一种体外促进浆细胞生成或促进幼稚B细胞向浆细胞分化的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种体外促进浆细胞生成或促进幼稚B细胞向浆细胞分化的方法，通过不同浓度GABA和PBS在体外和体内处理未免疫B细胞和免疫B细胞相关实验，发现与空白对照组相比，GABA 1mmol·L‑1处理组和GABA 2mmol·L‑1处理组均显著促进幼稚B细胞向CD138+浆细胞分化。与未免疫组相比，免疫+PBS组脾生发中心B细胞百分比增加，总浆细胞和IgG1+浆细胞百分比增加；骨髓中抗原特异性浆细胞百分比增加；血清中抗原特异性抗体水平升高。与免疫+PBS组相比，免疫+GABA组总浆细胞和IgG1+浆细胞百分比增加；骨髓中抗原特异性浆细胞百分比增加；血清中抗原特异性抗体水平升高。神经递质GABA显著促进浆细胞的百分比及高亲和力抗体的生成。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种体外促进浆细胞生成或促进幼稚B细胞向浆细胞分化的方法及其应用。

背景技术

高亲和力的中和型抗体是机体有效抵抗病原生物的重要武器，也是绝大多数疫苗发挥作用的基础。生发中心是机体遇到抗原刺激发生免疫反应时，在外周淋巴器官(如脾脏)或淋巴结中短暂存在的特定结构，是B淋巴细胞克隆增殖和亲和力成熟的场所，在此最终筛选出能产生高亲和力抗体的浆细胞。目前，对于生发中心的调控研究主要集中在B细胞与滤泡辅助性T细胞(Follicular helper T，Tfh)及滤泡树突状细胞(Follicle dendriticcell，FDC)互作方面，着重阐述Tfh及FDC如何通过分泌细胞因子及细胞表面的配体受体结合调控B细胞成熟、生发中心形成、抗体类型转换和体细胞超突变等功能。而越来越多的研究表明，神经系统和免疫系统联系紧密，且存在交互信息传递。近年来，研究发现人的Tfh能分泌多巴胺作用于B细胞，促进生发中心反应。也有研究发现腺苷酸通过作用于Tfh上的腺苷酸受体，抑制Tfh分化和生发中心B细胞形成。最近，还有研究发现一条大脑-脾脏的神经-免疫调控轴，通过去甲肾上腺素及乙酰胆碱等递质，促进浆细胞的生成和疫苗接种引起的抗体免疫应答。

GABA是一种重要的抑制性神经递质，具有降血压、促进乙酰胆碱合成和促进生长激素分泌等多种生理功能。GABA主要通过GABA受体及GABA转运体等发挥效能，已报道其作用于巨噬细胞和T细胞行使免疫调节功能，如GABA通过GAT2改变细胞代谢方式从而调控M1型巨噬细胞极化，GABA转运体Slc6a13缺乏能促进肠道感染时Th17细胞的分化等。

抗体是由B细胞分化成的浆细胞分泌的，但由于B细胞在体外培养时极易凋亡，长期以来，其分化体系一直是领域内关注的热点和难点。2011年，日本的Takuya Nojima教授实验室改造BALB/c小鼠3T3细胞系，使其稳定表达小鼠的CD40L和BAFF分子，称为40LB细胞，将其作为B细胞的饲养层细胞，才使B细胞长期体外培养和分化得以实现，但该体系浆细胞的分化比例较低。在此基础上，2016年美国的Garnett Kelsoe实验室进一步改造40LB细胞，使其稳定表达小鼠的IL-21得到NB-21细胞，建立了目前最为公认的B细胞分化成浆细胞的体外体系，但该体系需要进一步优化。虽然之前已有如下相关报道，GABA通过抑制T细胞增殖和细胞因子释放从而阻碍其发挥作用；GABA能对抗原递呈细胞(APCs)有直接作用，可以通过GABA(A)受体和MAPK磷酸化来调节APCs的功能，进而抑制适应性免疫应答；GABA可以通过影响细胞运动机制来活化树突细胞(DCs)，但关于GABA能否调控B细胞分化和抗体生成，起到进一步优化B细胞分化成浆细胞的体外体系，增加抗体的产量和亲和性，仍是空白，值得深入研究。

