鞘氨醇在制备治疗继发性炎症损伤的药物中的应用

摘要

本发明属于生物医药技术领域，具体公开了鞘氨醇在制备继发性炎症损伤的药物中的应用。本发明在动物实验水平上研究发现鞘氨醇可以降低脊髓损伤中炎症因子和促炎因子的释放，提高脊髓损伤中神经元的存活率，保护脊髓的结构完整性并促进损伤后运动功能的恢复，表明鞘氨醇可用来制备对抗脊髓损伤中由巨噬细胞参与的继发性炎症损伤的药剂，保护机体功能并促进恢复，具有较大的应用前景。

说明书

本申请是申请日为2018年11月07日、申请号为201811320385.4、发明名称为《鞘氨醇在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用》的分案申请。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，更具体地，涉及鞘氨醇在制备治疗继发性炎症损伤的药物中的应用。

背景技术

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是由多种原因造成的脊髓结构完全或不完全的伤害，主要表现是功能细胞凋亡而导致的损伤节段以下的肢体感觉、运动、自主神经功能障碍。脊髓损伤具有发病人群年龄低、发生率高、致残率高、花费大等特点，患者在漫长的治疗和康复过程中需要耗费巨大的社会资源，脊髓损伤现已成为全球性的医疗难题，研究脊髓损伤的治疗康复具有重要的临床意义。

脊髓原发性机械损伤造成的炎症微环境可引起继发性损伤，病理过程分为不可逆的原发性损伤和可逆的继发性损伤。原发性损伤当时便产生椎管完整性的破坏、脊髓占位性压迫、血管痉挛、神经细胞凋亡等不可逆转的病理创伤。继发性损伤主要是骨髓来源的巨噬细胞(Bone-marrow derived macrophages， BMDM)在趋化因子作用下浸润于出血-缺血再灌注损伤的扩散区域，BMDM可引发脊髓损伤的神经炎症，造成脱髓鞘变、神经胶质细胞的增生，组织水肿和脊髓空洞。

根据损伤时间分期，脊髓损伤由急性期、亚急性期、慢性期三期构成，急性期以原发性损伤为主，亚急性期以继发性的炎症损伤为主，慢性期可在炎症中心形成脊髓空洞和胶质瘢痕。整个病理过程通过出血、缺血再灌注、氧化自由基、一氧化氮系统的紊乱等原发性和继发性的损害相互作用，出现脊髓的脱髓鞘和变性、神经元坏死和凋亡，最终引发机体的自主神经、感觉、运动和反射功能的障碍。继发性损伤是可逆的，因此研究如何降低炎症损害有望减弱脊髓的继发性损伤从而改善损伤后脊髓的功能恢复。

然而现有脊髓损伤的治疗方法多是早期的大剂量激素冲击，且脊髓损伤的药物治疗在控制继发性炎症损伤和保护脊髓结构功能上不太理想，没有专门针对继发性炎症损伤的药物。

鞘氨醇(sphingosine)可合成神经酰胺，而神经酰胺在神经酰胺酶作用下生成鞘氨醇，鞘氨醇通过鞘氨醇激酶SPHK1和SPHK2磷酸化生成鞘氨醇磷酸酯 (Sphingosine-1-phosphate，S1P)，S1P是磷脂代谢的重要代谢产物。胞内的 S1P可通过自分泌或旁分泌与细胞膜上S1PR1～S1PR5等5种S1P受体结合，由此来调节心血管和神经系统的稳态，与自身免疫性疾病、炎症性疾病及肿瘤也密切相关。但是，目前还未有鞘氨醇在脊髓损伤尤其是继发性脊髓损伤治疗中的相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中继发性脊髓损伤治疗存在的缺陷和不足，提供一种用于治疗继发性脊髓损伤的治疗药物-鞘氨醇。

