。

6、方法耐用性试验

表6：供试品溶液耐用性结果统计表

在耐用性变动条件下，因是衍生化反应，操作难度大，供试品溶液检出的含量均在在80-120％的范围之间，说明本方法的耐用性良好。

对比例1

用于盐酸法舒地尔注射液中高哌嗪的气相色谱检测方法，其步骤如下：

(1)溶液配制

溶剂：0.1mol/L氢氧化钠溶液-N，N-二甲基甲酰胺(2：8)(如出现混浊可用滤膜过滤)；

内标溶液：取正辛醇，加溶剂溶解并稀释制成1.5mg/ml内标贮备液；再精密量取内标贮备液适量，加溶剂稀释制成0.15mg/ml内标溶液；

供试品溶液：精密量取本品20ml，置蒸发皿中，70℃水浴蒸干；称取氢氧化钠0.4g，置烧杯中；将蒸发皿中的供试品，用0.15mg/ml内标溶液3ml，分次转移至烧杯中，超声10分钟，静置20分钟，取上清液；

对照品溶液：取高哌嗪对照品100mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，再精密量取上述溶液5ml，置50ml容量瓶中，加内标贮备液5ml，加溶剂稀释至刻度，摇匀；

(2)色谱条件见下表7

表7

(3)测定

精密量取溶剂、内标溶液、高哌嗪定位溶液、对照品溶液和供试品溶液各1μl，分别注入气相色谱仪，记录色谱图。

验证研究内容：

1、专属性

表8：专属性结果

如图4所示，是对比例1中空白溶剂图谱；专属性研究结果显示，空白色谱图基线不稳，同时进样2次，图谱基线飘、不稳定；

如图5所示，是对比例1中对照品定位图谱；高哌嗪定位溶液反复进样，有时不出峰；峰面积相对标准偏差较大，且基线不稳定。

如图6所示，是对比例1中内标物质图谱；内标物质对照品基线不稳定。

如图7所示，是对比例1中供试品溶液图谱；

表9：对照品图谱数据表

对照品定位图谱中，保留时间为7.7min左右为高哌嗪色谱峰，峰形不好看，理论塔板数低，拖尾因子大。

2、对照品溶液重复性试验

表10：对照品溶液重复性试验结果

结论：对照品溶液重复进样6次，高哌嗪的峰面积的RSD％值为23.04％，内标物质的RSD％值为5.89％，均大于2.0％的规定，重复性不符合要求，且显示本方法耐用性不好。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。