一种利用自组装肽培养心脏类器官的方法及心脏类器官

摘要

本发明公开了一种利用自组装肽培养心脏类器官的方法及心脏类器官，方法包括以下步骤：S1、单个人诱导性多能干细胞在悬浮培养条件下自组织成胚状体；S2、RAD16‑I SAP 3D培养；S3、心肌类器官分化，诱导培养基中培养；综上，本发明提供的利用单个hiPSCs在悬浮培养条件下自组织成胚状体的能力，和通过触发RAD16‑I自组装成3D纳米纤维网络模拟天然细胞外基质ECM，使细胞经历真正的三维空间，以及二者组合情景下心脏定向分化，体外产生人心脏类器官和更成熟hiPSC‑CMs细胞。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体是一种利用自组装肽培养心脏类器官的方法及心脏类器官。

背景技术

心脏类器官可以概述胚胎内心脏发育过程，模拟人类疾病，以及筛选新药和评价药物心脏毒性，甚至产生成熟心肌组织补片。尽管大范围组织类器官已经问世，但是心脏类器官领域的进展却是有限的。目前产生人心脏类器官的方法主要分为两种：1)胚状体(EB)定向心脏分化；2)预分化人多能干细胞(hPSCs)来源心肌细胞(CMs)，包括人胚胎干细胞来源心肌细胞(hESC-CMs)和人诱导性多能干细胞来源心肌细胞(hiPSC-CMs)，与其它心脏谱系细胞共培养，如血管内皮细胞(ECs)、血管平滑肌细胞(SMAs)、心内外膜细胞，以及心脏成纤维细胞等。

中国专利CN113699098A公开了一种三维血管化心肌组织(心脏类器官)及其制备方法和应用，其解决的问题在于体外构建血管化心肌组织和利用3D打印技术制备大尺寸血管化心肌组织。主要步骤包括hPSCs于低粘附培养板中聚集成球，逐步添加中胚层、血管谱系诱导因子，消化早期血管细胞球成单细胞，用hanging drop方法与CMs聚集成球，悬浮培养，包埋于水凝胶培养，添加血管分化与诱导因子，解剖方法分离水凝胶，低粘附培养板中诱导血管网自组装和血管化心脏类器官成熟。该体外心脏类器官的构建，操作步骤繁杂；产生的心脏类器官成份复杂度低，仅包括CMs和ECs；期间须不断更换不同培养基：水凝胶成份复杂，为Collagen I和Matrigel按1:2混合，且Matrigel存在批次间差异。

中国专利CN112041429A公开了用于产生心脏类器官的方法，其解决的问题在于体外产生遗传正、异常的有邻近层的心脏类器官，心脏类器官长期培养，以及测试化合物对心脏类器官的作用。主要步骤包括接种一定数量hPSCs于U型底培养板，离心强制形成聚集体，Matrigel包埋，Matrigel凝固，添加培养基，更换诱导培养基，按时添加中胚层和心脏诱导剂。该体外心脏类器官的构建，需借助U型底培养板或超低粘附培养板，并依靠离心强制聚集成球；须接种一定数量(5000)或范围细胞，以及依赖特定基质胶(动物来源Matrigel)。

Zweigerdt R等报道了一种单个hPSCs悬浮培养方法。基于该方法，经过4-7天的培养，hPSCs不但数量可以扩增高达6倍，而且可以自发组织形成平均直径范围约200-525μmEB或聚集体。而RAD16-I作为一种人工合成、商业可用、生物相容和生物可降解的SAP材料，具有仿生性，无免疫原性和无细胞毒性，易于生产，不存在批次间差异。当有单价阳离子，如Na+、K+等出现时，或生理条件下，RAD16-I自组装成直径约为10纳米、孔径为50-200纳米、含水量超过99％的3D纳米纤维网络水凝胶。这种3D环境模拟天然ECM，使细胞能够真正经历三维空间；这种3D环境促进细胞-细胞和细胞-基质的相互作用，允许细胞在特定的实验条件下自由生长、增殖和分化。此外，RAD16-I还可通过改变自身浓度来控制所培养细胞的机械性能。

