一种用于快速直接二重PCR扩增的处理液、扩增体系及试剂盒

摘要

本发明涉及一种用于快速直接二重PCR扩增的处理液、扩增体系及试剂盒，具体公开了用于直接PCR扩增的预处理液，所述的预处理液为含有0.25mol/LNaOH和0.5mmol/L Na

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及多重荧光快速直接PCR扩增对样品进行预处 理的提取液、多重扩增体系及试剂盒。

背景技术

对于一些成熟的分子育种作物目前正在加速产业化应用。目前已有转基因作物获得了生 产应用生物安全证书，但这些优良的转基因品系一旦被批准商业化种植，目前已有的基于蛋 白的现场快速检测技术将难以适用，因此迫切需要建立能够鉴定转基因品系的外源核酸快速 分析技术以满足转基因产业化后对于作物田间现场检测的监管需求。

植物组织如种子，含有大量的多糖、蛋白质或脂类等物质，在进行植物成分PCR扩增前， 需要对样品核酸进行裂解、提取和纯化等处理。因此，现有核酸提取技术实验操作繁琐、周 期长，前处理中引入的化学试剂对后续PCR扩增造成抑制其高效扩增的影响以及PCR扩增 用时较长、依赖大型仪器难以实现现场快速分析。

基于PCR技术的分子生物学检测技术已经广泛应用于种子纯度鉴定、亲缘关系的分析、 分子标记辅助育种、基因定位以及转基因检测等。传统PCR扩增技术包括核酸提取、扩增和 检测。核酸提取主要有试剂法(如CTAB法、SDS法)、核酸提取试剂盒法等。然而这些方 法常常涉及核酸抽提、沉淀、洗脱等多个操作步骤，数个小时提取时间以及依赖离心机等大 型仪器等，并且试剂法需要用到氯仿等有毒试剂，而试剂盒提取成本较高。因此，传统的核 酸提取方法不利于大量样品的分析和检测，难以满足建立在核酸分析基础上开展的大规模现 场快速检测分析的要求。PCR扩增是目前应用最为成熟的技术，然而PCR扩增需要较长的反 应时间。核酸恒温扩增技术如LAMP、RPA虽然可以实现核酸快速扩增，然而该类技术的应 用研究仍处于起步阶段，在实际应用中存在成本高昂、引物设计复杂或易产生假阳性问题等 不足。扩增产物可以结合多种方法进行检测，如凝胶电泳、核酸试纸条、实时荧光等。凝胶 电泳检测繁琐耗时。核酸试纸条可以实现快速、便捷分析，然而由于引物二聚体和气溶胶污 染，容易产生假阳性结果。

专利CN 101575597A提供了碱裂解法，但该方法需要裂解液、中和液和沉淀液等多组复 杂成分，还需要高温煮沸、裂解、中和和沉淀等多个操作步骤，操作时间超过21min。CN103289991 A提供了基于特异性膜与DNA结合的植物种子DNA快速提取方法，但该方法需 要单独的裂解液、漂洗液和洗脱液等多组成分，还需要DNA吸附柱等装置。CN 101812445 A 提供了水稻DNA快速提取试剂盒、一种用于直接PCR扩增的组织液、扩增体系及试剂盒但 是该方法的预处理液成分复杂，PCR检测时间长。

发明内容

为了解决现有核酸提取技术实验操作繁琐、周期长，前处理中引入的化学试剂对后续PCR 扩增造成抑制其高效扩增的影响以及PCR扩增用时较长、依赖大型仪器难以实现现场快速分 析的问题，本发明提供一种用于直接PCR扩增的预处理液、PCR多重扩增体系及试剂盒。

本发明第一个方面提供了一种用于直接PCR扩增的预处理液，所述的预处理液为以体积 比为1:0.8-1.2的pH为8.0 100mmol/L的Tris-HCl和pH为8.0含有0.5mol/L NaOH的1.0 mmol/L Na

进一步地，所述的预处理液为以体积比为1:1的pH为8.0 100mmol/L的Tris-HCl和pH 为8.0含有0.5mol/L NaOH的1.0mmol/L Na