本发明的第一个目的是提供鞘氨醇在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用。

本发明的第二个目的是提供一种用于治疗脊髓损伤的药物。

本发明用Lisa脊髓坠击模型仪器(Louisville injury system Apparatus)制作C57小鼠脊髓第10胸段的损伤模型，模拟现实生活中因意外事故造成的脊髓损伤，采用精确的参数制作动物损伤模型；然后分别设置鞘氨醇药物治疗组和 DMSO对照组，对脊髓损伤后的小鼠进行治疗试验。在动物实验水平上发现，在小鼠脊髓损伤后，鞘氨醇药物治疗组的血清和脊髓中促炎因子和炎症因子明显下调，脊髓原发病灶中的促炎因子和炎症因子随时间点的下降趋势比血清更为明显。同时，鞘氨醇在脊髓损伤后对保护脊髓整体结构和神经元存活数量具有积极的作用；鞘氨醇药物治疗组形成的胶质瘢痕不如DMSO对照组的体积大，这提示鞘氨醇对巨噬细胞参与的脊髓损伤慢性期的功能修复有积极作用。另一方面，从运动功能评分中也看出鞘氨醇药物治疗组在4周后其后肢功能在关节负重、步态稳定、协调性步态上恢复良好，充分说明了鞘氨醇可以对抗治疗脊髓损伤中的由巨噬细胞参与的继发性炎症伤害。

因此，鞘氨醇在以下方面的应用均在本发明保护范围内：

鞘氨醇在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用。

鞘氨醇在制备治疗继发性脊髓损伤的药物中的应用。

鞘氨醇在制备治疗脊髓损伤中由巨噬细胞参与的继发性炎症损伤的药物中的应用。

鞘氨醇在制备炎症因子和/或促炎因子的表达抑制剂中的应用；具体地，所述炎症因子和促炎因子为IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-13、IL-12、IL-17、G-CSF、 KC、G-CSF等。

鞘氨醇在制备提高脊髓损伤中神经元存活率的制剂中的应用。

鞘氨醇在制备保护脊髓结构完整性的制剂中的应用。

鞘氨醇在制备脊髓损伤慢性期功能修复的药物中的应用。

本发明还提供一种用于治疗脊髓损伤的药物，所述药物含有鞘氨醇。

优选地，所述鞘氨醇为D-鞘氨醇。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明研究发现鞘氨醇可使炎症因子和促炎因子下调，降低脊髓损伤中炎症因子和促炎因子的释放，且鞘氨醇对保护脊髓整体结构和神经元存活数量具有积极的作用，对抗由巨噬细胞参与的继发性炎症损伤，有助于促进脊髓损伤功能的恢复；因而获得了一种治疗脊髓损伤尤其是继发性脊髓损伤的药物，也公开了鞘氨醇的一种新用途。

附图说明

图1为用Lisa脊髓坠击模型仪器(Louisville injury system Apparatus)制作C57小鼠脊髓第10胸段的损伤模型，在Lisa坠击后T10段的脊髓中央可见明显瘀斑；

图2为T10 SCI损伤后1天、3天、5天、7天脊髓取材后的体式照片，原发性损伤的急性期1～3天内，鞘氨醇(sphingosine)与对照组(DMSO)相比，鞘氨醇治疗组的脊髓损伤更轻，原发性出血形成的瘀斑更小；在继发性损伤的亚急性期5～7天内，鞘氨醇治疗组脊髓的恢复比对照组更快，鞘氨醇组脊髓上的瘀斑消失的更早，脊髓的结构也更趋于连续完整，n＝3；

图3为用Bio-Plex 200悬液芯片系统检测血清及脊髓组织中的细胞因子浓度的示意图；

图4-1和图4-2为在脊髓损伤后不同时间点1天、3天、5天、7天眼球取血分离血清中24种细胞因子的表达；与DMSO对照组相比，IL-1α、IL-1β、IL-6、 IL-13、G-CSF的蛋白水平在鞘氨醇药物治疗组中第7天小鼠的血清中明显下调，而KC的蛋白水平在鞘氨醇药物治疗组中第3天小鼠的血清中明显下调， Student’s t-test，n＝6，*，P<0.05，**，P<0.01；

图5-1～图5-4为在脊髓损伤后不同时间点6小时、12小时、1天、3天、5 天、7天的脊髓原发损伤区域24种细胞因子的表达；与DMSO对照组相比，G-CSF、KC、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17的蛋白水平在鞘氨醇药物治疗组中急性期的6小时至第7天小鼠的脊髓原发损伤区域中均有明显下调，相比血清样本，脊髓中的炎症因子和促炎因子随着时间点的下调表达明显。Student’s t-test，n＝6， *，P<0.05，**，P<0.01；