发明内容

本发明提供了一种体外促进浆细胞生成或促进幼稚B细胞向浆细胞分化的方法，所述方法包括使用GABA受体激动剂刺激幼稚B细胞。

进一步，所述浆细胞包括总浆细胞、IgG1+浆细胞、骨髓中抗原特异性浆细胞、脾脏中抗原特异性浆细胞。

可选的一种方式，所述方法包括如下步骤：

1)培养幼稚B细胞；

2)将GABA受体激动剂加入培养体系，使其与幼稚B细胞共培养；

3)收集纯化浆细胞。

进一步，所述幼稚B细胞包括未免疫的幼稚B细胞，免疫后幼稚B细胞。

未免疫的幼稚B细胞是指没有经过抗原刺激的幼稚B细胞，包括商业购买的幼稚B细胞以及从动物体内获取的幼稚B细胞。

免疫后幼稚B细胞是指经过抗原刺激后的幼稚B细胞，可通过抗原免疫动物后获取动物体内的幼稚B细胞。

进一步，所述培养体系中包括饲养层细胞、诱导分化因子。

进一步，所述饲养层细胞是NB-21。

进一步，所述诱导分化因子是IL-4。

进一步，所述GABA受体激动剂包括巴氯芬、GABA。

进一步，GABA的作用浓度为1-2mmol·L-1。

进一步，GABA作用时间为5天。

进一步，巴氯芬的作用浓度为10μM。

进一步，所述方法包括如下步骤：

1)12孔板中培养NB-21饲养层细胞；

2)加入2μg·L-1小鼠IL-4，重悬幼稚B细胞；

3)小心移除NB-21饲养层细胞的培养基，每孔加入2ⅹ10

可选的另一种方式，所述方法包括如下步骤：

1)抗原免疫动物；

2)给步骤1)获得的免疫动物施用GABA受体激动剂；

3)收集免疫动物产生的抗原特异性抗体。

进一步，所述方法包括如下步骤：

1)抗原免疫动物；

2)给步骤1)获得的免疫动物腹腔注射GABA受体激动剂；

3)收集免疫动物产生的抗原特异性抗体。

进一步，所述方法包括如下步骤：

1)抗原免疫动物；

2)抗原免疫动物当天开始，给步骤1)获得的免疫动物每天腹腔注射GABA受体激动剂12天；

3)至少第13天收集免疫动物产生的抗原特异性抗体。

进一步，GABA受体激动剂为GABA，每天腹腔注射20mg·kg

进一步，收集免疫动物产生的抗原特异性抗体为从动物血清中收集。

本发明还提供了一种促进抗原特异性抗体生成的方法，所述方法包括如下步骤：

1)抗原免疫动物；

2)给步骤1)获得的免疫动物施用GABA受体激动剂；

3)收集免疫动物产生的抗原特异性抗体。

进一步，所述方法包括如下步骤：

1)抗原免疫动物；

2)给步骤1)获得的免疫动物腹腔注射GABA受体激动剂；

3)收集免疫动物产生的抗原特异性抗体。

进一步，所述方法包括如下步骤：

1)抗原免疫动物；

2)抗原免疫动物当天开始，给步骤1)获得的免疫动物每天腹腔注射GABA受体激动剂12天；

3)至少第13天收集免疫动物产生的抗原特异性抗体。

进一步，GABA受体激动剂为GABA，每天腹腔注射20mg·kg

进一步，收集免疫动物产生的抗原特异性抗体为从动物血清中收集。

本发明还提供了GABA受体激动剂在制备促进浆细胞生成或促进幼稚B细胞向浆细胞分化的试剂中的应用。

进一步，所述浆细胞包括总浆细胞、IgG1+浆细胞、骨髓中抗原特异性浆细胞、脾脏中抗原特异性浆细胞。

进一步，所述GABA受体激动剂包括巴氯芬、GABA。

本发明还提供了GABA受体激动剂在制备促进抗原特异性抗体生成的试剂中的应用。

进一步，所述GABA受体激动剂包括巴氯芬、GABA。