制得的预处理液含有0.25mol/L NaOH的0.5mmol/L Na

本发明第二个方面提供了一种PCR多重扩增的组合物，每单位PCR多重扩增的组合物 包括快速qPCR Mix 10μL；外源基因和内参基因的上下游引物各10μM，探针10μM；上述预处理液1μL，ddH

进一步地，快速qPCR Mix含有0.4mM dNTPs、0.4mM dUTP、5mM的Mg

进一步地，所述DNA聚合酶为具有5’到3’外切活性的DNA聚合酶。

进一步地，所述的PCR多重扩增体系用于检测含有CaMV 35S启动子序列的玉米时，所 选择的外源基因上游引物为CGTCTTCAAAGCAAGTGGATTG SEQ ID NO.13，下游引物 为TCTTGCGAAGGATAGTGGGATT SEQ ID NO.14，探针为 TCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCA SEQ IDNO.15；内参基因的上游引物为 CGGTGGATGCTAAGGCTGATG SEQ ID NO.16；下游引物为AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC SEQ ID NO.17；探针序列为 TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG SEQID NO.18。

进一步地，所述的PCR多重扩增体系用于检测含有CaMV 35S启动子序列的水稻时，所 选择的外源基因上游引物为CGTCTTCAAAGCAAGTGGATTG SEQ ID NO.13，下游引物 为TCTTGCGAAGGATAGTGGGATT SEQ ID NO.14，探针为 TCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCA SEQ IDNO.15；内参基因的上游引物为 TGGTGAGCGTTTTGCAGTCT SEQ ID NO.31；下游引物为CTGATCCACTAGCAGGAGGTCC SEQ ID NO.32；探针序列为 TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCTG SEQ IDNO.33。

进一步地，所述的PCR多重扩增体系用于检测含有T-NOS终止子序列的玉米时，所选 择的外源基因上游引物为CATGTAATGCATGACGTTATTTATG SEQ ID NO.40，下游引物 为TTGTTTTCTATCGCGTATTAAATGT SEQ ID NO.41，探针为 ATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAASEQ ID NO.42；内参基因的上游引物为 CGGTGGATGCTAAGGCTGATG SEQ ID NO.16；下游引物为 AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC SEQ ID NO.17；探针序列为 TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTGSEQ ID NO.18。

进一步地，所述的PCR多重扩增体系用于检测含有T-NOS终止子序列的油菜时，所选 择的外源基因上游引物为CATGTAATGCATGACGTTATTTATG SEQ ID NO.40，下游引物 为TTGTTTTCTATCGCGTATTAAATGT SEQ ID NO.41，探针为 ATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAASEQ ID NO.42；内参基因的上游引物为 GGCCAGGGCTTCCGTGAT SEQ ID NO.43；下游引物为CCGTCGTTGTAGAACCATTGG SEQ ID NO.44；探针序列为AGTCCTTATGTGCTCCACTTTCTGGTGCASEQ ID NO.45。

进一步地，所述的PCR多重扩增体系用于检测瑞丰12-5玉米种子时，所选择的外源基 因上游引物为GTCGTTTCCCGCCTTCAGTT SEQ ID NO.46，下游引物为GGTGCCTGGAAGACAAGTTCTA SEQ ID NO.47，探针为 AGCTCAACCACATCGCCCGACGC SEQ IDNO.48；内参基因的上游引物为 CGGTGGATGCTAAGGCTGATG SEQ ID NO.16；下游引物为AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC SEQ ID NO.17；探针序列为 TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG SEQID NO.18。