图6-1～图6-3为T10脊髓节的冠状切片中，NUEN染色阳性标记脊髓灰质， MBP染色阳性标记脊髓白质，但在T10 SCI损伤后灰质形态发生变异，灰质的形态从逐渐缺失到形成空洞，DMSO对照组在炎症中心形成了明显空洞；使用 Nerolucida根据荧光染色重构脊髓结构，从3D重构中可观察到炎症区域的白质形态有缺损，而灰质形态从缺损到形成空洞和胶质瘢痕，DMSO对照组在炎症中心形成了明显空洞，图中为黄色区域；鞘氨醇药物治疗组中神经元的存活率较高，脊髓的结构保持的较为完整，斑痕组织相比DMSO对照组小，且无空洞形成；Student’s t-test，n＝4，*，P<0.05，**，P<0.01；

图7-1～图7-3为在T10脊髓节的冠状切片中，Ibal-1标记炎症细胞—骨髓来源的巨噬细胞和小胶质细胞，用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)标记星形胶质细胞；损伤后两组的骨髓来源的巨噬细胞和小胶质细胞的数量均增加且聚集成团，鞘氨醇的治疗组相比DMSO对照组中炎症细胞的数量和聚集程度轻；使用 Nerolucida根据荧光染色重构脊髓结构，从3D重构的实验结果来看，鞘氨醇药物干预组的GFAP阳性标记的星形胶质细胞明显不如DMSO对照组多，故白色的胶质瘢痕也不如DMSO对照组的体积大，且DMSO对照组在炎症中心形成了明显空洞，图中为黄色区域；鞘氨醇药物治疗组中脊髓的结构保持的较为完整，斑痕组织相比DMSO对照组小，且无空洞形成这可能提示鞘氨醇对脊髓损伤慢性期的功能修复有积极作用；Student’s t-test，n＝4，*，P<0.05，**，P<0.01；

图8为脊髓损伤后的BMS评分，鞘氨醇药物干预组BMS评分明显高于 DMSO对照组；造模当天所有小鼠评分均为0分，损伤后第20天鞘氨醇药物治疗组与DMSO对照组小鼠后肢功能评分出现明显差异并持续到第8周，鞘氨醇药物治疗组第5周达到BMS评分恢复高值并进入平台期一直持续到第八周；two way ANOVA，n＝25***p<0.001.**p<0.005；

图9-1～图9-2为脊髓损伤后28天的Catwalk步态分析，鞘氨醇药物治疗组比DMSO对照组运动协调性恢复的更好；在手术前3天和手术后28天使用 CatWalk步态分析系统检测小鼠的步态；从C57未损伤、鞘氨醇药物治疗组、 DMSO对照组三组小鼠的步态模式中可以看出，在损伤后28天，DMSO对照组小鼠的步态多为乱序，而鞘氨醇药物治疗组小鼠的步态大多为正常协调步态。说明鞘氨醇药物治疗组的小鼠其四肢的协调性恢复得更好；损伤后56天两者的差异性更明显，鞘氨醇药物治疗组的小鼠的协调性恢复的更好。二者存在明显统计学差异；one way ANOVA，***P＜0.001，**p<0.005，n＝10。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

下述实施例中的用到所有实验动物的饲养与管理均在暨南大学动物伦理委员会的指导和批准下实行。使用的C57BL/6J野生型小鼠购自广东省医学实验动物中心都为雌性，7～8周龄，体重20～25g。实验动物饲养在暨南大学医学院实验动物中心的无特定病原体环境，遵循12小时昼夜交替周期，室温保持在 22℃～25℃，湿度维持在55±5％，并保持给予充足的饲料和灭菌饮用水，手术前后6小时禁食禁饮。

下述实施例中的用鞘氨醇购买于SIGMA-ALDRICH，CAS号123-78-4，分子式C18H37NO2，分子量299.49。

实施例1

脊髓第十胸段的坠击损伤模型制备及尾静脉药物注射

一、方法

1、三溴乙醇0.2μL/g使用剂量麻醉老鼠后，对老鼠颈背部剃毛，平放老鼠，背部最高隆起处为T12。由T12向前开切口，约1cm。

2、钝性分离皮肤、筋膜、脂肪垫，将脂肪垫下角剪开，暴露T9、T10。

3、手术刀在T9-T11两侧肌肉的中线上切断肌肉，用剪刀修剪肌肉和韧带，暴露棘突和椎板。用剪刀在T10和T11之间的椎间隙轻轻插入，减去T10的棘突和椎板

4、用镊子夹住老鼠的棘突将其固定于Lisa的固定夹上，固定夹的抓齿深入到脊髓下咬住手术窗口的椎板边缘。将载有老鼠的固定夹安在Lisa的座子上，调整位置，使老鼠的手术窗内的脊髓保持水平。

