一种基于中小型土壤动物分布变化的孔雀草提取物对土壤生态环境影响的评价方法

摘要

本发明公开了一种基于中小型土壤动物分布变化的孔雀草提取物对土壤生态环境影响的评价方法，包括以下步骤：配置孔雀草根系噻吩类衍生物溶液，于黑暗环境中浇灌孔雀草原位土样至下端滴水，并将每种处理分成两组：一组静置24h，另一组静置48h，静置时表面覆盖60目尼龙网；将孔雀草原位土样分别放入烘虫箱中的干、湿漏斗中进行中小型土壤动物的分离，并在烘虫箱内的漏斗与白炽灯之间牵拉一张隔光不隔热的染色膜；统计每一类中小型土壤动物的数量并进行数据处理。本发明从中小型土壤动物出发对孔雀草噻吩类衍生物的作用效果进行维度更广、更高的生态评价，并规避了分离土壤动物过程中光照带来的影响，使评价结果更趋近于现实情况。

说明书

技术领域

本发明属于土壤生态学技术领域，具体涉及一种基于中小型土壤动物分布变化的孔雀草提取物对土壤生态环境影响的评价方法。

背景技术

孔雀草是一种数量多、花期长、有特殊气味而病虫害很少的园林植物，在西南地区广泛用于盆花、花坛用花或切花。孔雀草通过释放化学物质到土壤环境中对它所处的自然生态系统产生直接或间接的影响。土壤，作为地球上生物多样性最丰富的生物环境，在维持陆地生态系统平衡中发挥着不容忽视的作用。生活于孔雀草根植土壤中的土壤动物是联系地上/地下生态系统的桥梁与纽带，几乎参与了该土壤生态系统的所有生态过程，在促进物质循环、制造土壤养分、改良土壤结构以及净化地下环境等方面扮演着极其重要的角色。评价孔雀草根系噻吩类衍生物对中小型土壤动物生态影响，对评估孔雀草这一植物在其根植土壤中体现的生态作用具有重要意义。

几十年来，人们对孔雀草对土壤动物生态影响的研究逐渐加深。但目前的研究方法仍显示出两点不足。

一方面，人们的研究方法主要是用提取到的孔雀草根系分泌的化学物质直接处理与该植物所处土壤环境无关的、其他地域采集或购买到的大型土壤动物 (蚯蚓、蚂蚁等)，仅仅能够观测到与该土壤动物活性有关的指标变化，评价角度仅限于物种个体，层次较低，不能从更高的种群、群落维度对该植物化感物质的作用效果进行生态评价。

另一方面，由于孔雀草对土壤动物生态影响发挥作用的噻吩类衍生物具有极高的光活化性能，在光照作用下其对土壤动物的作用效能会大幅提高。在烘虫箱内利用土壤动物的趋暗、趋湿、避高温的特性分离计数土壤动物本是常规手段，但光照会影响孔雀草噻吩类衍生物的作用效果，而现实情况里地下土壤是无光环境，因此不利于模拟实际情况中孔雀草噻吩类衍生物对土壤动物的生态影响。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供一种基于中小型土壤动物分布变化的孔雀草提取物对土壤生态环境影响的评价方法，以解决现有评价方法仅能够观测到与该土壤动物活性有关的指标变化，评价角度仅限于物种个体，层次较低，且无法模拟无光环境的问题。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种基于中小型土壤动物分布变化的孔雀草提取物对土壤生态环境影响的评价方法，包括以下步骤：

(1)对孔雀草进行提取并将提取物配置成浓度为0.005g/L～0.5g/L的溶液，并以蒸馏水作对照处理；

(2)将孔雀草原位土样于黑暗环境中用孔雀草提取物溶液浇灌至下端滴水，并将每种处理分成两组：一组静置24h，另一组静置48h，静置时表面覆盖 60目尼龙网；

(3)静置之后，将孔雀草原位土样分别放入烘虫箱中的干、湿漏斗中进行中小型土壤动物的分离，并在烘虫箱内的漏斗与白炽灯之间设置一张隔光不隔热的染色膜，干漏斗表面覆盖60目尼龙网；湿漏斗分离期间加水保持土样湿润；烘虫箱内温度为35～40℃，分离时间共48h，其中湿漏斗分离至4h、12h、24h、 48h各收集一次；干漏斗24h、48h各收集一次。