进一步地，外源基因探针5’端修饰有FAM，3’端修饰有BHQ1，内参基因探针5’端 修饰有HEX，3’端修饰有BHQ1。

本发明第三个方面提供了一种直接PCR扩增的试剂盒，所述试剂盒中包含上述用于直接 PCR扩增的预处理液和或上述PCR多重扩增的组合物。

本发明第四个方面提供了一种现场快速鉴定系统，所述现场快速鉴定系统包括上述直接 PCR扩增的试剂盒。

进一步地，还包含研磨仪、离心机和PCR仪。

进一步地，所述研磨仪为便携研磨仪，所述离心机为便携式离心机，所述PCR仪为小型 超速PCR仪。

本发明第五个方面提供了一种现场快速鉴定方法，所述方法包括以下步骤：

S1)组织预处理：将植物组织与预处理液加入研磨仪中研磨，取上清液即基因组DNA模 板；

S2)多重荧光PCR快速扩增：取上述基因组DNA模板作为PCR模板，以上述PCR多重扩增的组合物作为反应体系进行多重荧光实时PCR扩增。

优选地，S2)中PCR反应程序：98℃预变性60s，98℃变性6s，60℃退火延伸8s，40 个循环，40℃1s。

进一步地，S1)中研磨时加入预处理液200～400μL；研磨时间为25-35s；研磨后通过离 心分离上清，离心速度为8000转以上，离心时间为2分钟。

进一步地，所述植物组织选择植物种子或叶片。

进一步地，所述植物组织中的植物选自玉米、油菜、水稻。

本发明第六个方面提供了上述用于直接PCR扩增的预处理液、PCR多重扩增的组合物、 试剂盒、现场快速鉴定系统在用于现场快速鉴定中的用途。

进一步地，所述的现场快速鉴定为以未处理的植物种子或叶片为DNA来源，在30分钟 以内获得鉴定结果的方法。

本发明第七个方面提供了上述用于直接PCR扩增的预处理液作为将植物种子或叶片预处 理为能够进行PCR直接扩增的唯一处理液的用途。

具体来说，本发明提供一种操作简单、快速高效的用于直接PCR扩增的预处理液，用于 植物样品如种子等扩增前预处理，使得样品中DNA充分释放，除去可能抑制PCR扩增反应 的成分，为PCR扩增提供稳定的内环境。该预处理液的处理过程仅需3min，可替代现有的操作繁琐、价格昂贵的DNA提取过程，大大减少分析时间，提高效率。具体的由以下组分 混合而成：50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，含有0.25mol/L NaOH的0.5mmol/L Na

本发明还提供一种试剂盒，包括上述PCR预处理液以及多重荧光PCR扩增体系，具体 是利用上述预处理液得到植物基因组DNA粗提液作为模板进行外源核酸和内参基因二重荧 光快速PCR扩增，以提高分析通量、分析准确度和分析效率。PCR扩增体系为快速qPCRMix 10μL；外源基因和参内基因上下游引物(10μM)各0.8μL，外源基因和内参基因探针(10μM) 各0.4μL；样品预处理液1μL，ddH

有益效果

本发明中预处理液能够一步法完成种子等组织中基因组DNA的提取，与植物组织基因 组快速提取技术相关专利如CN 101575597A碱裂解法相比，无需包含裂解液、中和液和沉淀 液等多组复杂成分，无需高温煮沸、裂解、中和和沉淀等多个操作步骤，时间由21min大大 缩短至3min。与基于特异性膜与DNA结合的植物种子DNA快速提取技术如CN103289991 A相比，无需裂解液、漂洗液和洗脱液等多组成分，无需DNA吸附柱等装置。与一种水稻 DNA快速提取试剂盒CN 101812445 A、一种用于直接PCR扩增的组织液、扩增体系及试剂 盒CN 111254188 A等相比，预处理液成分得到大大简化，并且本发明采用多重荧光快速PCR 检测，进一步提高分析准确度，缩短分析时间。

本发明提供一种操作简单、快速高效的植物组织预处理液，在常温条件下仅需研磨样品30s，离心2min，上清液即可直接用于PCR扩增，全程处理时间控制在3min内。而市面上大 部分植物基因组DNA提取试剂盒大约需要1.5-2h，CTAB法需要大于2h。因此本方法大大 缩减了核酸提取所需时间。