5、用Lisa进行坠击造模：

(1)set zero level

激光点处于转子托的中心，调整好位置，压下按钮1，start reading后读数稳定，按setzero，压下按钮1，归位完毕。

(2)injure level

拉开转子托，startreading，调整位置，使红灯变绿，使range在zero的范围内，其差值为injure设定为0.4mm，set injury，将转子托归位完毕。

(3)run injury

调整氮气瓶压力为0.4Mpa，读数栏内出现injury读数0.4mm，调整时间旋扭为0.4S，按下run，转子坠下，鼠尾翘起，将鼠放在显微镜下观察，结果如图 1所示，可以看到脊髓因坠击引发的的瘀斑。

6、将鼠从固定夹中取出，将手术窗两侧的肌肉拉起缝合一针，然后将脂肪垫拉下覆盖在肌肉上再缝合一针。若张力过大，肌肉缝合时可行减张缝合，手术窗口过大可缝合2～3针。止血海绵可留在体内不用取出。

7、术后护理，早晚各一次对老鼠进行膀胱按压，术后可每天对老鼠进行皮下注射含止痛药和庆大霉素的生理盐水500μL，一般3～7天持续注射，如果伴有血尿和脓尿，可适当延长护理天数。将鞘氨醇溶解于二甲基亚砜(DMSO)中配置为10mg/mL的储存液，尾静脉注射时用生理盐水将药物浓度稀释为 15μg/100μL，鞘氨醇药物治疗组中每只老鼠每天注射15μg，DMSO对照组中每只老鼠每天注射含同等浓度DMSO的生理盐水100μL。

取T10 SCI损伤后1天、3天、5天、7天脊髓取材后的体式照片，结果如图2所示，在原发性损伤的急性期1～3天内，鞘氨醇治疗组与对照组相比，鞘氨醇治疗组的脊髓损伤更轻，原发性出血形成的瘀斑更小；在继发性损伤的亚急性期5～7天内，鞘氨醇治疗组脊髓的恢复比对照组更快，鞘氨醇组脊髓上的瘀斑消失的更早，脊髓的结构也更趋于连续完整，n＝3。

实施例2

血清及脊髓组织中的细胞因子浓度检测

1、在对小鼠脊髓损伤模型用药后的1天、3天、5天、7天分别对小鼠眼球取血，制备血清样本和脊髓蛋白样品，检测24种细胞因子的表达：

将制备的血清样品和脊髓蛋白样品使用Bio-Plex Pro mouse Cytokine 24-plexAssay试剂盒(10014905，Bio-Rad)在Bio-Plex 200悬液芯片系统和 Bio-Plex Pro II洗涤站(Bio-Rad Laboratories)检测其中的细胞因子含量。试剂盒包含VEGF、EPO、G-CSF、GM-CSF、GRO/KC、M-CSF、MCP-1、MIP-1α、MIP-3α、RANTES、IL-17、INF-γ、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12(p70)、IL-13等23个因子的检测，检测过程如图3所示。

脊髓损伤用药后的1天、3天、5天、7天眼球取血分离血清中24种细胞因子的表达情况如图4-1和图4-2所示，检测结果显示：与DMSO对照组相比，IL-1α、 IL-1β、IL-6、IL-13、G-CSF的蛋白水平在鞘氨醇药物治疗组中第7天小鼠的血清中明显下调，而KC的蛋白水平在鞘氨醇药物治疗组中第3天小鼠的血清中明显下调，Student’s t-test，n＝6，*，P<0.05，**，P<0.01。

2、在对小鼠脊髓损伤模型的6小时、12小时、1天、3天、5天、7天对脊髓原发损伤区域24种细胞因子进行表达检测，检测过程如图3所示。

在脊髓损伤用药后的6小时、12小时、1天、3天、5天、7天的脊髓原发损伤区域24种细胞因子的表达情况情况如图5-1～图5-4所示，与DMSO对照组相比，G-CSF、KC、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17的蛋白水平在鞘氨醇药物治疗组中急性期的6小时至第7天小鼠的脊髓原发损伤区域中均有明显下调，相比血清样本，脊髓中的炎症因子和促炎因子随着时间点的下调表达明显。 Student’s t-test，n＝6，*，P<0.05，**，P<0.01。

