一种光动力治疗细菌性眼内炎的新型抗菌疗法

摘要

本发明公开了一种光动力治疗细菌性眼内炎的新型抗菌疗法，包括：选取TTPy分子；采用DMSO对TTPy溶解得5mM的母液；采用PBS溶液稀释母液；将稀释后的母液注射入大鼠眼内；对注射部位进行一定条件的光照，实现有效的体内抗菌。本发明涉及应用于细菌性眼内炎的光动力治疗探索技术领域，具体是提供了一种可以避免潜在的细菌耐药性问题，同时也能解决传统光敏剂聚集荧光淬灭的缺点，通过较低的给药浓度即可达到良好的杀菌效果，且可实现对视网膜的保护和体内的有效抗菌，具体是一种成功利用AIEgens进行光动力抗菌研究，在细胞及动物水平验证了TTPy的安全性和有效性，可以为相似抗菌应用奠定基础的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及应用于细菌性眼内炎的光动力治疗探索技术领域，具体是指一种光动力治疗细菌性眼内炎的新型抗菌疗法。

背景技术

细菌性眼内炎(bacterial endophthalmitis，BE)是严重的眼部感染，病情发展迅速，属于临床和眼科急症。虽然白内障手术后眼内炎的发生率约为0.1％，但若得不到及时有效的治疗，会导致不可逆的视力丧失，甚至眼球丧失。目前，BE主要采用经验性玻璃体内注射万古霉素联合其他抗生素治疗，严重者需进行玻璃体切除术。然而，近年来滥用抗生素导致病原体频繁产生耐药性，甚至出现超级细菌。而且，抗生素对眼内视网膜组织有一定的毒性作用，可能导致出血性闭塞性视网膜血管炎，一旦发生，患者视力极差。此外，BE治疗住院时间长，治疗效果难以保证，患者需要承担高额的时间和金钱代价。因此，研究BE的替代抗菌疗法来解决上述问题是迫切且必要的。

光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)在耐药菌感染的治疗中显示出巨大的潜力。与传统疗法相比，PDT通过光敏剂(photosensitizers，PSs)光照后产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)来杀灭病原体，具有低细胞毒性、低耐药性和时空精确性等优势。更重要的是，由于眼球的透光性良好，PDT非常适合用于眼部感染治疗。然而，大多数传统的PSs在聚集态存在荧光猝灭问题，极大限制了其在临床的应用。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种可以避免潜在的细菌耐药性问题，同时也能解决传统光敏剂聚集荧光淬灭的缺点，通过较低的给药浓度即可达到良好的杀菌效果，且可实现对视网膜的保护和体内的有效抗菌，效果更好的光动力治疗细菌性眼内炎的新型抗菌疗法，具体是一种成功利用AIEgens进行光动力抗菌研究，在细胞及动物水平验证了TTPy的安全性和有效性，可以为相似抗菌应用奠定基础的应用。

本发明采取的技术方案如下：本发明一种光动力治疗细菌性眼内炎的新型抗菌疗法，包括如下步骤：

步骤一：选取固体的TTPy分子粉末；

步骤二：采用DMSO对TTPy分子粉末进行溶解得到浓度为5mM的母液；

步骤三：采用PBS溶液稀释母液；

步骤四：将稀释后的母液注射入大鼠眼内；

步骤五：对注射部位进行一定条件的光照，通过快速高效产生ROS，在保证无细胞毒性的前提下，实现有效的体内抗菌。

进一步地，所述步骤一中，TTPy分子为采用携带有正电荷和中等疏水性的TTPy分子，对TTPy分子进行合成与提纯处理，在静电与疏水相互作用的驱动下，可以实现对细菌与正常细胞的快速识别。