本发明中预处理液能够一步法完成植物种子等组织中基因组DNA的提取，与植物组织 基因组快速提取技术相关专利如碱裂解法相比，无需包含裂解液、中和液和沉淀液等多组复 杂成分，无需高温煮沸、裂解、中和和沉淀等多个操作步骤，时间由21min大大缩短至3min。 与基于特异性膜与DNA结合的植物种子DNA快速提取技术相比，无需裂解液、漂洗液和洗 脱液等多组成分，无需DNA吸附柱等装置。与一种水稻DNA快速提取试剂盒、一种用于直 接PCR扩增的组织液、扩增体系及试剂盒等相比，预处理液成分得到大大简化，并且本发明 采用多重荧光快速PCR检测，进一步提高分析准确度，缩短分析时间。

本发明在快速预扩增液处理的基础上，经过大量组合测试，又提供一种多重荧光快速PCR 扩增体系，具体是利用上述预处理液得到植物基因组DNA粗提液作为模板进行外源核酸和 内参基因二重荧光快速PCR扩增，克服传统聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR扩增产物分析时繁 琐耗时的缺点，提高分析通量、分析准确度和分析效率。

现有直接扩增技术常采用3’—5’外切活性的高保真酶DNA聚合酶，对预处理液中复 杂化学成分具有较好的耐受性，然后无法进行基于TaqMan探针的实时荧光PCR分析，本发 明采用有5’到3’外切活性的DNA聚合酶，提高其对PCR普通抑制剂的耐受性，在具有良好耐受性的同时可以实现对于TaqMan探针的降解，从而能够实现PCR定量分析。该聚合酶还具有快速扩增的特点，结合便携式超速实时荧光PCR仪能够在30min完成植物组织处理和PCR扩增的全过程。区别于传统的植物基因组DNA提取需要加热裂解以及多个实验仪器的使用，本发明整个分析过程仅需一台便携式样品研磨仪研磨、一台便携式离心机，一台小型超速PCR仪，能够显著简化PCR分析流程、缩短分析时间，有利于纯度鉴定中单粒种子 或叶片高效检测以及作物品系现场快速鉴定。

目前满足上述高耐受性和快速扩增的5’到3’外切活性的DNA聚合酶有天筛(上海)科 技有限公司的TOROIVD 5G聚合酶和南京瑞启生物科技有限公司的SuperFast DNA聚合酶 等，本发明采用TOROIVD 5G聚合酶

此外，本发明筛选了外源基因和内参基因的引物和探针序列，获得了重复性好，灵敏度 高且更适合本发明快速检测系统的组合。

而且本发明的预处理液不但具有细胞膜溶解、蛋白变性，促进基因组DNA释放以及减 低干扰的问题，还能延长DNA储存时间到72小时以上。

附图说明

图1为35S-5与五组玉米内参引物实时荧光PCR扩增图。其中A为35S-5和玉米内参-1、 B为35S-5和玉米内参-2、C为35S-5和玉米内参-3、D为35S-5和玉米内参-4、E为35S-5 和玉米内参-5。

图2为玉米内参引物与5组CaMV35S启动子引物实时荧光PCR扩增图。其中A为35S-1和玉米内参-1、B为35S-2和玉米内参-1、C为35S-3和玉米内参-1、D为35S-4和玉米内参 -1、E为35S-5和玉米内参-1。

图3为玉米种子CaMV35S启动子与玉米内标二重荧光直接PCR扩增图。

图4为玉米叶片CaMV35S启动子与玉米内标二重荧光直接PCR扩增图。

图5为35S-5与2组水稻内参引物实时荧光PCR扩增图。其中A为35S-5和水稻内参-1、 B为35S-5和水稻内参-2。

图6为水稻内参1引物与5组CaMV35S启动子引物实时荧光PCR扩增图。其中A为35S-1 和水稻内参-1、B为35S-2和水稻内参-1、C为35S-3和水稻内参-1、D为35S-4和水稻内参 -1、E为35S-5和水稻内参-1。