上述结果表明，鞘氨醇可使炎症因子和促炎因子下调，降低脊髓损伤中炎症因子和促炎因子的释放。

实施例3

脊髓冰冻切片的免疫荧光染色

1、小鼠灌注取材：小鼠脊髓损伤模型用药第28天，取鼠用1.25％的三溴乙醇麻醉剂以0.2ml/10g的使用剂量进行腹腔麻醉，用碘伏消毒手术取材区。充分暴露胸腔，找到心脏后剪开右心耳，经左心尖插针快速灌注低温的生理盐水来冲洗脉管系统。接着用4％的PFA进行固定，以先快后慢的方式灌注50ml左右的4％的PFA，待小鼠整个身体变的僵硬则灌注成功。从原手术切口进入，显露T10后头尾两个方向扩大创口，以T10的炎症反应区为中心分离出长1cm的脊髓组织，在体视镜下对标本拍照记录样品的大体外观。将统一修剪整齐的脊髓标本置于4％PFA中，置于4℃冰箱内过夜，依次用浓度为20％、30％、40％的蔗糖在4℃冰箱中保存进行梯度脱水，待脊髓标本沉底于40％的蔗糖液体中证明脱水成功，擦去组织表面的液体，在干冰中经包埋剂迅速包埋，放于-80℃中备用。

2、冰冻切片：将包埋的组织块从-80℃超低温冰箱中取出，与刀片一起放在 -20℃冰冻切片机内预适应1小时。机箱温度和刀头温度稳定后，用OCT将脊髓组织固定于钢制冰托上，调整刀头距离和方向以修剪组织块，以15μm的厚度连续切片，并将切片等距的贴片于载玻片上以成数套。切完后于烘片机上37度烘片2小时，不立马使用的切片最好保存于-80℃超低温冰箱中以保证样品的质量。

3、免疫荧光染色：

(1)取出-80冰箱中的脊髓的冰冻切片，在烘片机上37度烘烤1h，防止后续实验脱片；

(2)先用50～60℃的温热PBS洗去组织旁附着的OCT包埋剂，再用常温 PBS冲洗5min共3次；

(3)用0.3％PBST浸泡10min用来通透组织；

(4)用含5％驴血清和3％BSA的0.3％PBST配室温下封组织1h，抑制非特异性背景着色；

(5)一抗孵育(一抗稀释于上面的血清封闭液中)，于4℃冰箱中过夜16 小时；

(6)PBS冲洗5min共3次；

(7)滴加对应一抗种属的荧光二抗和DAPI(二抗稀释在PBS中)，室温孵育2小时；

(8)PBS冲洗5min共3次；

(9)最后于载玻片上滴加150μL的抗荧光淬灭剂，使用盖玻片封片，注意不要产生气泡。

图6-1～图6-3为T10脊髓节的冠状切片中，NUEN染色阳性标记脊髓灰质， MBP染色阳性标记脊髓白质，但在T10 SCI损伤后灰质形态发生变异，灰质的形态从逐渐缺失到形成空洞，DMSO对照组在炎症中心形成了明显空洞。使用 Nerolucida根据荧光染色重构脊髓结构，从3D重构中可观察到炎症区域的白质形态有缺损，而灰质形态从缺损到形成空洞和胶质瘢痕，DMSO对照组在炎症中心形成了明显空洞，图6中为黄色区域。鞘氨醇药物治疗组中神经元的存活率较高，脊髓的结构保持的较为完整，斑痕组织相比DMSO对照组小，且无空洞形成。Student’s t-test，n＝4，*，P<0.05，**，P<0.01。

图7-1～图7-3为在T10脊髓节的冠状切片中，Ibal-1标记炎症细胞—骨髓来源的巨噬细胞和小胶质细胞，用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)标记星形胶质细胞。损伤后两组的骨髓来源的巨噬细胞和小胶质细胞的数量均增加且聚集成团，鞘氨醇的治疗组相比DMSO对照组中炎症细胞的数量和聚集程度轻。使用 Nerolucida根据荧光染色重构脊髓结构，从3D重构的实验结果来看，鞘氨醇药物干预组的GFAP阳性标记的星形胶质细胞明显不如DMSO对照组多,故白色的胶质瘢痕也不如DMSO对照组的体积大，且DMSO对照组在炎症中心形成了明显空洞，图中为黄色区域。鞘氨醇药物治疗组中脊髓的结构保持的较为完整，斑痕组织相比DMSO对照组小，且无空洞形成这可能提示鞘氨醇对脊髓损伤慢性期的功能修复有积极作用。Student’s t-test，n＝4，*，P<0.05，**，P<0.01。