优选地，所述步骤五中一定条件的光照为在光照功率为20mW/cm

作为优选方案，所述新型抗菌疗法在单纯的玻璃体腔注射TTPy时不对正常眼球造成影响。且在实际应用中，TTPy的光动力抗菌导致早期的固有免疫应答，中性粒细胞更早地募集到玻璃体腔中的感染部位，不仅限制了感染的传播，更保护了视网膜免受与炎症相关的组织损伤。

本方案一种光动力治疗细菌性眼内炎的新型抗菌疗法，采用上述方案本发明取得的有益效果如下：

1、采用携带有正电荷和中等疏水性的AIEgens(TTPy)，在静电和疏水相互作用的驱动下，实现对细菌和正常细胞的快速识别。

2、TTPy在一定的光照条件下快速高效产生ROS、选择性杀灭金黄色葡萄球菌(S.aureus)，在保证无细胞毒性的前提下，实现有效的体内抗菌，对眼部正常细胞无明显毒性，表明TTPy的高效抗菌潜力，克服了细菌耐药性的潜在问题。

3、将TTPy用于探索治疗金黄色葡萄球菌感染的BE，并与临床上常用的商用光敏剂Rose Bengal对比，实现视网膜保护和体内有效抗菌，为耐药性和难治性BE的治疗提供新的策略。

4、TTPy的高效杀菌触发了早期固有免疫反应，更早地募集中性粒细胞到玻璃体腔的感染部位，限制了感染的扩散，同时抑制了暴发性炎症的发生，保护视网膜免受炎症相关的组织损伤。

5、TTPy在有效杀菌的同时可以更好的保护视网膜结构，极大限度的保留了视觉功能。

附图说明

图1为实施例1中紫外灯下荧光颜色变化与PL光谱示意图；

图2为实施例1中ROS生成测定示意图；

图3为实施例1中Zeta电位测定的示意图；

图4为实施例2中CCK-8检测ARPE-19细胞活性图；

图5为实施例2中CCK-8检测HCE-T细胞活性图；

图6为实施例2中Calcein AM/PI细胞毒性检测示意图；(比例尺：100μm)

图7为实施例2细胞凋亡率及凋亡蛋白检测中ARPE-19细胞Bcl-2和Bax的表达；

图8为实施例2细胞凋亡率及凋亡蛋白检测中Bcl-2的灰度值分析图；

图9为实施例2细胞凋亡率及凋亡蛋白检测中Bax的灰度值分析图；

图10为实施例2细胞凋亡率及凋亡蛋白检测中流式细胞凋亡示意图；

图11为实施例2细胞凋亡率及凋亡蛋白检测中ARPE-19细胞凋亡率统计分析图；

图12为实施例2中大鼠的重要脏器(心、肝、脾、肺、肾)病理学检测染色图；

图13为实施例2中大鼠血清电解质水平统计分析图；

图14为实施例2中大鼠眼球结构及形态变化图；

图15为实施例3中不同的光照功率和时间下在琼脂板铺板的杀菌效果图示意；

图16为实施例3中20mW/cm

图17为实施例3中20mW/cm

图18为实施例3中电镜下S.aureus的形态变化图；

图19为实施例3中眼表照相示意图；

图20为实施例3中临床炎症评分图；

图21为实施例3中房水蛋白浓度的测定图；

图22为实施例3中玻璃体病理图；

图23为实施例3中视网膜病理图；

图24为实施例3中通过CXCL1的ELISA检测玻璃体腔内四种眼内炎常见因子的含量示意图；

图25为实施例3中通过TNF-α的ELISA检测玻璃体腔内四种眼内炎常见因子的含量示意图；

图26为实施例3中通过IL-1β的ELISA检测玻璃体腔内四种眼内炎常见因子的含量示意图；

图27为实施例3中通过IFN-γ的ELISA检测玻璃体腔内四种眼内炎常见因子的含量示意图；

图28为实施例3中中性粒细胞染色图；

图29为实施例3中中性粒细胞计数图；

图30为实施例3中Transwell中性粒细胞计数图。

附图中，图13中：(A)AST(B)ALT(C)TG(D)T-CHO(E)Ca

图14中，角膜(A-C)：A.Normal组；B.TTPy+Light组；C.TTPy+Dark组；视网膜(D-F)：D.Normal组；E.TTPy+Light组；F.TTPy+Dark组。