本发明的术语“饲养层细胞”释放出一些必要的生长因子，减小培养瓶，其来源包括动物体内天然的细胞和经过处理的静息的肿瘤细胞，比如：①腹腔巨噬细胞，其制备方法是：杀死小鼠，用酒精浸泡数分钟，取出小鼠放在解剖板上，用大头针固定好四肢，在超净台上用一个摄子挑起腹部皮肤，用手术剪刀剪开腹部皮肤，换一把干净摄子夹住腹膜，用另一把摄子桶破腹膜，用巴氏管向腹腔内加两至三管不完全培养基，吹打几次，吸出培养基，吸出的培养基里即含有腹腔巨噬细胞，反复进行两至三次即可基本取彻底。将取出的细胞1200RPM离心5min，去掉上清，向沉淀中加入适量的完全培养基(用于刚融合的细胞需要加HAT，用于克隆化的细胞需要加HT)，用巴氏管反复吹打均匀，可用血球计数板计数(一般一只老鼠的腹腔巨噬细胞约为3x100个)。根据计数的结果将巨噬细胞稀释到合适的浓度(以96孔板为例，平均每孔含1x104个巨噬细胞为宜)，稀释好后，用巴氏管吸取此饲养层细胞按合适的体积滴到96孔板或24孔板上(平均每只老鼠的腹腔巨噬细胞可铺两至三块96孔板)。饲养层细胞应在使的前一天制备好，这样才能分泌足够的细胞因子。②脾脏细胞，其制备方法是：杀死小鼠，用酒精浸泡数分钟，取出小鼠放在解剖板上，用大头针固定好四肢，在超净台上用一个摄子挑起腹部皮肤，用手术剪刀剪开腹部皮肤，换一把干净摄子夹住腹膜，用另一把摄子桶破腹膜，取出脾脏，用银子剥去脾脏外的结缔组织，将脾脏放在200目不锈刚细胞筛网上，用5ml注射器的针芯挤压脾脏，使分散的脾细胞通过筛网落入下面的容器(培养皿)，用少量不完全培养基冲洗、吹匀脾细胞，收集离心，计数稀释同腹腔巨噬细胞制备过程，一只老鼠的脾脏细胞总数约为2x108-3x108个，以96孔为例，每孔需要约1x105个脾细胞。③胸腺细胞，其制备方法是：杀死小鼠，用酒精浸泡数分钟，取出小鼠放在解剖板上，用大头针固定好四肢，在超净台上用一个摄子挑起胸部皮肤，用手术剪刀剪开胸部皮肤，换一把干净摄子夹住胸膜，用另一把摄子桶破胸膜，取出胸腺，用银子剥去胸腺外的结缔组织，将胸腺放在200目不锈刚细胞筛网上，用5ml注射器的针芯挤压胸腺，使分散的胸腺细胞通过筛网落入下面的容器(培养皿)，用少量不完全培养基冲洗、吹匀胸腺细胞，收集离心，计数稀释同腹腔巨噬细胞制备过程，以96孔为例，每孔需要约5x105个胸腺细胞。④放射线照射的成纤维细胞系，其制备方法是：将NIH3T3细胞传代至细胞培养瓶，密度不超过50％，用新鲜培养基培养24小时，用胰酶消化下来，用培养基重基至2-4x100个细胞/ml，用剂量为6000rad左右的60Co y射线照射，换用新鲜的完全培养基稀释至需要的浓度(以96孔板为例，每孔需要约2x104个细胞)滴在培养板里，此过程需要在使前12小时进行。除了NIH3T3细胞外，还可以使用STO细胞系或者MEF细胞系制备这种词养层。若60Co不具备，可做以下处理：将NIH3T3细胞传代至细胞培养瓶，密度不超过50％，用新鲜的培养基培养24小时，向培养基中加入丝裂霉素C至终浓度为10pg/ml，继续培养12小时，弃去培养基，用新鲜的培养基洗涤三次，最后一次洗涤放在37℃进行10-20min，将洗好的细胞用胰酶消化下来，用完全培养基重悬至合适浓度滴在培养板里(以96孔板为例，每孔需要约2x104个细胞)，此过程也应在使用前12小时进行。注意：一定要洗干净丝裂霉素C，否则严重影响杂交瘤细胞的生长。需要指出的是，饲养层并不是培养杂交瘤细胞一定必须的，但是它确实可以在很大程度上提高细胞的成活率、加快细胞生长速度，因此强烈推荐使用饲养层。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了GABA可以通过促进幼稚B细胞分化成浆细胞进而促进抗原特异性抗体产生，上述研究成果提供了一种新的促进浆细胞分化以及促进抗体产生的方法，该方法可用于工业制备高产量的浆细胞以及制备高产量的抗体。