发明内容

本发明提供了一种利用自组装肽培养心脏类器官的方法及心脏类器官，具有重要的意义和临床应用价值。

为达此目的，本发明提供如下的技术方案：

本发明的第一个方面，提供了一种利用自组装肽培养心脏类器官的方法，包括以下步骤：

S1、单个人诱导性多能干细胞在悬浮培养条件下自组织成胚状体；

S2、RAD16-I SAP 3D培养；

S3、心肌类器官分化，诱导培养基中培养。

优选的，步骤S2包括：

S21、步骤S1中悬浮培养中形成的胚状体转移至离心管；

S22、静置，吸去培养基，用含Y27无菌蔗糖溶液重悬；

S23、静置，并吸去蔗糖溶液，用RAD16-I SAP溶液重悬；

S24、加入适应液适应。

优选的，步骤S3包括：

S31、吸去步骤S2中的溶液，加入RPMI+B27-Ins溶液；

S32、再加入8-10μM CHIR抑制细胞凋亡；

S33、一定时间后，再更换为RPMI+B27-Ins溶液；

S34、再一定时间后，培更换RPMI+B27-Ins，补充3-5μM IWR-1；

S35、此后，每隔一段时间更换一次诱导培养基，直至分化成心脏类器官。

优选的，步骤S24的适应液为含L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基，添加64mg/ml抗坏血酸2-磷酸三钠盐，70μg/ml亚硒酸钠，50mg/ml转铁蛋白，4mg/ml胰岛素，200ng/μl碱性成纤维细胞生长因子，200ng/μl转化生长因子β1，1.2g碳酸氢钠。

优选的，步骤S23的RAD16-I溶液的配置方法为：用10％无菌蔗糖溶液配制1％RAD16-I SAP贮存液，超声处理30min，防止气泡产生，0.22μm滤网过滤，分装，4℃贮存、备用；使用时，将1％RAD16-I SAP贮存液用10％蔗糖溶液稀释成工作液。

优选的，所述RAD16-I溶液的使用浓度为0.2％。

优选的，所述CHIR为CHIR99021。

优选的，一种利用自组装肽培养心脏类器官的方法，包括以下步骤：

步骤一、SR培养包括胚状体形成和RAD16-I SAP 3D培养，胚状体形成在6孔板内进行，将hiPSCs消化成单个细胞，并进行悬浮培养；

步骤二、24h后hiPSCs自组织成胚状体，4天后转入下一步的RAD16-I 3D培养；

步骤三、RAD16-I SAP 3D培养在24孔板内进行，将前述悬浮培养中形成的胚状体转移至15ml离心管；

步骤四、静置10min，吸去培养基，用10％含Y27无菌蔗糖溶液重悬；

步骤五、再次静置10min，并吸去蔗糖溶液，用0.2％RAD16-I SAP溶液重悬，其中0.2％RAD16-I SAP溶液的配置方法为：用10％无菌蔗糖溶液(w/v)配制1％RAD16-I SAP贮存液(w/v)，超声处理30min，防止气泡产生，0.22μm滤网(MILLEX)过滤，分装，4℃贮存(短期内)，备用；最后，为了进行SR培养，将1％RAD16-I SAP贮存液稀释成终浓度为0.2％工作液(用10％蔗糖溶液稀释)；

步骤六、接种至24孔板，适应1天后开始诱导(D0)，加入E8适应液(含L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基，添加64mg/ml抗坏血酸2-磷酸三钠盐，70μg/ml亚硒酸钠，50mg/ml转铁蛋白，4mg/ml胰岛素，200ng/μl碱性成纤维细胞生长因子，200ng/μl转化生长因子β1，1.2g碳酸氢钠)；