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1-图30所示，本发明一种光动力治疗细菌性眼内炎的新型抗菌疗法，包括如下步骤：

步骤一：选取固体的TTPy分子粉末；

步骤二：采用DMSO对TTPy分子粉末进行溶解得到浓度为5mM的母液；

步骤三：采用PBS溶液稀释母液；

步骤四：将稀释后的母液注射入大鼠眼内；

步骤五：对注射部位进行一定条件的光照，通过快速高效产生ROS，在保证无细胞毒性的前提下，实现有效的体内抗菌。

通过以下实施例，验证本方案的实施性。

实施例1，选取金黄色葡萄球菌(S.aureus)作为识别目标。采用DMSO对TTPy分子粉末进行溶解得到浓度为5mM的母液，用PBS稀释后进行后续实验。

S1、菌液的制备：

通过对金黄色葡萄球菌进行稀释处理，将金黄色葡萄球菌(S.aureus)于37℃摇床过夜18h后，离心去除上清液、重悬，通过酶标仪测量进行计数，调整OD值至OD 600＝1.0，稀释至10

S2、紫外吸收及光致发光光谱测定：

将不同浓度的菌液分别与不同浓度的TTPy分子溶液于玻璃管中混合均匀，孵育15min，于暗室环境下，在365nm紫外灯照射下拍摄记录荧光，将不同浓度的TTPy分子溶液与菌液混合均匀后于荧光光谱仪测定PL光谱；

将TTPy稀释至不同浓度(0，0.02，0.05，0.1，0.2μM)以分析其光物理性质。

如图1A所示，在365nm紫外灯照射下，单纯的PBS和TTPy溶液无明显荧光。而当S.aureus与TTPy孵育15min后，肉眼即可观察到混合液呈现明显淡红色荧光，并且荧光强度随着浓度的增大而增强，这表明TTPy对S.aureus具有良好的亲和力和生物成像能力。

如图1B所示，单纯的TTPy溶液经489nm激发光照射后，最大发射波长为610nm，不同浓度的PL强度之间无明显差异。在与S.aureus孵育15min后，PL强度显著增强，且最大发射波长呈现浓度依赖性的红移。

S3、Zeta电位、活性氧测定：

将不同浓度的TTPy分子溶液与菌液混合均匀，孵育15min，测量S.aureus菌液的Zeta电位，全程避光操作，将DCFH-DA稀释后加入不同浓度的TTPy分子溶液中，分成PBS组、DCFH-DA组、DCFH-DA+TTPy组；并将溶液依次加入96孔黑板中，每孔100μL，光照前先测定初始值I

通过DCFH-DA试剂盒测量0.1μM TTPy溶液在白光照射后的ROS产率。结果如图2所示，在白光照射(20mW/cm

为了验证TTPy与S.aureus的亲和性，测量了与不同浓度TTPy孵育后的S.aureus混合液的Zeta电位，结果如图3所示，单纯S.aureus溶液的Zeta电位值为-11.20±0.15mV，而与不同浓度的TTPy(0.02、0.05和0.1μM)孵育后，其电位逐渐减小，各组之间的结果存在统计学差异。

在具体实施过程中，使用的材料包括但不限于：DMEM/F12培养基、胎牛血清、氨苄青霉素-链霉素双抗、PBS(20X)、表皮生长因子、人重组胰岛素、0.25％Trypsin-EDTA、无血清细胞冻存液、流式凋亡试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、BCA蛋白质浓度测定试剂盒、PAGE凝胶快速制备试剂盒、Bax抗体、Bcl-2抗体、Action抗体、PMSF、Tween-20、Marker、二抗(Rabbit，Rat)、细胞蛋白裂解液、BSA、一抗、二抗稀释液、CCK-8检测试剂盒、Calcein-PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒、4％多聚甲醛、戊巴比妥钠、眼球固定液、20x PBS、盐酸丙美卡因滴眼液、复方托吡卡胺滴眼液、DAPI、CRE试剂盒、TG试剂盒、T-CHO试剂盒、K

