超分辨单物镜光片显微成像光学系统及其成像系统

摘要

本申请公开了超分辨率单物镜光片显微成像光学系统、方法以及相关成像系统。超分辨率单物镜光片显微成像光学系统包括：光源模块，所述光源模块配置成输出单一或多个波长的激光束；光片产生与相位调节模块，所述光片产生与相位调节模块配置成接收所述单一或多个波长的激光束并输出两路光片；扫描模块；位于所述扫描模块下游的单物镜，所述扫描模块配置成将由所述光片产生与相位调节模块输出的两路光片引至所述单物镜，所述单物镜配置成令所述两路光片经其射出并相互干涉以产生结构光条纹区域，并且接收荧光信号；荧光检测模块，所述荧光检测模块配置成记录由所述单物镜所接收的荧光信号。

说明书

技术领域

本申请大体上涉及超分辨显微成像技术领域，尤其涉及超分辨单物镜光片显微成像方法和系统。

背景技术

光学显微镜的出现为生命活动动态过程提供了直观的观测手段，促进了生命科学研究突飞猛进的发展。由于光的波动性，光学显微镜的成像分辨率受限，极大阻碍了对精细生命活动的观察，因此，突破衍射极限分辨率是光学显微研究领域一直不懈追求的目标。近年来，突破衍射极限的超分辨率显微成像技术不断发展，目前超分辨率显微技术主要分为三类：(1)受激辐射损耗显微镜(Stimulated Emission Depletion，STED)技术；(2)单分子定位重建显微镜技术；(3)结构光照明显微镜(Structured Illumination Microscopy，SIM)技术。基于STED技术的超分辨显微成像系统需要较高的光强，容易导致光漂白和光毒性，对活体生物样本伤害大；基于单分子定位重建的超分辨率显微镜损失了时间分辨率来换取空间分辨率，对高速动态成像不友好。结构光照明显微镜SIM采用宽场照明的方式，不需要较高的激光功率，比上述两种超分辨率显微技术更适合于活体高速成像。但在三维结构光照明显微成像的情况下，SIM将照亮整个样本，这会增加光漂白的概率以及由于离焦信号存在而导致的重建伪影。

光片荧光显微镜(Light-sheet Fluorescence Microscopy)不同于传统的宽场成像模式，它产生片状光源照明物体，激发光路与探测光路互相分离，从而避免了离焦信号的产生，大大降低了光漂白。传统的光片显微系统在实际操作中同样受到限制。一是受激发物镜和探测物镜布置方式的限制，标准的载玻片及多孔板等往往无法正常使用，样品制备及固定往往需要特殊设计；二是受机械限制，物镜需要有足够长的工作距离来满足成像条件，这限制了物镜的数值孔径也即成像分辨率。

近年来，单物镜光片成像技术不断发展，它不再采用激发物镜和探测物镜互相垂直且独立的方式，而是采用同一个物镜既作为激发物镜也作为探测物镜收集荧光信号，通过远程聚焦成像的方式，将倾斜的像平面进行探测。从而克服了传统光片显微镜样品受限的缺点，可被用于成像不同类型的样本。虽然光片荧光显微镜在长时程和高速体成像方面表现出色，但其空间分辨率并不高。因此，如果能将单物镜光片显微成像技术与结构光超分辨率显微成像技术结合在一起，将为高分辨率、高速的三维活体成像带来极大的便利，对于发育生物学、神经生物学等生命科学领域中的细胞、组织、胚胎的研究至关重要。

发明内容

本申请的主要目的在于利用单物镜光片成像技术与结构光照明超分辨显微成像技术结合从而实现超分辨率单物镜光片显微成像、特别是三维超分辨率成像。

根据本申请的一个方面，提供了一种超分辨率单物镜光片显微成像光学系统，包括：

光源模块，所述光源模块配置成输出单一或多个波长的激光束；

光片产生与相位调节模块，所述光片产生与相位调节模块配置成接收所述单一或多个波长的激光束并输出两路光片；

扫描模块；

位于所述扫描模块下游的单物镜，所述扫描模块配置成将由所述光片产生与相位调节模块输出的两路光片引至所述单物镜，所述单物镜配置成令所述两路光片经其射出并相互干涉以产生结构光条纹区域，并且接收荧光信号；