附图说明

图1显示脾脏中幼稚B细胞和生发中心B细胞表达GABA受体Gabbr1水平的图；

图2显示流式分选出幼稚B细胞、生发中心B细胞(Fas

图3显示幼稚B细胞、生发中心B细胞和浆细胞表达GABA受体Gabbr1和其它受体及转运体水平的图；

图4显示B细胞纯度结果图；

图5显示在饲养层细胞NB-21和诱导分化因子IL-4培养下，浆细胞随时间的百分比变化的图；

图6显示不同GABA浓度下，IgG1+GL7+生发中心B细胞百分比变化，其中A是实验结果图，B是数据统计图；

图7显示不同GABA浓度下，CD138

图8显示NP-KLH免疫13天后，脾脏生发中心B细胞和浆细胞流式分析圈门策略图；

图9显示未免疫组、免疫组+PBS和免疫组+GABA三种实验条件下，生发中心B细胞数量变化，A是实验结果图，B是数据统计图；

图10显示未免疫组、免疫组+PBS和免疫组+GABA三种实验条件下，浆细胞和IgG1

图11显示NP-KLH免疫27天后，骨髓中NP

图12显示未免疫组、免疫组+PBS和免疫组+GABA三种实验条件下，骨髓中NP+IgM-浆细胞百分比的统计图；

图13显示未免疫组、免疫组+PBS和免疫组+GABA三种实验条件下，NP特异性IgG抗体滴度变化的图；

图14显示在对照组、1μM的巴氯芬、10μM的巴氯芬三种体外分化实验条件下，浆细胞的百分比变化，其中A是实验结果图，B是数据统计图；

图15显示NP-KLH免疫小鼠模型中，在PBS、巴氯芬两种实验条件下，生发中心B细胞比例变化，其中A是实验结果图，B是数据统计图；

图16显示NP-KLH免疫小鼠模型中，在PBS、巴氯芬两种实验条件下，浆细胞比例变化，A是实验结果图，B是数据统计图；

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

所述实施例中使用的动物、试剂和仪器如下：

C57BL/6小鼠(动物许可证号SCXK(京)2016-0011)，北京维通利华实验动物技术有限公司；胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)，美国Gibco公司；DMEM培养基、RPMI 1640培养基、青霉素-链霉素双抗、丙酮酸钠、HEPES、胰蛋白酶、非必需氨基酸、EDTA，中科迈晨(北京)生物科技有限公司；Prime Script RT Master Mix，日本TaKaRa公司；红细胞裂解液和铝佐剂，美国Thermo Fisher Scientific公司；绵羊红细胞SRBC，郑州百基生物科技有限公司；乙酰化4-羟基-3硝基苯基偶联钥孔血蓝蛋白(4-Hydroxy-3-nitrophenylacetylconjugated to Keyhole limpet hemocyanin，NP-KLH)、乙酰化4-羟基-3硝基苯基偶联牛血清蛋白(4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl conjugated to Bovine serum albumin，NP