步骤七、E8适应液适应1天后(D1)更换为RPMI+B27-Ins(1x RPMI Medium 1640，B-27minus Insulin)；

步骤八、补充10μM CHIR(CHIR99021，Selleck，S2924)抑制细胞凋亡；

步骤九、第二天(D2)再更换为RPMI+B27-Ins；

步骤十、第三天(D3)，培更换RPMI+B27-Ins，补充5μM IWR-1(Sigma，I0161)；

步骤十一、此后，每两天更换一次诱导培养基，通常，开始诱导后第8-9天可以看到跳动的细胞球，即分化为有跳动hiPSC-CMs的心肌器官。

本发明的第二个方面，提供了一种心脏类器官，所述心脏类器官采用本发明所述的利用自组装肽培养心脏类器官的方法制备。

与现有技术相比，本发明有益效果及显著进步在于：

1、本发明主要集中在通过同时利用hiPSCs自组织成胚状体的能力和RAD16-I SAP3D培养(SR)，以及胚状体定向心脏分化，促进hiPSC-CMs增殖、分化和成熟，以及包含CMs、ECs和SMAs的含腔人心脏类器官形成，同时伴有内胚层组织产生，为基础和临床研究提供人心脏类器官新模型和更成熟CMs细胞资源；

2、本发明提供的心脏类器官包含CMs、ECs和SMAs，同时伴随内胚层组织产生；人心脏类器官具有钙离子处理能力，钙离子峰频率与hiPSC-CMs收缩频率一致；

3、本发明利用hiPSCs自组织能力，在悬浮培养条件下形成胚状体，不受接种一定数量或范围细胞限制和无须离心强制聚集细胞成胚状体或聚集体；

4、本发明中的RAD16-I是一种人工合成、商业可用、生物相容和生物可降解的SAP材料，具有仿生性，无免疫原性和无细胞毒性，易于生产，不存在批次间差异。

附图说明

为更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对本发明的实施例所需使用的附图作一简单介绍。

显而易见地，下面描述中的附图仅是本发明中的部分实施例的附图，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图，但这些其他的附图同样属于本发明实施例所需使用的附图之内。

图1为本发明实施例1的基于胚状体形成和RAD16-I SAP 3D(SR)培养定向心脏分化产生含腔人心脏类器官流程示意图；

图2为本发明实施例1的悬浮培养中hiPSCs自组织成EBs；

图3为本发明实施例1的EBs转移至RAD16-I SAP水凝胶3D环境后，EBs圆形指数和直径继续增大；

图4为本发明实施例1的Mito tracker green、TMRM和Hoechst染色共聚焦显微镜成像；

图5为本发明实施例1的人心脏类器官整体固定cTnT免疫组织化学染色；

图6为本发明实施例1的人心脏类器官冰冻切片cTnT免疫组织化学染色；

图7为本发明实施例2的人心脏类器官cTnT免疫细胞化学染色；

图8为本发明实施例2的人心脏类器官冰冻切片HE染色；

图9为本发明实施例2的人心脏类器官冰冻切片α-actinin、SOX17、SMA和CD31染色；

图10为本发明实施例2的人心脏类器官钙瞬变，显示钙离子峰频率与收缩频率一致；

图11为本发明实施例3的传统2D培养和SR培养衍生物多能干性相关基因、心脏发育相关基因、肌节相关基因和离子通道相关基因RT-qPCR分析结果直方图；

图12为本发明实施例3的传统2D培养和SR培养衍生物cTnT免疫细胞化学染色、圆形指数、肌节长度、周长、细胞面积和双核细胞比例统计直方图；

图13为本发明实施例3的传统2D培养和SR培养衍生物TMRM、MitoSOX和DCFH-AD染色以及相关统计直方图；

图14为本发明实施例3的传统2D培养和SR培养衍生物TEM图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案、有益效果及显著进步更加清楚，下面，将结合本发明实施例中所提供的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