荧光检测模块，所述荧光检测模块配置成记录由所述单物镜所接收的荧光信号。

可选地，所述扫描模块配置成令所述结构光条纹区域沿着一方向扫描移动，并且所述荧光检测模块配置在扫描时同步记录由所述单物镜所接收的荧光信号。

可选地，所述荧光信号是因所述结构光条纹区域照射待测样品而产生的荧光信号。

可选地，所述光片产生与相位调节模块包括空间光调制器、半波片、偏振分束棱镜、柱透镜和掩模板。

可选地，所述空间光调制器、所述半波片、和所述偏振分束棱镜以组成一相位光栅的方式布置，以使得所述单一或多个波长的激光束在经过该相位光栅后产生多级次的正负光分量。

可选地，所述偏振分束棱镜配置成将所述单一或多个波长的激光束朝向所述半波片反射，并且透过所述半波片后入射所述空间光调制器，

所述空间光调制器配置成能够在至少两个不同的状态之间切换，在所述至少两个不同的状态中，所述空间光调制器相应地限定有不同的图样，用于产生多级次的正负光分量。

可选地，所述掩模板配置成能够仅仅保留正负一级的光分量而滤除其它级的光分量，并且所述掩模板位于所述柱透镜下游，从而所述多级次的正负光分量经过所述柱透镜和所述掩模板后产生所述两路光片。

可选地，所述结构光条纹区域包括第一视角下的结构光条纹区域和第二视角下的结构光条纹区域；

所述空间光调制器的状态包括

第一状态，在所述第一状态中，所述空间光调制器限定有第一衍射图样，以使得用于形成所述第一视角下的结构光条纹区域的两路光片从述光片产生与相位调节模块输出；以及

第二状态，在所述第二状态中，所述空间光调制器限定有与所述第一衍射图样不同的第二衍射图样，以使得用于形成所述第二视角下的结构光条纹区域的两路光片从述光片产生与相位调节模块输出。

可选地，所述扫描模块包括第一振镜以及第二振镜，所述第一振镜布置成接收由所述光片产生与相位调节模块输出的两路光片并朝向所述第二振镜反射，

所述第二振镜布置成将所述两路光片朝向所述单物镜反射。

可选地，超分辨率单物镜光片显微成像光学系统还包括在所述单物镜与所述第二振镜之间的分光镜，所述分光镜配置成所述两路光片能够透过所述分光镜但所述荧光信号朝向所述荧光检测模块反射，所述荧光检测模块包括相机以记录所述荧光信号；以及位于所述相机上游的锥透镜或微透镜阵列。

可选地，超分辨率单物镜光片显微成像光学系统还包括在所述单物镜与所述第一振镜之间的分光镜，所述分光镜配置成所述两路光片能够透过所述分光镜但所述荧光信号朝向所述荧光检测模块反射，所述荧光检测模块包括相机以记录所述荧光信号、在所述分光镜与所述相机之间以组成一4F系统的方式布置的第八透镜和第三透镜；所述第三透镜更靠近所述分光镜，并且在所述第三透镜的焦面处设置一台阶板。

可选地，在所述单物镜与所述第二振镜之间以组成一4F系统的方式布置第一透镜和第二透镜，并且所述荧光检测模块还包括位于所述锥透镜或所述微透镜阵列上游的第三透镜，所述第一透镜和所述第三透镜以组成一4F系统的方式位于所述单物镜与所述锥透镜或所述微透镜阵列之间，所述分光镜位于所述第一透镜与所述第二透镜之间。

可选地，超分辨率单物镜光片显微成像光学系统还包括在所述第二振镜与所述第一振镜之间以组成一4F系统的方式布置的第四透镜和第五透镜，并且所述第二振镜经由所述第四透镜和所述第五透镜与所述第一振镜G1共轭，在所述第五透镜与所述第一振镜之间布置一分光镜，所述分光镜配置成所述两路光片能够透过所述分光镜但所述荧光信号朝向所述荧光检测模块反射。