图7为实施例3水稻种子CaMV35S启动子与水稻内标二重荧光直接PCR扩增图。

图8为玉米内参引物与2组T-NOS终止子实时荧光PCR扩增图。其中A为T-NOS和玉米内参-1、B为T-NOS和玉米内参-1。

图9为T-NOS终止子与五组玉米内参引物实时荧光PCR扩增图。其中A为T-NOS-2和玉米内参-1、B为T-NOS-2和玉米内参-2、C为T-NOS-2和玉米内参-3、D为T-NOS-2和玉 米内参-4、E为T-NOS-2和玉米内参-5。

图10为玉米叶片T-NOS终止子与玉米内标二重荧光直接PCR扩增图。

图11为玉米种子T-NOS终止子与玉米内标二重荧光直接PCR扩增图。

图12为瑞丰12-5转化体特异性引物与5组玉米内参引物实时荧光PCR扩增图。其中A 为瑞丰12-5和玉米内参-1、B为瑞丰12-5和玉米内参-2、C为瑞丰12-5和玉米内参-3、D为瑞丰12-5和玉米内参-4、E为瑞丰12-5和玉米内参-5。

图13为瑞丰12-5转化体特异性引物与玉米内参引物实时荧光PCR扩增图。

具体实施方式

本申请公开了一种可以用于直接PCR扩增的预处理液。该处理液操作简单、快速高效， 能够在常温条件下3min内一步法提取多种植物组织中基因组DNA，直接用于PCR扩增

在此基础上，本申请提供一种多重实时荧光快速PCR技术。利用预处理液得到的植物基 因组DNA粗提液作为模板针对目的基因进行外源基因和内参基因的同时快速荧光PCR扩增。

具体操作流程如下：

1.组织预处理：将植物组织如单粒种子、0.5～1cm

2.多重荧光PCR快速扩增：取上述预处理上清液1μL作为PCR模板，反应体系为20μL： 快速qPCR Mix 10μL，外源基因和参内基因上下游引物(10μM)各0.8μL，外源基因和内参基因探针(10μM)各0.4μL；样品预处理液1μL，ddH

其中直接PCR预扩增液的成分为：50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，含有0.25mol/LNaOH 的0.5mmol/L Na

快速扩增qPCR Mix含有0.4mM dA/C/G/T/UTP、5mM Mg

预处理中搭配使用便携式研磨仪和离心机，现有技术存在多种市售便携式研磨仪和离心 机，本发明选择上海净信实业发展有限公司的JXMF-03便携式样品研磨仪以及杭州欧米仪器 有限公司迷你离心机MINI-10K+C。

荧光快速PCR技术可以搭配便携式快速PCR扩增仪，以实现现场快速PCR检测，现有技术存在多种市售快速PCR扩增仪，本发明选择上海硕盟生物科技有限公司开发的便携式实 时荧光定量PCR仪，经测试该仪器与快速扩增酶QPT-200U适用性良好。

实施例1：预处理液成分优化

选取常用植物裂解液成分，以玉米种子为模型分析物，通过荧光直接PCR扩增考察30 种预处理液成分组合，如下表1所示，最终选取Ct值较小且重复性好的组合。

玉米组织预处理：取一粒种子样品放置到1.5mL离心管中，加入400μL预处理液(见表 1)，便携式样品研磨仪研磨30s，离心2min后取1μL上清液做模板进行PCR扩增。

配置实时荧光直接快速PCR体系20μL：快速qPCR Mix 10μL；上下游引物(10μM) 各0.8μL，探针(10μM)0.4μL；样品预处理液1μL，ddH

反向引物：5'-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'SEQ ID NO.17

探针：HEX-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-BHQ1 SEQ ID NO.18

实时荧光二重PCR扩增程序：98℃预变性60s，98℃变性6s，60℃退火延伸8s，40个循 环，40℃1s。

表1预处理液成分组成和PCT扩增结果

上述预处理也的配制方法为：以体积比为1:1的pH为8.0 100mmol/L的Tris-HCl和pH 为8.0含有0.5mol/L NaOH的1.0mmol/L Na

实验结果显示，并非组分越多或越简单实验结果越好，Ct值较小且重复性好的组合为50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，含有0.25mol/L NaOH的0.5mmol/L Na