实施例2，TTPy在细胞及动物水平安全性的研究。

(1)细胞活性测定：

取对数生长期的细胞消化、重悬、铺板。待细胞贴壁后，加入不同浓度的TTPy溶液室温孵育15min。

a组进行白光(20mW/cm

24h后，每孔加入混匀的100μL培养基原液和10μL的CCK-8溶液，放入恒温培养箱中孵育2h。采用450nm波长酶标仪测量吸光度值。

通过不同浓度的TTPy干预ARPE-19和HCE-T细胞后，CCK-8检测细胞活性结果如图4-图5所示。

如图4和图5所示，经光照30min、暗处孵育24h后，TTPy在0.5μM以下对ARPE-19细胞的细胞活性均无明显影响，a组在1.0μM时的细胞活性出现明显的下降，而b、c组的细胞活性无明显下降。而HCE-T细胞在0.2μM TTPy时a、b、c三组出现明显活性下降，但活性值仍在80％以上。

(2)Calcein/PI活/死细胞染色

吸取10μL的Calcein AM和PI加入10mL检测缓冲液中，充分混匀。接种于6孔板的细胞进行药物干预24h后，弃上清。加入1mL的Calcein AM/PI检测工作液，覆盖单层细胞，37℃避光孵育30min，于荧光显微镜下采集图像。

通过Calcein AM/PI细胞毒性染色进一步检测TTPy对眼内细胞的毒性作用。如图6所示，在不同浓度的TTPy对a、b、c三组(分组同前)的ARPE-19细胞均无明显的细胞毒性，各组活细胞与死细胞的比例无统计学差异。

(3)流式细胞仪检测细胞凋亡

按照前述培养方法处理并干预细胞，收集各组细胞于流式管中，4℃离心机离心，弃上清。PBS清洗后，每个流式管中加入195μL的Annexin V-FITC结合液、5μL Annexin V-FITC、10μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀。避光孵育15min，上流式细胞仪检测。

通过Western Blot检测凋亡蛋白的表达和流式细胞仪检测细胞凋亡率来评价TTPy对ARPE-19凋亡状态的影响。

如图7-图9所示，通过Bcl-2和Bax两种凋亡相关蛋白的表达，统计学分析其表达量均无明显变化。

图10-图11反映了各组ARPE-19的细胞凋亡率，结果表明各组之间也无明显统计学差异，因此TTPy在一定浓度范围内不会造成ARPE-19的凋亡。

(4)H&E染色观察各脏器组织病理学变化

在治疗后7d时处死大鼠，摘取心、肝、脾、肺、肾主要脏器，于4％多聚甲醛中固定24h。

将固定好的各组织分别置于梯度乙醇(50％、70％、80％、95％、100％)中进行脱水处理2h。将上述脱水处理后的组织置入二甲苯中透明2次，15min/次。将透明后的样本组织放于包埋盒中浸蜡2h(60℃)。石蜡切片二甲苯2次脱蜡、梯度乙醇复水。采用苏木素、伊红进行染色。经梯度乙醇脱水，二甲苯透明后用中性树胶封片，光学显微镜下采集图像。

玻璃体腔注射菌液和TTPy 7d后，分别摘取各组的重要脏器及静脉血检测，观察TTPy是否对心、肝、脾、肺和肾的结构和功能造成损伤。H&E染色结果发现如图12所示，与正常大鼠相比，各脏器结构和形态未见明显异常。各组的血清学电解质水平之间无明显差异，如图13所示。上述结果表明了TTPy不影响各重要脏器的结构、形态和功能，具有良好的生物安全性。如图14所示，大鼠眼球角膜、视网膜结构无明显变化，单纯的玻璃体腔注射TTPy不对正常眼球造成影响。