可选地，所述荧光检测模块包括相机以记录所述荧光信号、位于所述相机上游的彼此光轴成一非零角度放置的第二物镜和第三物镜、在所述分光镜与所述第二物镜之间以组成一4F系统的方式布置的第六透镜和第七透镜，并且在所述分光镜与靠近所述第二物镜的第七透镜之间布置有一振镜-反射镜系统，使得在不同视角下的荧光像的成像方向一致。

可选地，所述振镜-反射镜系统包括在分光镜与所述第六透镜之间布置的第三振镜和第四振镜或附加的反射镜；在所述第三振镜与第四振镜或附加的反射镜之间布置的第二反射镜、第三反射镜和第四反射镜；以及在所述第六透镜与所述第七透镜之间布置的第五反射镜，所述第三振镜能够操作成在所述第一视角和所述第二视角中的一个下，荧光依次经所述第三振镜、所述第二反射镜、所述第四反射镜、所述第四振镜或附加的反射镜、所述第六透镜、所述第五反射镜、和所述第七透镜传播到所述第二物镜中；在所述第一视角和所述第二视角中的另一个下，荧光依次经所述第三振镜、所述第三反射镜、所述第四振镜或附加的反射镜、所述第六透镜、所述第五反射镜、和所述第七透镜传播到所述第二物镜中。

可选地，所述第一振镜和/或第二振镜的操作使得所述结构光条纹区域扫描移动。

可选地，在二维超分辨成像的情况下，第一视角下的结构光条纹区域和所述第二视角下的结构光条纹区域沿着彼此垂直的方向扫描移动。

可选地，在三维超分辨率成像的情况下，第一视角下的结构光条纹区域和所述第二视角下的结构光条纹区域沿着同一条直线但彼此相反的方向扫描移动。

可选地，所述光片产生与相位调节模块还包括扩束滤波子模块，以对所述单一或多个波长的激光束进行扩束和/或滤波处理，所述扩束滤波子模块配置成所述单一或多个波长的激光束在进入所述光片产生与相位调节模块后首先入射所述扩束滤波子模块。

可选地，所述掩模板与所述第一振镜以共轭关系的方式布置。

可选地，在所述掩模板与所述第一振镜之间、和/或在第一振镜与所述第二振镜之间、和/或在所述第二振镜与所述单物镜之间两个透镜以组成4F系统的方式布置。

根据本申请的另一个方面，还提供了一种超分辨单物镜光片显微成像系统，包括：

载物台，具有用于承载待测样品的平面；以及

前述的超分辨率单物镜光片显微成像光学系统，所述超分辨率单物镜光片显微成像光学系统的单物镜的光轴与所述平面成90度的角度。

采用本申请的技术手段，通过特殊设计的光片产生与相位调节模块产生两路光片，以便通过光片干涉形成结构光条纹，确保整体光学系统的光路简单稳定。此外，本申请采用单物镜实现二维或三维超分辨率显微成像，激发物镜和探测物镜为同一个物镜，标准的载玻片及多孔板等均可适用，相比于传统的激发物镜和探测物镜分离的光片系统，更加方便布置待测样品，增加了光学系统的适用性。此外，本申请的光学系统结合了光片成像以及结构光成像的优点，可以降低光漂白的概率以及由于离焦信号存在而导致的重建伪影的影响，为高分辨率、高速的三维活体显微成像的实现提供了基础。

附图说明

从下文的详细说明并结合下面的附图将能更全面地理解本申请的原理及各个方面。需要指出的是，各附图的比例出于清楚说明的目的有可能不一样，但这并不会影响对本申请的理解。在附图中：