其配制方法为：以体积比为1:1的pH为8.0 100mmol/L的Tris-HCl和pH为8.0含有0.5mol/L NaOH的1.0mmol/L Na

其中Na

上述预处理溶能够有效提取植物组织DNA成分，消除含有的大量PCR抑制因子，使得 到的基因组DNA无需复杂的纯化过程即可直接用于PCR反应。

实施例2：CaMV 35S启动子和玉米内参基因直接扩增二重荧光快速PCR

1.优化CaMV 35S启动子和玉米内参基因组合

选择含有CaMV 35S启动子序列的转基因玉米DBN9936为研究对象，引物探针序列详见 表1，共5对CaMV 35S启动子和5对玉米内参基因引物探针。采用先选择一组CaMV 35S启动子引物与所有玉米内参基因组合进行扩增，选出最优的玉米内参基因详见图2，然后将最优的玉米内参基因与所有的CaMV 35S启动子引物组合进行扩增，筛选最优引物探针组合图2，建立二重实时荧光PCR体系。

表2 CaMV 35S启动子和玉米内参基因引物探针序列

根据筛选结果选择最优的引物组合为35S-5与玉米内参-1，即35SF、35SR、35SP；zSSIIb-3F、zSSIIb-4R、zSSIIb-P。

2.玉米组织预处理

(1)玉米种子预处理：取一粒种子样品放置到1.5mL离心管中，加入400μL预处理液， 便携式样品研磨仪研磨30s，离心2min后取1μL上清液做模板进行PCR扩增。

(2)玉米叶片预处理：用离心管盖取0.5～1cm

3.CaMV 35S启动子与玉米内标二重荧光直接PCR扩增

(1)配置二重实时荧光PCR体系20μL：快速qPCR Mix 10μL；外源基因和内参基因上下游引物(10μM)各0.8μL，外源基因和内参基因探针(10μM)各0.4μL；样品预处理 液1μL，ddH

玉米内标基因zSSIIb正向引物：CGGTGGATGCTAAGGCTGATG SEQ ID NO.16；反向 引物：AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC SEQ ID NO.17；探针： HEX-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-BHQ1 SEQ ID NO.18。

(2)实时荧光二重PCR扩增程序：98℃预变性60s，98℃变性6s，60℃退火延伸8s，40个循环，40℃1s。

结果见图3-4以及表3-4。

表3玉米种子CaMV 35S启动子与玉米内标二重荧光直接PCR结果

表4玉米叶片CaMV 35S启动子与玉米内标二重荧光直接PCR结果

其中P为阳性对照，S1-3为样品1-3，N为阴性对照，每个样品平行进行三次。

实施例使用含有CaMV 35S启动子的玉米叶片及种子材料验证所筛选的CaMV 35S启动子和 玉米内参基因组合：35SF、35SR、35SP；zSSIIb-3F、zSSIIb-4R、zSSIIb-P，由实验结果可以 看出该引物组合可以成功鉴定出阳性样品及阴性样品，扩增曲线为典型的S型曲线，阳性样 品CaMV 35S启动子CT值与玉米内参CT值均小于30，且接近1:1。证明成功建立了CaMV 35S启动子和玉米内参基因二重检测方法。

实施例3：CaMV 35S启动子和水稻内参基因直接扩增二重荧光快速PCR

1.优化CaMV 35S启动子和水稻内参基因组合

选择含有CaMV 35S启动子序列的聚合多筛查元件的转基因水稻SD-rice(Anal.Bioanal.Chem.407:9153)为研究对象，引物探针序列详见表5，共5对CaMV 35S启 动子和2对水稻内参基因引物探针。采用先选择一组CaMV 35S启动子引物与所有水稻内参 基因组合进行扩增，选出最优的水稻内参基因详见图5，然后将最优的水稻内参基因与所有的CaMV 35S启动子引物组合进行扩增，筛选最优引物探针组合图6，建立二重实时荧光PCR体系。