实施例3，TTPy在细胞及动物水平有效性的研究。

(1)传统铺板观察细菌增殖

将上述菌液梯度稀释至10

通过传统铺板法来评估TTPy对S.aureus的光动力杀菌效果，如图15所示，探索不同的光照功率和时间下的杀菌效果来确定最佳有效杀菌的浓度及光照条件。

在功率为40mW/cm

进一步在较低功率(20mW/cm

随后在20mW/cm

(2)细菌、细胞共培养

ARPE-19细胞铺于共聚焦培养皿上，置于37℃，5％CO

当TTPy浓度为0μM和暗处孵育时(如图18所示)，电镜下S.aureus具有明确和清晰的细胞膜边界，细菌形态保持完整。当经不同浓度TTPy光照干预的S.aureus被不同程度的破坏，细胞呈现不规则形态。电镜下的细菌形态证明了TTPy通过破坏S.aureus的细胞膜发挥抗菌作用，实现对S.aureus的高效杀菌效果。

(3)扫描电镜观察TTPy分子的杀菌效能

将上述菌液用PBS重悬后，分装在离心管，每管100μL。将菌液和不同浓度的TTPy分子溶液混合后孵育15min，Light组置于24孔板照光15min，Dark组置于室温暗处15min。

光照结束后，收集菌液于离心管中，离心去上清，用4％多聚甲醛固定过夜。固定好后，离心弃去上清液，乙醇梯度脱水，每次6min。100％乙醇重悬后，取2μL滴于铝箔纸上，室温干燥，喷金处理后表征。

(4)细菌性眼内炎动物模型建立

所有大鼠眼内注射10μL S.aureus溶液(100CFU)建立大鼠眼内炎模型，随机分为四组进行后续实验，于S.aureus菌液注射后1h进行干预治疗。

分组如下：

Control组：10μL 1x PBS，孵育15min，光照30min；

RB+Light组：10μL，0.1μM RB，孵育15min，光照30min；

TTPy+Dark组：10μL，0.1μM TTPy，孵育15min，暗处30min；

TTPy+Light组：10μL，0.1μM TTPy，孵育15min，光照30min。

(5)眼表照相、临床炎症评分

在进行干预治疗后的不同时间点(6h、12h、1d、3d和7d)进行裂隙灯照相，记录眼部感染及炎症表现，进行临床炎症评分(Clinical inflammation score，CIS)。

通过裂隙灯记录了治疗后的眼表情况来观察S.aureus感染和炎症情况并进行量化。

(6)房水总蛋白浓度测定

在进行干预治疗后的不同时间点将大鼠麻醉处死后，迅速摘取眼球，置于干冰上快速冷冻。将冷冻好的眼球于冰上沿角膜缘切开，收集房水于离心管中，-80℃保存。将收集到的房水离心5min后，上清稀释30倍。采用BCA法进行房水总蛋白浓度测定，酶标仪540nm下测定孔板OD值。蛋白浓度数值以平均值±标准差表示。

(7)眼球病理切片HE染色

在不同时间点处死大鼠并摘除眼球，于眼球固定液中固定过夜。按照前述方法进行脱水、透明、包埋、切片、脱蜡、染色，在光学显微镜下观察前房、睫状体、玻璃体、视网膜病理学变化。

12h时可见所有眼球明显白色纤维素渗出，瞳孔粘连(图19)。

如图20所示，其中TTPy+Light组和RB+Light组的临床炎症评分较高，差异有统计学意义。

治疗后24h时均可看到明显的角膜水肿及前房纤维素大量渗出，瞳孔粘连。其中TTPy+Light组炎症最轻，RB+Light组的炎症表现最重。7d后Control组和TTPy+Dark组前房内仍有少量的纤维素未吸收。玻璃体内炎症与前节表现保持一致(如图22)，12h时所有大鼠玻璃体内出现明显的炎症细胞浸润，TTPy+Light组和TTPy+RB组的炎症细胞计数明显增多，炎症较强；而24h时TTPy+Light组炎症细胞计数明显减少，感染和炎症得到控制，视网膜结构在感染过程中得到了有效保护(如图23所示)，而其他三组视网膜均有不同程度的破坏。