图1示意性示出了根据本申请的超分辨率单物镜光片显微成像光学系统的框图；

图2示意性示出了根据本申请的光源模块的一个示例的光路图；

图3示意性示出了根据本申请的光片产生与相位调节模块的一个示例的光路图；

图4示意性示出了根据本申请的扫描模块和单物镜的一个示例的光路图；

图5A示意性示出了根据本申请的荧光检测模块的一个示例的部分光路图；

图5B示意性示出了根据本申请的荧光检测模块的另一个示例的部分光路图；

图5C示意性示出了根据本申请的荧光检测模块的另一个示例的部分光路图；

图6A至6F示意性示出了在本申请的超分辨率单物镜光片显微成像光学系统中不同视角下两路光片经过单物镜后的情况以及在物镜后瞳面的分布；

图7A示意性示出了二维超分辨成像模式下在一个视角下的扫描过程；

图7B示意性示出了与图7A对应的所获得的荧光信号的图像数据信息；

图7C示意性示出了二维超分辨成像模式下在另一个视角下的扫描过程；

图7D示意性示出了与图7C对应的所获得的荧光信号的图像数据信息；

图8A示意性示出了三维超分辨成像模式下在一个视角下的扫描过程；

图8B示意性示出了与图8A对应的所获得的荧光信号的图像数据信息；

图8C示意性示出了三维超分辨成像模式下在另一个视角下的扫描过程；

图8D示意性示出了与图8C对应的所获得的荧光信号的图像数据信息；

图9示意性示出了根据本申请的一个实施例的超分辨率单物镜光片显微成像光学系统的光路图；

图10示意性示出了根据本申请的另一个实施例的超分辨率单物镜光片显微成像光学系统的光路图；以及

图11示意性示出了根据本申请的一个实施例的荧光检测模块的光路图。

具体实施方式

在本申请的各附图中，结构相同或功能相似的特征由相同的附图标记表示。

图1示意性示出了根据本申请的一个实施例的超分辨率单物镜光片显微成像光学系统的框图，并且图9示意性示出了根据本申请的该实施例的超分辨率单物镜光片显微成像光学系统的光路图。根据本申请，超分辨率单物镜光片显微成像光学系统主要包括光源模块100、光片产生与相位调节模块200、扫描模块300、单物镜400、以及荧光检测模块500。在根据本申请的超分辨率单物镜光片显微成像光学系统工作时，光源模块100输出单一或多个波长的激光束入射到光片产生与相位调节模块200，光片产生与相位调节模块200由此产生具有规定空间位置关系的两路光片，所述两路光片经由扫描模块300根据需要进行调制，从而能够经由单物镜400照射超分辨率单物镜光片显微成像系统的载物台上放置的样品(未示出)。在该过程中，所述两路光片在样品所在的平面处产生干涉从而形成结构光照射样品。与此同时，被照射的样品所产生的荧光经过同一物镜400接收并被荧光检测模块500收集，由于激发的荧光信号携带有因结构光照射所产生的超分辨信息，从而通过扫描模块300实现事先规定的扫描过程，可以最终实现二维或三维超分辨率单物镜光片显微成像。

图2示意性示出了根据本申请的光源模块100的一个示例的光路图。根据本申请，光源模块100可以包括一个或多个激光器。例如，每个激光器各自可以发出不同波长的激光束。例如，可用的激光器可以包括405nm(纳米)、445nm、488nm、561nm、640nm波长激光器等。在所示的示例中，光源模块100被示出包括三个激光器Laser1、Laser2、Laser3。这三个激光器Laser1、Laser2、Laser3可以发出彼此不同波长的激光。这三个激光器Laser1、Laser2、Laser3分别配备有透镜组L1和L2、L3和L4、L5和L6，使得激光自相应的激光器发出后能够经由相应的透镜组扩束成等直径的平行光，反射镜M1、二向色镜(或称为分光镜)DM1、DM2将来自不同激光器的各路等直径的平行光进行合束，从而整合成一束激光。

在一个优选的或可选的实施例中，一声光可调谐滤波器AOTF在二向色镜M2下游布置在所述整合的激光束的光路中，从而所述整合的激光束能够入射到该声光可调谐滤波器AOTF中。声光可调谐滤波器AOTF的作用是选择性地确保特定波长的光通过和能够控制经由其所输出的光的功率。