表5 CaMV 35S启动子和水稻内参基因引物探针序列

根据筛选结果选择最优的引物组合为35S-5与水稻内参-1，即35SF、35SR、35SP；PLD-KVM159、PLD-KVM160、PLD-TM013。

2.水稻组织预处理

水稻种子预处理：取一粒种子样品放置到1.5mL离心管中，加入200μL预处理液，便携式样品研磨仪研磨30s，离心2min后取1μL上清液做模板进行PCR扩增。

3.CaMV 35S启动子与水稻内参PLD二重荧光直接PCR扩增

(1)配置二重实时荧光PCR体系20μL：快速qPCR Mix 10μL；外源基因和参内基因上下游引物(10μM)各0.8μL，外源基因和内参基因探针(10μM)各0.4μL；样品预处理 液1μL，ddH2O 5μL。其中CaMV 35S启动子正向引物：CGTCTTCAAAGCAAGTGGATTG SEQ ID NO.13；反向引物：TCTTGCGAAGGATAGTGGGATT SEQ ID NO.14；探针： FAM-TCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCA-BHQ1 SEQ ID NO.15。

水稻内参基因PLD正向引物：TGGTGAGCGTTTTGCAGTCT SEQ ID NO.31；反向引 物：CTGATCCACTAGCAGGAGGTCC SEQ ID NO.32；探针： HEX-TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCTG-BHQ1SEQ ID NO.33。

(2)实时荧光二重PCR扩增程序：98℃预变性60s，98℃变性6s，60℃退火延伸8s，40个循环，40℃1s。

实验结果见图7和表6。

表6水稻种子CaMV 35S启动子与玉米内标二重荧光直接PCR结果

其中P为阳性对照，S1-3为样品1-3，N为阴性对照，每个样品平行进行三次。

实施例使用含有CaMV 35S启动子的水稻种子材料验证所筛选的CaMV 35S启动子和水 稻内参基因组合：35SF、35SR、35SP；PLD-KVM159、PLD-KVM160、PLD-TM013，由实 验结果可以看出该引物组合可以成功鉴定出阳性样品及阴性样品，扩增曲线为典型的S型曲线，阳性样品CaMV 35S启动子CT值与玉米内参CT值均小于30，且接近1:1。证明成功建 立了CaMV 35S启动子和水稻内参基因二重检测方法。

实施例4：T-NOS终止子和玉米内参基因直接扩增二重荧光快速PCR

1.优化T-NOS终止子和玉米内参基因组合

选择含有T-NOS终止子序列的转基因玉米DBN9936为研究对象，引物探针序列详见表 7，共2对T-NOS终止子和5对玉米内参基因引物探针。采用先选择一组玉米内参基因与所有T-NOS终止子引物组合进行扩增，选出最优的T-NOS终止子引物详见图8，然后将最优的T-NOS终止子引物与所有的玉米内参基因引物组合进行扩增，筛选最优引物探针组合图9，建立二重实时荧光PCR体系。

表7 T-NOS终止子和玉米内参基因引物探针序列

根据筛选结果选择最优的引物组合为T-NOS-2与玉米内参-1，即180-F(T-NOS)、180-R(T-NOS)、180-P(T-NOS)；zSSIIb-3F、zSSIIb-4R、zSSIIb-P。

2.玉米组织预处理

(1)玉米种子预处理：取一粒种子样品放置到1.5mL离心管中，加入400μL预处理液， 便携式样品研磨仪研磨30s，离心2min后取1μL上清液做模板进行PCR扩增。

(2)玉米叶片预处理：用离心管盖取0.5～1cm

3.T-NOS终止子与玉米内标zSSIIb二重荧光直接PCR扩增

(1)配置二重实时荧光PCR体系20μL：快速qPCR Mix 10μL；外源基因和参内基因上下游引物(10μM)各0.8μL，外源基因和内参基因探针(10μM)各0.4μL；样品预处理 液1μL，ddH2O 5μL。其中T-NOS终止子正向引物：CATGTAATGCATGACGTTATTTATG； 反向引物：TTGTTTTCTATCGCGTATTAAATGT；探针： FAM-ATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAA-BHQ1。

玉米内参基因zSSIIb正向引物：CGGTGGATGCTAAGGCTGATG；反向引物：AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC；探针： HEX-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-BHQ1。