显然，所有描述的这些实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

还需要说明的是，以下的具体实施例可以相互结合，对于其中相同或相似的概念或过程可能在某些实施例中不再赘述。

在本发明中，术语“hiPSCs”为人诱导性多能干细胞，最初是日本科学家山中伸弥(Shinya Yamanaka)团队在2006年利用病毒载体将四个转录因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)的组合转入到小鼠胚胎或皮肤纤维母细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的一种细胞类型。这些iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等都与胚胎干细胞极为相似。

在本发明中，术语“EB”为胚状体，离体培养条件下，没有经过受精过程，但是经过了胚胎发育过程所形成的胚状类似物，此现象无论在体细胞培养还是生殖细胞培养中均可以看到，因而统称为体细胞胚或胚状体。在离体植物细胞、组织或器官培养过程中，由一个或一些体细胞，经过胚胎发生和发育过程，形成与合子胚相类似的结构。胚状体一般专指在组织培养条件下产生的非合子胚以区别于自然发生的珠心胚及其他通过无融合生殖和由合子胚分裂产生的胚(见多胚现象)。

下面，以具体的实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1

实验方法：

1.1、RAD16-I SAP制备

RAD16-I SAP购自上海波泰生物科技有限公司。用10％无菌蔗糖溶液(w/v)配制1％RAD16-I SAP贮存液(w/v)，超声处理30min，防止气泡产生，0.22μm滤网(MILLEX)过滤，分装，4℃贮存(短期内)，备用。最后，为了进行SR培养，将1％RAD16-I SAP贮存液稀释成终浓度为0.2％工作液(用10％蔗糖溶液稀释)。

1.2、SR培养

1.2.1、按照图1所示流程进行。SR培养包括EB形成和RAD16-I SAP 3D培养。

1.2.2、EB形成在6孔板内进行，将hiPSCs消化成单个细胞，并进行悬浮培养。

1.2.3、24h后hiPSCs自组织成EB，4天后转入RAD16-I 3D培养。

1.2.4、RAD16-I SAP 3D培养在24孔板内进行，将前述悬浮培养中形成的EB转移至15ml离心管。

1.2.5、静置10min，吸去培养基，用10％含Y27无菌蔗糖溶液重悬。

1.2.6、再次静置10min，并吸去蔗糖溶液，用0.2％RAD16-I SAP溶液重悬。

1.2.7、最后，接种至24孔板，适应1天后开始诱导(D0)，E8(含L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基，添加64mg/ml抗坏血酸2-磷酸三钠盐，70μg/ml亚硒酸钠，50mg/ml转铁蛋白，4mg/ml胰岛素，200ng/μl碱性成纤维细胞生长因子，200ng/μl转化生长因子β1，1.2g碳酸氢钠)。发现二甲双胍处理可以明显提高老年小鼠的认知水平，且具有浓度依赖性。