图3示意性示出了根据本申请的光片产生与相位调节模块200的一个示例的光路图。根据本申请，光片产生与相位调节模块200主要包括空间光调制器SLM、半波片HWP、偏振分束棱镜PBS、柱透镜CL3、掩模板Mask以及扩束子模块210。扩束子模块210包括第一柱透镜CL1和第二柱透镜CL2，第一柱透镜和第二柱透镜将来自光源模块100的入射平行光在一维上拉伸，使其出射时为矩形平行光。第一柱透镜CL1和第二柱透镜CL2以本领域技术人员清楚的方式组成扩束系统。

在所示的示例中，空间光调制器SLM可以是二值化空间光调制器，半波片HWP可以是消色差半波片。空间光调制器SLM、半波片HWP、和偏振分束棱镜PBS以组成一相位光栅的方式布置，使得自扩束子模块210输入的激光束在经过该相位光栅后产生多级次的正负光分量。具体而言，空间光调制器SLM、半波片HWP、和偏振分束棱镜PBS布置成自扩束子模块210输入的激光束作为线偏光首先由偏振分束棱镜PBS朝向半波片HWP和空间光调制器SLM反射。然后，所反射的线偏光经半波片HWP旋转相位π/8后入射空间光调制器SLM。在空间光调制器SLM上遍布有多个像素点，每个像素点可以在ON或OFF状态中根据需要切换。这样，通过预先有意设计，空间光调制器SLM上的处于不同状态的像素点可以将入射的光在偏振方向上左旋或右旋π/4并反射。反射的光再次经过半波片HWP并相应旋转相位并最后透过偏振分束棱镜PBS射出。这样，从偏振分束棱镜PBS射出的光因空间光调制器SLM的不同ON或OFF状态的像素点的存在而被调制成相互间具有π相位差别。也就是说，在空间光调制器SLM上显示的衍射图样可以作为相位型光栅处理，通过设计算法(例如控制像素点的ON或OFF状态)可以产生不同的衍射图样从而可以实现余弦条纹光输出。

上述经相位光栅所产生的多级次的正负光分量入射到柱透镜CL3，以产生光片。在柱透镜CL3的下游布置掩模板Mask。掩模板Mask特别地布置在柱透镜CL3的焦点位置处，使得仅仅保留正负一级的光分量而滤除其它级的光分量，从而产生两路光片。这两路光片相对于光轴彼此隔开。

图4示意性示出了根据本申请的扫描模块300的一个示例的光路图。扫描模块300中限定有光路或者说光路的一部分，例如示出为三段Lp1、Lp2和Lp3。在光路段Lp1与Lp2的交界处设置第一振镜(或称激光振镜)G1，在光路段Lp2与Lp3的交界处设置第二振镜(或称激光振镜)G2。光路段Lp1配置为接收来自光片产生与相位调节模块200的光片的光路。本领域技术人员在阅读本说明书中涉及任何与相关光学术语例如“振镜(或激光振镜)”、“共轭”、“4F”等的内容或者它们的工作原理可以参阅本领域公知的任何技术资料包括技术字典、手册和教科书等。此外，第一振镜G1与第二振镜G2也以共轭关系的方式布置。

在优选的实施例中，在光路段Lp1中，透镜L7和L8以组成4F系统的方式布置在掩模板Mask与第一振镜G1之间。L8和L9，L9和L10同样以4F系统的方式布置，在扫描模块300的下游布置单物镜400，例如单物镜400与光路段Lp3共轴线地布置。该单物镜400(其后瞳)以与第二振镜G2成共轭关系的方式布置。在优选的实施例中，在光路段Lp3中，透镜L11和L12以组成4F系统的方式布置在第二振镜G2与单物镜400之间。按上述光路布置，物镜400的后瞳面与第一振镜G1、第二振镜G2以及掩膜板Mask共轭。