实施例4

脊髓损伤后小鼠BMS评分

脊髓损伤后，小鼠后肢运动功能可以通过BMS评分测试进行分析评估，根据BMS评分细则，整个实验的评估及分析严格采用双盲法。先将实验小鼠放于评估条件下适应半小时，然后依次将每只小鼠置于在长50cm宽50cm高10cm 透明且底部平坦的矿场中，每只小鼠观察记录4分钟的运动轨迹，在两位观察记录者双盲评估后，每只小鼠的得分为左右双侧后肢评分的平均值。评分过程中无其它干预，BMS评分系统主要记录分析后肢关节的运动范围、运动频率和运动协调性。

BMS评分结果如图8所示，鞘氨醇药物干预组BMS评分明显高于DMSO 对照组。造模当天所有小鼠评分均为0分，损伤后第20天鞘氨醇药物治疗组与 DMSO对照组小鼠后肢功能评分出现明显差异并持续到第8周，鞘氨醇药物治疗组第5周达到BMS评分恢复高值并进入平台期一直持续到第八周。two way ANOVA，n＝25***p<0.001.**p<0.005。

实施例5

小鼠定量步态分析(Catwalk)测试

脊髓损伤后的运动障碍导致的步态行为改变，可运用CatWalk步态分析系统检测动物的自发步态得知，SCI损伤后经药物治疗的动物其运动功能恢复的情况可通过定量步态分析中的各项指标进行评估。实验施行过程：预先将小鼠置于暗室中安静半小时，调节好录像镜头的距离，整个记录过程于安静的暗室环境中进行。绿色荧光穿过透明的玻璃板记录板，预先设置小鼠的走廊尺寸为 3.5cm×50cm的密闭通道，这个尺寸刚好适合20～25g的小鼠身体穿过且无法轻易调头转向。将小鼠轻柔地放置于分析系统的密闭走廊内，使其在玻璃平板自发地行走，盖上红光顶板，用摄像机记录下小鼠行走时越过相机时玻璃板上的爪印足迹，记录数据传至电脑可显示所有被摄像机获取步态图像，然后用 CatWalk XT 9.0软件分析步态的摇摆时间、摇摆速度和协调步态的比例等指标对小鼠脊髓损伤后药物干预对后肢运动功能的影响。每只小鼠接受至少5次评估，有效步态记录的要求是每次记录在0.5-10sec内小鼠能够穿过50cm完整的密闭走廊，且在此过程中小鼠速度的变异系数不能超过60％。每次实验记录完毕后均应清洁玻璃平板方可进行下一只小鼠的步态分析，以防相互干扰。所有实验动物均在手术前3天和手术后28天、56天进行CatWalk步态检测，且每只小鼠的检测需要重复3次，各项检测参数取3次的平均值。

步态分析测试结果如图9-1～图9-2所示，从C57未损伤、鞘氨醇药物治疗组、DMSO对照组三组小鼠的步态模式中可以看出，手术前的老鼠为正常协调步态，在损伤后28天，DMSO对照组小鼠的步态多为乱序，而鞘氨醇药物治疗组小鼠的步态大多为正常协调步态。说明鞘氨醇药物治疗组的小鼠其四肢的协调性恢复得更好。损伤后56天两者的差异性更明显，鞘氨醇药物治疗组的小鼠的协调性恢复的更好。二者存在明显统计学差异。onewayANOVA，***P＜0.001， **p<0.005，n＝10。

综上所述，鞘氨醇药物治疗组的血清和脊髓中促炎因子和炎症因子明显下调，脊髓原发病灶中的促炎因子和炎症因子随时间点的下降趋势比血清更为明显。同时，鞘氨醇在脊髓损伤后对保护脊髓整体结构和神经元存活数量具有积极的作用；鞘氨醇药物治疗组形成的胶质瘢痕不如DMSO对照组的体积大，这提示鞘氨醇对巨噬细胞参与的脊髓损伤慢性期的功能修复有积极作用。另一方面，从运动功能评分中也看出鞘氨醇药物治疗组在4周后其后肢功能在关节负重、步态稳定、协调性步态上恢复良好，充分说明了鞘氨醇可以对抗治疗脊髓损伤中的由巨噬细胞参与的继发性炎症伤害，在脊髓损伤治疗中具有较大的应用前景。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。