如图2所示，为利用hiPSCs自组织能力，在悬浮培养条件下形成EB。

1.3、心肌类器官分化

1.3.1、E8适应1天后(D1)更换为RPMI+B27-Ins(1x RPMI Medium 1640，B-27minusInsulin)。

1.3.2、补充10μM CHIR(CHIR99021，Selleck，S2924)抑制细胞凋亡。

1.3.3、第二天(D2)再更换为RPMI+B27-Ins。

1.3.4、第三天(D3)培更换RPMI+B27-Ins，补充5μM IWR-1(Sigma,I0161)。

1.3.5、此后，每两天更换一次诱导培养基。

1.3.6、通常，开始诱导后第8-9天可以看到跳动的细胞球，即分化为有跳动hiPSC-CMs的心肌器官。

如图3所示，利用RAD16-I SAP水凝胶模拟ECM，将前述EB进行3D培养。所述EB直径继续增大，提示RAD16-I SAP 3D培养促进增殖。

实施例2

将实施例1获取的心脏类器官进行如下实验。

2.1、整体固定cTnT免疫组织化学染色

2.1.1、4％PFA固定，4℃过夜；

2.1.2、Tris缓冲盐水(TBS)洗涤，封闭缓冲液(TBS含5％BSA和0.25％Triton X-100)4℃孵育过夜；

2.1.3、含抗鼠cTnT一抗(Invitrogen，1:100)染色缓冲液(TBS含1％BSA)4℃孵育过夜；

2.1.4、TBS 4℃洗涤两次，每次1小时；

2.1.5、含山羊抗鼠二抗(Invitrogen，1:200)染色缓冲液4℃孵育两天；

2.1.6、TBS 4℃洗涤三次，每次1小时；

2.1.7、含DAPI抗荧光猝灭封闭溶液(Beyotime)染色，并封片；

2.1.8、LSM 880NLO(Zeiss)拍照。

2.2、冰冻切片cTnT免疫组织化学染色

2.2.1、4％PFA室温固定20min；

2.2.2、PBS常温洗涤三次，每次10min；

2.2.3、30％蔗糖溶液脱水，4℃过夜；

2.2.4、TBS 4℃洗涤两次，每次1小时；

2.2.5、OCT(

2.2.6、莱卡冰冻切片机切成5μm厚度切片，粘附玻片(CITOTEST)收集，备用；

2.2.7、含0.5％Triton X-100PBS常温洗涤3次，每次5min；

2.2.8、含1％BSA PBS常温封闭1h；

2.2.9、含抗鼠cTnT一抗(Invitrogen，1:100)染色缓冲液(含1％BSA和1％Tween20PBS)4℃孵育过夜；

2.2.10、含1％Tween 20PBS常温洗涤5min；

2.2.11、含山羊抗鼠二抗(Invitrogen，1:200)染色缓冲液(含1％BSA和1％Tween20PBS)常温孵育1h；

2.2.12、含1％Tween 20PBS常温洗涤3次，每次5min；

2.2.13、含DAPI抗荧光猝灭封闭溶液(Beyotime)染色，并封片；

2.2.14、LSM 880NLO(Zeiss)拍照。

2.3、cTnT免疫细胞化学染色

2.3.1、对于SR培养衍生物，含0.5mg/mlⅡ胶原蛋白酶(Worthington)DPBS常温孵育过夜，第二天TrypLE(GibcoTM)37℃5％CO2孵育5min；对于2D培养hiPSC-CMs，TrypLE(GibcoTM)37℃5％CO2孵育10min；

2.3.1、将上述1*10^5hiPSC-CMs接种至2腔室盖玻片(Cellvis)培养1天；

2.3.3、4％PFA室温固定20min；

2.3.4、含0.1％BSA 0.03％Triton X-100常温孵育10min；

2.3.5、含10％山羊血清(ThermoFisher Scientific)0.03％Triton X-100常温封闭1h；

2.3.6、含抗鼠cTnT一抗(Invitrogen，1:400)0.03％Triton X-1004℃孵育过夜；

2.3.7、0.03％Triton X-100常温洗涤3次，共10min；

2.3.8、含山羊抗鼠二抗(Invitrogen，1:1000)0.03％Triton X-100常温孵育1小时；

2.3.9、0.03％Triton X-100常温洗涤4次；

2.3.10、含DAPI抗荧光猝灭封闭溶液(Beyotime)染色，并封片；

2.3.11、LSM 880NLO(Zeiss)拍照分析。

2.4、TMRM、MtioSOX和DCFH-DA染色

2.4.1、同上将1*10^5hiPSC-CMs接种至2腔室盖玻片(Cellvis)培养1天；

2.4.2、根据制造商的说明，分别制备TMRM、MtioSOX和DCFH-DA贮存液，并用RPMI+B27-Ins稀释至各自工作浓度，37℃5％CO2分别孵育30、10、30min；