CO

实施例1筛查和检测B细胞上神经递质GABA受体

1、B细胞转录组数据分析

为了分析小鼠脾脏幼稚B细胞和生发中心B细胞上神经递质受体表达，我们分析了Rathan Joy Komban等人在2019年Nature Communications杂志发表的研究论文的附加原始转录组数据，该数据已经上传至https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc＝GSE129103。通过生物信息学方法，分析B细胞上神经递质受体表达。

2、流式分选绵羊红细胞免疫小鼠的幼稚B细胞、生发中心B细胞和浆细胞

腹腔注射1x10

3、RT-qPCR检测幼稚B细胞、生发中心B细胞、浆细胞上GABA受体和转运体mRNA的表达

使用TRIzol法提取幼稚B细胞、生发中心B细胞、浆细胞总RNA，使用Prime ScriptRT Master Mix(TaKaRa)反转录试剂盒合成cDNA，配制体系为cDNA500ng、5 ⅹ PrimeScript Mix 2μL、DEPC水补充至10μL；按照Power Up SYBR Green Master Mix(AB)试剂盒使用方法进行荧光定量PCR检测。PCR引物均由Primer Bank网站进行设计，引物序列见表1，由生工生物科技有限公司合成。RT-qPCR结束后，以GAPDH作为内参基因，利用ΔΔCt法计算相关基因的相对表达量。

表1引物序列

4、结果

通过分析已知B细胞数据库，发现脾脏中幼稚B细胞和生发中心B细胞均高表达GABA受体Gabbr1(图1)。我们利用流式分选出幼稚B细胞、生发中心B细胞(Fas

实施例2神经递质GABA促进浆细胞的体外分化

1、B细胞体外分化体系及GABA浓度

NB-21细胞培养基由DMEM基础培养基添加10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素双抗和1％非必需氨基酸配制而成。当NB-21细胞扩增到90％密度时，用胰蛋白酶消化，离心收集的细胞用台盼蓝染色统计活细胞数，12孔板每孔铺1x10

2、结果

2.1 B细胞体外分化体系的建立

经磁珠分选后，B细胞纯度达到91.8％(图4)。将其加入到NB-21饲养层细胞上进行体外培养，并添加IL-4诱导B细胞分化，前五天浆细胞百分比逐渐升高至38.6％，第六天开始减少(图5)。

2.2神经递质GABA促进浆细胞的体外分化

如图3所示，B细胞体外分化过程中加入不同浓度GABA后，与对照组相比，GABA不影响IgG1

实施例3神经递质GABA促进浆细胞的体内分化

1、小鼠免疫以及GABA注射

小鼠随机分为三组：未免疫组、免疫+PBS组和免疫+GABA组，未免疫组7只、免疫+PBS组和免疫+GABA组各16只。将溶好的1g·L

2、流式细胞术分析

2.1流式细胞术分析脾生发中心B细胞、总的浆细胞和IgG1

腹腔NP-KLH免疫小鼠后第13天颈椎脱臼处死。研磨小鼠脾脏，制备单细胞悬液，裂解红细胞后调整细胞密度为5ⅹ10

1)脾生发中心B细胞染色方案：PerCP标记大鼠抗小鼠B220抗体1μg，APC标记大鼠抗小鼠GL7抗体0.5μg，PE-Cy7标记小鼠抗小鼠Fas抗体0.5μg死活染料Fixable ViabilityDye eFluor