(4)分离完成后，对中小型土壤动物进行分类鉴定，统计每一类中小型土壤动物的数量并进行数据处理，评估孔雀草提取物对土壤生态环境影响。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，孔雀草提取物为噻吩类衍生物。

进一步，噻吩类衍生物由以下步骤制得：取孔雀草根系粉末与石油醚按料液比1：10混合后，于65℃水浴搅拌回流提取1h，回流1次，其后过滤，取滤液蒸馏至粘稠状，得噻吩类提取物膏状粗品，其后分离纯化，即得。

进一步，分离纯化包括以下步骤：分离纯化采用高速逆流色谱法，转速： 800rpm，流动相流速：2mL·min

进一步，孔雀草原位土样由以下步骤制得：在样地用环刀取土后，用60目尼龙网封住环刀，再将环刀装入黑布袋中并放进保鲜箱中保存。

进一步，中小型土壤动物包括轮虫、线虫、螨、弹尾类、原尾类。

进一步，数据处理包括整理中小型土壤动物的丰富度指数、多样性指数、优势度指数、均匀度指数和优势度指数。

本发明的有益效果是：

(1)相较于大型土壤动物，中小型土壤动物具有对环境变化更为敏感、响应更为迅速等特点，采用中小型土壤动物能更为及时地反馈、更为全面地反映植物化感物质对土壤动物、土壤生态的影响。

(2)采用的中小型土壤动物是分离自原位土壤而不是非相关土壤里的土壤动物，考虑到了土壤本身对实验对象中小型土壤动物的累积效应，使实验材料更接近于孔雀草生长的土壤环境中土壤动物的自然状态。

(3)利用本发明的评价方法实验得到的结果，参数既包含中小型土壤动物物种的个体数量变化，也包含中小型土壤动物种群的综合数量变化，相较于目前仅限于某一种大型土壤动物个体的活性变化的观测角度，更能直观体现孔雀草根系噻吩类衍生物对土壤动物的生态影响。

(4)本发明在室内操作过程中全程在黑暗条件下进行，尤其是在烘虫箱内添加了一层具有隔光不隔热特性的染色膜，模拟地下土壤环境创建无光条件，规避由孔雀草噻吩类衍生物的光活化特性造成大幅偏离真实数据、评价不准确的情况。

附图说明

图1～4为孔雀草根系噻吩类提取物处理后的中小型干生土壤动物多样性；

图5～8为孔雀草根系噻吩类提取物处理后的中小型湿生土壤动物多样性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

实施例1

一种基于中小型土壤动物分布变化的孔雀草提取物对土壤生态环境影响的评价方法，包括以下步骤：

(1)选择立地条件基本一致并分别植有孔雀草的城市绿地各3处设置样地，每处设立3个重复，共9块样地；

(2)在每块样地用100ml环刀取48个土样编号，再用60目尼龙网封住环刀，其后将环刀装入黑布袋中并放进保鲜箱保存；

(3)称孔雀草根系粗粉置于圆底烧瓶中，按照料液比1：10的比例加入石油醚，于65℃水浴搅拌回流提取1h，回流1次，用布氏漏斗趁热抽滤，收集滤液，滤液在旋转蒸发仪中减压蒸馏至粘稠状，得到孔雀草根系噻吩类提取物膏状粗品，采用高速逆流色谱法对膏状粗品中的噻吩类物质进行分离纯化，得到纯度在99％以上的噻吩类物质，(仪器为GSl0AB—A半制备型HSCCC，柱体积：230mL，转速：800rpm，流动相流速：2mL·min-1。溶剂体系：正己烷.二氯甲烷、乙腈(10：3：7，v/v)，上样量为200mg，溶于10mL固定相与流动相的混合溶液)将其配置成0.005g/L、0.05g/L、0.5g/L三种浓度梯度的溶液，以蒸馏水作对照处理，以上步骤在黑暗中进行；

(4)将48个孔雀草原位土样于黑暗环境中分别用0.005g/L、0.05/L、0.5g/L 三种浓度梯度的孔雀草根系噻吩类衍生物溶液或蒸馏水浇灌至下端滴水，并将每种浓度处理后的土样分别分成两组：一组静置24h，另一组静置48h，静置时表面覆盖60目尼龙网，以防土壤动物逃逸；(3种浓度×3个重复×2种时长× 2种漏斗实验组+3个重复×2种时长×2种漏斗空白对照)