2.4.3、更换新鲜RPMI+B27-Ins；

2.4.4、LSM 880NLO(Zeiss)拍照分析。

上述实验结果如图4-9所示，Mito tracker green、TMRM和Hoechst染色-分别标记线粒体、线粒体膜电位和细胞核-共聚焦显微镜成像证实其形成真正3D样结构(图4)。整体固定cTnT免疫组织化学染色(图5)、冰冻切片cTnT免疫组织化学染色(图6)和cTnT免疫细胞化学染色(图7)证实其CMs身份。冰冻切片HE染色(图8)表明其形成包含腔室化样结构。本实施例的人心脏类器官包含CMs、ECs和SMAs，同时伴随内胚层组织产生(图9)。

实施例3钙瞬变

实验方法：

3.1、将SR培养衍生物转移至玻璃底培养皿(Thermoscientific)；

3.2、根据制造商的说明，制备Fluo-4,AM(Invitrogen)贮存液，并用RPMI+B27-Ins稀释至其工作浓度，37℃5％CO2分别孵育30min；

3.3、更换新鲜RPMI+B27-Ins；

3.4、LSM 880NLO(Zeiss)拍摄时间序列。

实验结果如图10所述，本实施例的人心脏类器官具有钙离子处理能力，钙离子峰频率与hiPSC-CMs收缩频率一致。

此外，本申请还采用背景技术中介绍的常规的传统2D培养人心脏类器官，并将传统2D培养的人心脏类器官与实施例1的方法培养的人心脏类器官进行实施例4和实施例5的对比实验。

实施例4 Q-PCR

实验方法：

4.1、提取RNA

利用RNA提取试剂盒提取RNA(货号：thermo-12183020)

4.2、cDNA合成

用诺唯赞的逆转录试剂盒(货号：R312-01)反转录1μg的RNA，用于合成cDNA

4.3、荧光定量PCR分析：1)用高灵敏染料SYBR进行PCR定量检测，检测试剂盒购于诺唯赞公司(货号：Q311-02)；2)按照说明书配制荧光定量PCR反应体系；3)利用Bio-rad实时荧光PCR检测仪进行目的片段扩增；4)通过2-ΔΔCt来计算不同样本间基因表达的差异；5)将结果制直方图。

实验结果如图11、12所示，与传统2D培养相比，本实施例的人心脏类器官显著降低多能干性相关基因，显著上调心脏发育、肌节和离子通道蛋白相关基因(图11)，促进hiPSC-CMs分化和成熟。与传统2D培养相比，本实施例的人心脏类器官显著降低圆形指数，显著增加肌节长度、周长、细胞面积和双核细胞比例(图12)，促进hiPSC-CMs成熟。

实施例5 TEM

实验方法：

5.1、样品室温固定30分钟；

5.2、含有1.5％戊二醛和1.5％甲醛的150mM HEPES缓冲液(pH 7.35)4℃过夜；

5.3、1％四氧化锇室温下固定2小时；

5.4、4％乙酸铀酰4℃过夜；

5.5、丙酮中脱水；

5.6、EPON包埋；

5.7、切片；

5.8、2％乙酸铀酰和柠檬酸铅染色；

5.9、透射电子显微镜(JEM-1230)观察。从3到5个独立实验进行分析。

实验结果如图13、14所示，与传统2D培养相比，本实施例的人心脏类器官促进hiPSC-CMs线粒体膜电位、超氧化物和活性氧(ROS)产量增加(图13)，促进hiPSC-CMs线粒体成熟。与传统2D培养相比，本实施例的人心脏类器官促进hiPSC-CMs线粒体含量、长宽比和面积增加(图14)，促进hiPSC-CMs线粒体成熟。

在上述说明书的描述过程中：

术语“本实施例”、“本发明实施例”、“如……所示”、“进一步的”、“进一步改进的技术分方案”等的描述，意指该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中；在本说明书中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例，而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点等可以在任意一个或者多个实施例或示例中以合适的方式结合或组合；此外，在不产生矛盾的前提下，本领域的普通技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合或组合。

最后应说明的是：

以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非是对其的限制；

尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，本领域技术人员根据本说明书内容所做出的非本质改进和调整或者替换，均属本发明所要求保护的范围。