2)脾总的浆细胞及IgG1

2.2流式细胞术分析骨髓NP

免疫后第27天处死小鼠，剪取小鼠一侧股骨，用1mL注射器吸FACS缓冲液刺入关节处，将骨髓细胞冲至1.5mL EP管，裂解红细胞后调整细胞密度为1ⅹ10

3、ELISA检测小鼠血清中抗原特异性IgG抗体

腹腔NP-KLH免疫小后第13天小鼠眼球取血，未免疫组、免疫+PBS组和免疫+GABA组各取脾浆细胞百分比平均值附近3只鼠的血清，通过ELISA检测各组血清中抗原特异性IgG抗体，具体操作按照2020年Nature中的方法进行。

4、统计学分析

利用Flowjo10分析流式细胞检测的源文件，分析分化过程中不同阶段B细胞所占B细胞总数的比例，并用流式等高线图和散点图展示。使用GraphPad Prism8.0软件作图并对数据进行统计学分析，两组数据之间进行比较采用非配对t检验进行显著性检验，三组及三组以上数据之间进行比较采用ANOVA进行显著性检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

5、结果

5.1体内注射GABA促进浆细胞的百分比

NP-KLH免疫13天后，流式细胞术检测脾脏生发中心B细胞和浆细胞的百分比，圈门策略如图8所示。流式分析结果显示，与未免疫组相比，免疫+PBS组小鼠生发中心B细胞百分比明显增高(P<0.01)，浆细胞百分比也明显升高(P<0.05)，提示抗原免疫小鼠成功。抗原免疫后，与注射PBS相比，注射GABA对小鼠生发中心B细胞形成无影响(图9A，图9B)，但显著促进了浆细胞的百分比(P<0.01)和IgG1

5.2体内注射GABA能促进骨髓中抗原特异性浆细胞的百分比

NP-KLH免疫27天后，流式细胞术检测骨髓中NP

5.3体内注射GABA能促进高亲和力抗体的生成

如图13所示，与未免疫组相比，免疫+PBS组小鼠血清中NP特异性抗体明显升高(P<0.01)，且免疫+GABA组的小鼠NP特异性IgG抗体水平显著高于免疫+PBS组(P<0.01)。

实施例4 GABA受体激动剂促进浆细胞体外分化

1、实验步骤

已知GABAB受体与广泛的神经和精神疾病有关，如癫痫、痉挛、压力、睡眠障碍、神经性疼痛、抑郁和焦虑和药物成瘾。巴氯芬(baclofen)是Gabbr1受体激动剂，具有麻醉、解痉和抗癫痫等作用，目前已经应用于临床治疗。为了验证GABA的效应和初步探索GABA作用于B细胞的机制，我们在B细胞分化过程中加入不同浓度的巴氯芬，第五天收集B细胞流式分析浆细胞分化的比例。

2、结果

如图14A和14B所示，与GABA促进浆细胞体外分化的表型一致，体外添加10μM的巴氯芬也能显著促进浆细胞的分化。

实施例5体内注射Gabbr1受体激动剂显著促进浆细胞的生成

1、实验步骤

为了进一步验证GABA通过Gabbr1受体发挥作用，我们接下来准备检测Gabbr1受体激动剂在体内对浆细胞生成的影响。首先，我们对小鼠腹腔注射100μg NP-KLH抗原，免疫后每天腹腔注射一次PBS或baclofen，13天后流式分析脾脏生发中心B细胞和浆细胞的比例。

2、结果

如图15A、15B、16A和16B所示，与注射GABA实验结果一致，注射baclofen后不影响脾脏生发中心B细胞比例，但显著性增加了浆细胞的生成，提示GABA可能通过Gabbr1发挥作用，促进浆细胞的生成。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种体外促进浆细胞生成或促进幼稚B细胞向浆细胞分化的方法及其应用

<141> 2022-04-28

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