在本申请中，第一振镜G1和第二振镜G2配置成绕一轴按照扫描需要进行转动。

在透镜L11和L12之间，分光镜(或二向色镜)DM4设置在光路段Lp3中。该分光镜(或二向色镜)DM4配置成可以直接透过依次经由光路段Lp1和Lp2行进的光束，该光束在经过单物镜400射出后照射样品产生荧光，所产生的荧光再经单物镜400入射后沿着光路段Lp3行进到分光镜DM4处被朝向相机510反射。

图5A示意性示出了根据本申请的荧光检测模块500的一部分的一个示例的光路图。在荧光检测模块500中限定有一光路段Lp4。该光路段Lp4与由分光镜DM4所反射并且与光路段Lp3垂直。在荧光检测模块500中设置有相机510以捕获荧光。在优选的实施例中，在光路段Lp4中，设置透镜L13、L14位于相机510与分光镜DM4之间，使得该透镜L13和L12组成4F系统。在透镜L13的焦面处(物镜后瞳面的共轭面处)布置台阶板520，台阶板520的目的是增加成像景深，有关台阶板520的技术内容可以参见已经公开的技术文献，如SaraAbrahamsson等人的"A new approach to extended focus for high-speed,high-resolution biological microscopy",Three-Dimensional and MultidimensionalMicroscopy:Image Acquisition and Processing XIII，Volume 6090，60900N(https://doi.org/10.1117/12.647022)。台阶板520的下游布置透镜L14，与L13组成4F系统，相机510置于透镜L14的后焦面处。荧光检测模块500还包括自单物镜400所接收的荧光行进至分光镜DM4的光路段。

因为在根据本申请的实施例的光学系统中采用单物镜400既作为激发物镜也作为接收物镜，所以所接收到的荧光像是倾斜的。为了接收这种倾斜的像，传统的接收光路需要特殊物镜以及复杂的转向光路设计从而相应配合成像。在本申请的荧光检测模块500，台阶板520的采用可以取消这种复杂的转向光路设计。在一个替代的探测方案实施例中，如图5B所示，利用傅里叶域光场成像的思想，采用微透镜阵列520′置于L13的后焦面处，相机510置于微透镜阵列520′后进行探测，采集到的光场图像经过重建得到物体的三维信息从而进行探测。在另一个替代的探测方案实施例中，利用锥透镜520″产生贝塞尔光束的思想扩展成像景深，如图5C所示，根据实际情况将锥透镜520″置于L13后，相机510直接进行探测。

如前所述，由光片产生与相位调节模块200产生的两路光片在经过扫描模块300后进入单物镜400，同时在经单物镜400内的透镜的会聚作用下彼此相交，同时在相交处产生干涉(如图6A、6C、6E的T区域所示)并因而产生结构光条纹。为了清楚解释本申请的技术，在相应的附图中示出了三维直角坐标系XYZ或者其在相应二维平面上的投影二维坐标系。图6B、6D、6F分别为产生图6A、6C、6E所示的光片时物镜后瞳处的光片分布情况。当空间光调制器SLM上给定不同的图样，分别从单物镜400射出并且形成不同视角的结构光条纹区域。据此，采用了本申请的光学系统的超分辨率单物镜显微成像系统可实现二维或三维的超分辨。