(5)静置之后，将装有孔雀草原位土样的环刀分别放入烘虫箱中的干、湿漏斗中进行中小型土壤动物的分离，并在烘虫箱内的漏斗与白炽灯之间牵拉一张隔光不隔热的染色膜(与烘箱紧密贴合)，干漏斗表面覆盖60目尼龙网；湿漏斗分离期间加水保持土样湿润，以利湿生土壤动物的顺利分离；烘虫箱内温度为37℃，分离时间共48h，其中湿漏斗分离至4h、12h、24h、48h各收集一次；干漏斗24h、48h各收集一次。

(6)分离完成后，对中小型土壤动物进行分类鉴定，统计每一类中小型土壤动物的数量并利用Microsoft Excel和SPSS13.0进行数据整理，土壤动物群落结构多样性采用Margalef丰富度指数(M)、Shannon-Wiener多样性指数(H’)、 Simpson优势度指数(C)。

表1为实施例1的48个土样的处理方法分类表。

表1土样处理与中小型土壤动物分离方法

实施例1所得处理数据，孔雀草根系噻吩类提取物处理后的中小型干生土壤动物多样性如图1～4所示，处理时长为24h和48h孔雀草根系噻吩类提取物对中小型干生土壤动物个体密度、密度类群指数DG和多样性指数H’的影响趋势整体一致，随孔雀草根系噻吩类提取物浓度增加而逐渐降低；优势度指数C 呈相反变化趋势，随孔雀草根系噻吩类提取物浓度增加而逐渐增加。

方差分析显示，处理时长为24h时，中小型干生土壤动物个体密度在不同浓度均具有显著差异。对照组处理下与0.005g/L、0.05g/L和0.5g/L处理下的密度类群指数DG、多样性指数H’和优势度指数C均有显著差异(P<0.05)。处理时长为48h时，对照组处理下与0.005g/L、0.05g/L和0.5g/L处理下的个体密度、密度类群指数DG和多样性指数H’均有显著差异(P<0.05)。0.05g/L与对照组、0.5g/L处理下的优势度指数C均有显著差异(P<0.05)。

实施例1所得处理数据，孔雀草根系噻吩类提取物处理后的中小型湿生土壤动物多样性如图5～8所示，处理时长为24h和48h孔雀草根系噻吩类提取物对中小型干生土壤动物个体密度、密度类群指数DG和多样性指数H’的影响趋势整体一致，随孔雀草根系噻吩类提取物浓度增加而逐渐降低；优势度指数C 呈相反变化趋势，随孔雀草根系噻吩类提取物浓度增加而逐渐增加。

方差分析显示，处理时长为24h时，0.5g/L与对照组处理、0.05g/L和0.5g/L 处理下的个体密度均有显著差异(P<0.05)。对照组处理与0.005g/L、0.5g/L处理下的密度类群指数DG和多样性指数H’均有显著差异(P<0.05)。对照组处理与0.5g/L处理下的优势度指数C有显著差异(P<0.05)。处理时长为48h时，对照组处理与0.05g/L处理、0.5g/L处理下的中小型湿生土壤动物密度类群指数 DG均有极显著差异(P<0.01)。0.005g/L与0.05g/L处理下的密度-类群指数DG 有显著差异(P<0.05)，与0.5g/L处理有极显著差异(P<0.01)。空白对照组和 0.005g/L与0.05g/L处理和0.5g/L处理下的个体密度均有极显著差异(P<0.01)。不同浓度孔雀草根系噻吩类提取物处理程度下对中小型湿生土壤动物多样性指数、优势度指数无显著差异(P>0.05)。

结果表明，处理时长为24h和48h时，不同浓度的孔雀草根系噻吩类衍生物处理对中小型干、湿生土壤动物个体密度、密度类群指数DG和多样性指数H’的影响趋势整体一致，整体表现为随浓度增大而减少；优势度指数C表现为随处理浓度增大而增大。这与野外观察实验结果类似，这表明孔雀草根系噻吩类衍生物能直接对中小型干、湿生土壤动物产生抑制性的生态作用，具有负影响。

虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。