(8)ELISA检测炎症因子

在进行干预治疗后的不同时间点将大鼠麻醉、脱颈处死后，迅速摘取眼球置于干冰上快速冷冻。晶体去除后收集玻璃体液，通过TNF-α、IL-1β、CXCL1、γ-IFN的ELISA检测试剂盒来检测玻璃体腔内四种眼内炎常见因子的含量。

如图24所示，CXCL1最早达到高峰，3-6h时TTPy+Light组和RB+Light组的明显高于其他组，其可募集更多的中性粒细胞到感染部位。

如图25所示，12h前也观察到TTPy+Light组玻璃体中TNF-α水平较高，其可导致中性粒细胞和单核细胞更早、更多地浸润玻璃体腔中。而且TTPy+Light组中CXCL1和TNF-α水平恢复更快，说明血视网膜屏障恢复较快，渗出的中性粒细胞减少。

如图26所示，12h和1d时Control组和TTPy+Dark组IL-1β显著升高，可能由于玻璃体腔中增殖的细菌分泌大量α-毒素引起。

此外，如图27所示，TTPy+Light组显示出较低的IFN-γ水平，表明后期其巨噬和淋巴细胞浸润较少。

如图28所示，TTPy+Light组和RB+Light组的中性粒细胞数量在12h时明显多于其他组，与之前的结果一致，并再次验证了TTPy的抗菌诱导了更快的固有免疫应答。然而24h的Control组和TTPy+Dark组中，大量中性粒细胞浸润入玻璃体腔，引起严重的炎症和组织损伤。

如图29和图30所示，体外transwell试验结果表明，TTPy和RB组的中性粒细胞在光照后1d更早地迁移入小室下室。

上述研究结果表明，TTPy的光动力抗菌可能导致早期的固有免疫应答，中性粒细胞更早地募集到玻璃体腔中的感染部位，这不仅限制了感染的传播，还保护了视网膜免受与炎症相关的组织损伤。

根据上述实施例，总结与效果如下：

1、低浓度TTPy在光照条件下选择性杀灭金黄色葡萄球菌(S.aureus)，对眼部正常细胞无明显毒性，表明TTPy的高效抗菌潜力，克服现有技术中细菌耐药性的潜在问题。

2、TTPy的高效杀菌触发了早期固有免疫反应，更早地募集中性粒细胞到玻璃体腔的感染部位，限制了感染的扩散，同时抑制了暴发性炎症的发生，保护视网膜免受炎症相关的组织损伤。

3、RB在杀菌后造成严重的视网膜损伤，不可避免的导致大鼠视功能丧失，而本方案提供的TTPy在有效杀菌的同时可以更好的保护视网膜结构，极大限度的保留大鼠的视觉功能。

本方案所提供的新型抗菌疗法，不仅成功利用AIEgens进行光动力抗菌研究，还在细胞及动物水平中验证了TTPy的安全性和有效性，为该类分子的下一步抗菌应用奠定了基础。

与目前临床上常用的玻璃体腔注射抗生素治疗细菌性眼内炎相比，本疗法不仅可以解决现有情况中存在潜在细菌耐药性和视网膜毒性的问题，且治疗效果更好，治疗时间、治疗花费更少，还能解决传统光敏剂聚集荧光淬灭的缺点，通过较低的给药浓度即可达到良好的杀菌效果。高效抗菌能力和低细胞毒性是非常适合用于光动力治疗的媒介，也为细菌性眼内炎提供新的治疗策略。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。