进一步，对于二维的超分辨成像，在一载玻片1000上放置有一样品2000，如图7A所示。首先，启动光源模块100并调整光片产生与相位调节模块200和扫描模块300的参数，使得两路光片(例如参见图6A)从单物镜400射出并且形成结构光条纹区域T1000。例如，两路光片和在该视角下的物镜后瞳的分布如图6B所示，经过物镜400后干涉产生的结构光条纹区域T1000能够照射在载玻片上的样品2000上(参见图7A)。例如，这种结构光条纹区域T1000可以沿着Y轴进行扫描。扫描过程通过扫描模块中的振镜来实现，例如振镜G1控制沿X轴的扫描，振镜G2控制沿Y轴的扫描。为了实现上述沿Y轴的扫描，振镜G1固定在初始位置不动，振镜G2以设定的间隔角度进行转动，从而实现结构光条纹区域T1000沿着Y方向移动，与此同时，在每个角度增加的位置通过荧光检测模块500记录荧光图像数据，以作为与该结构光条纹区域T1000对应的视角(例如第一视角)下的荧光图像数据(如图7B所示)。接着，调整光片产生与相位调节模块200和扫描模块300的参数，使得两路光片(例如参见图6C)从单物镜400射出并且形成结构光条纹区域T2000。例如，两路光片和在该视角下的物镜后瞳的分布如图6D所示，经过物镜400后干涉产生的结构光条纹区域T2000能够照射在载玻片上的样品2000上，如图7C所示。例如，这种结构光条纹区域T1000可以沿着X轴进行扫描。为了实现这种扫描，振镜G2固定在初始位置不动，振镜G1以设定的间隔角度进行转动，从而实现结构光条纹区域T2000沿着X方向移动，与此同时，在每个角度增加的位置通过荧光检测模块500记录荧光图像数据，以作为与该结构光条纹区域T2000对应的视角(例如第二视角)下的荧光图像数据(如图7D所示)。本领域技术人员应当清楚结构光条纹区域沿着哪个方向移动的具体实现方式可以根据需要相应地调节操作振镜G1和/或G2。

最后，将两个视角下的图像数据进行融合，利用超分辨重建算法对数据进行处理，即可得到XY平面具有超分辨效果的成像结果。

进一步，对于三维的超分辨成像，第一视角的结构光条纹区域T1000分布如图8A所示，例如，该第一视角的结构光条纹区域可以采用与如图7A所示的方式设置。此外，第三视角的结构光条纹区域T3000分布如图8C所示。例如，通过调整光片产生与相位调节模块200和扫描模块300的参数，使得两路光片(例如参见图6E)从单物镜400射出并且形成结构光条纹区域T3000。例如，两路光片和在该视角下的物镜后瞳的分布如图6F所示，经过物镜400后干涉产生的结构光条纹区域T3000能够照射在载玻片上的样品2000上，如图8C所示。例如，首先，启动光源模块100并调整光片产生与相位调节模块200和扫描模块300的参数，使得两路光片(例如参见图6A)从单物镜400射出并且形成结构光条纹区域T1000。例如，两路光片和在该视角下的物镜后瞳的分布如图6B所示，经过物镜400后干涉产生的结构光条纹区域T1000能够照射在载玻片上的样品2000上，如图8A所示。例如，这种结构光条纹区域T1000可以沿着Y轴进行扫描。扫描过程通过扫描模块300中的振镜来实现，例如振镜G1控制沿X轴的扫描，振镜G2控制沿Y轴的扫描。为了实现上述沿Y轴的扫描，振镜G1固定在初始位置不动，振镜G2以设定的间隔角度进行转动，从而实现结构光条纹区域T1000沿着Y方向移动，与此同时，在每个角度增加的位置通过荧光检测模块500记录荧光图像数据，以作为与该结构光条纹区域T1000对应的视角(例如第一视角)下的荧光图像数据(如图8B所示)。接着，调整光片产生与相位调节模块200和扫描模块300的参数，使得两路光片(例如参见图6E)从单物镜400射出并且形成结构光条纹区域T3000。例如，两路光片和在该视角下的物镜后瞳的分布如图6F所示，经过物镜400后干涉产生的结构光条纹区域T3000能够照射在载玻片上的样品2000上，如图8C所示。与二维超分辨成像不同的是，该结构光条纹区域T3000可以沿着同一Y轴进行扫描，但是方向与结构光条纹区域T1000移动的方向相反。例如，同样控制振镜G2使其反方向转动，振镜G1固定在初始位置不动，振镜G2在每个不同角度的位置，通过荧光检测模块500记录荧光图像数据，以作为与该结构光条纹区域T3000对应的视角(例如第三视角)下的荧光图像数据(如图8D所示)。采集到的每一个视角的图像利用深度学习方法实现基于一维方向结构光照光片显微设备的二维超分辨率成像，两个视角下的二维超分辨图像进行融合，即可得到XYZ方向都具有超分辨效果的三维超分辨图像。具体有关深度学习方法内容可以参见专利公开文献CN113917677A。

本领域技术人员应当清楚，三维超分辨率显微图像分析与处理能够以任何显微图像处理技术领域中熟知的三维图像重建方法来实现，例如可以采用商业交互式显微图像分析软件如Imaris、Amira在计算机上实现。

如图7A、7C和8A、8C所示的载玻片1000可以放置在一载物台上。或者说，该载物台限定有用于承载待测样品2000的平面。因此，一超分辨率显微成像系统可以大体上包括载物台以及前述介绍的超分辨率单物镜光片显微成像光学系统，其中，单物镜400的光轴与所述平面成90度的角度。

对于三维的超分辨成像，图10示意性示出了根据本申请的另一个实施例的超分辨率单物镜光片显微成像光学系统的光路图。通过将图10所示的实施例与图9和图1对比可以发现，图10所述的光学系统与图9所示的光学系统的主要区别在于荧光检测模块的不同。因此，出于简便的原因，在图10所示的实施例中与之前所描述相同的那些附图标记可以参考之前的实施例的说明。如图10所示的光学系统包括荧光检测模块600以替代荧光检测模块500，图11示出了该荧光检测模块600的一部分的光路图。

此外，根据如图10所示的实施例，与如图9所示的实施例相比取消了分光镜DM4以及相关的荧光检测模块500，但是在透镜L9与第一振镜G1之间布置一分光镜DM3，使得光片光能够沿着从第一振镜G1至透镜L9的方向传播，但是经由单物镜400所接收的荧光在经过透镜L12、L11、第二振镜G2以及透镜L10、L9后在分光镜DM3处朝向荧光检测模块600(图11)反射。如果不考虑激发光和荧光的传播方向，扫描模块300和单物镜400的光路与荧光检测模块600的光路存在部分地重叠。图11仅示出了荧光检测模块600的光路的非重叠的一部分。

如图11所示，荧光检测模块600包括第三振镜G3和第四振镜G4，在第三振镜G3与第四振镜G4之间布置有三个反射镜、即第二反射镜M2、第三反射镜M3、第四反射镜M4。此外，在第四振镜G4的下游依次布置有透镜L15、第五反射镜M5、透镜L16、物镜OBJ2、OBJ3、透镜L17和相机610。物镜OBJ2的光轴与物镜OBJ3的光轴成一定的夹角。正如之前所提及的，由于荧光像是倾斜的，因此物镜OBJ2的光轴与物镜OBJ3的光轴的夹角配置成恰好可以用于抵消这种倾斜。

在该实施例中，物镜400的后瞳面经透镜L12和L11与第二振镜G2共轭，而第二振镜G2经透镜L10和L9与第一振镜G1共轭，透镜L9的焦面经透镜L15和L16与物镜OBJ2的后瞳面共轭，物镜OBJ2处的像经物镜OBJ3和透镜L17成像到相机610上。

第三振镜G3、第四振镜G4、第二反射镜M2、第四反射镜M4配置成当第一视角下的反射荧光被荧光检测模块600所接收时，第三振镜G3切换至一角度使得经分光镜DM3所反射的荧光经第三振镜G3、第二反射镜M2、第四反射镜M4、第四振镜G4的路线传播经过透镜L15并进而由相机610所接收；当第二视角下的反射荧光被荧光检测模块600所接收时，第三振镜G3切换至另一角度使得经分光镜DM3所反射的荧光经第三振镜G3、第三反射镜M3、第四振镜G4的路线经过透镜L15并进而由相机610所接收。因为在两个不同视角下所接收的荧光信号在到达相机610时经过了不同数量的反射镜，因此最终的不同视角下的荧光像的成像方向一致，从而在切换不同视角时无需后续相关探测光路的改变。

尽管这里详细描述了本申请的特定实施方式，但它们仅仅是为了解释的目的而给出，而不应认为它们对本申请的范围构成限制。此外，本领域技术人员应当清楚，本说明书所描述的各实施例可以彼此相互组合使用。在不脱离本申请精神和范围的前提下，各种替换、变更和改造可被构想出来。