(2)实时荧光二重PCR扩增程序：98℃预变性60s，98℃变性6s，60℃退火延伸8s，40个循环，40℃1s。

结果见图10-11和表8-9。

表8玉米叶片T-NOS终止子与玉米内标二重荧光直接PCR结果

表9玉米种子T-NOS终止子与玉米内标二重荧光直接PCR结果

其中P为阳性对照，S1-3为样品1-3，N为阴性对照，每个样品平行进行三次。

实施例使用含有T-NOS终止子的玉米叶片及种子材料验证所筛选的T-NOS终止子和玉米内 参基因组合：180-F(T-NOS)、180-R(T-NOS)、180-P(T-NOS)；zSSIIb-3F、zSSIIb-4R、zSSIIb-P， 由实验结果可以看出该引物组合可以成功鉴定出阳性样品及阴性样品，扩增曲线为典型的S 型曲线，阳性样品CaMV 35S启动子CT值与玉米内参CT值均小于30，且接近1:1。证明成 功建立了T-NOS终止子和玉米内参基因二重检测方法。

实施例5：瑞丰12-5玉米转化体特异性序列和玉米内参基因直接扩增二重荧光快速PCR

1.优化瑞丰12-5玉米种子转化体特异性序列和玉米内参基因组合

选择瑞丰12-5为研究对象，利用农业部2259号公告-12-2015中的12-5转化体特异性引 物探针，及收集到的5对玉米内标引物探针，引物探针序列详见表10，12-5转化体特异性引 物和玉米内参基因引物两两组合配对，共计5个引物组合。筛选最优引物探针组合，建立二 重实时荧光PCR体系。

表10瑞丰12-5转化体和玉米内参基因引物探针序列

根据筛选结果选择最优的引物组合为瑞丰12-5转化体特异性引物与玉米内参-1，即 qSK12-5-5F、qSK12-5-5R、qSK12-5-5P；zSSIIb-3F、zSSIIb-4R、zSSIIb-P。

2.玉米组织预处理

玉米种子预处理：取一粒种子样品放置到1.5mL离心管中，加入400μL预处理液，便携式样品研磨仪研磨30s，离心2min后取1μL上清液做模板进行PCR扩增。

3.瑞丰12-5玉米转化体序列与玉米内标zSSIIb二重荧光直接PCR扩增

(1)配置二重实时荧光PCR体系20μL：快速qPCR Mix 10μL；外源基因和参内基因上下游引物(10μM)各0.8μL，外源基因和内参基因探针(10μM)各0.4μL；样品预处理 液1μL，ddH2O 5μL。其中瑞丰12-5玉米转化体正向引物：GTCGTTTCCCGCCTTCAGTT； 反向引物：GGTGCCTGGAAGACAAGTTCTA；探针： FAM-AGCTCAACCACATCGCCCGACGC-BHQ1。

玉米内参基因zSSIIb正向引物：CGGTGGATGCTAAGGCTGATG；反向引物：AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC；探针： HEX-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-BHQ1。

(2)实时荧光二重PCR扩增程序：98℃预变性60s，98℃变性6s，60℃退火延伸8s，40个循环，40℃1s。

(3)结果见图13和表11。

表11玉米种子瑞丰12-5转化体特异性引物与玉米内标二重荧光直接PCR结果

其中P为阳性对照，S1-3为样品1-3，N为阴性对照，每个样品平行进行三次。

实施例使用瑞丰12-5玉米种子材料验证所筛选的转化体特异性引物与玉米内标基因组合： qSK12-5-5F、qSK12-5-5R、qSK12-5-5P；zSSIIb-3F、zSSIIb-4R、zSSIIb-P，由实验结果可以 看出该引物组合可以成功鉴定出阳性样品及阴性样品，扩增曲线为典型的S型曲线，阳性样 品12-5转化体特异性方法CT值与玉米内参CT值均小于30，且接近1:1。证明成功建立了 12-5转化体特异性方法与玉米内标基因二重检测方法。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院油料作物研究所 南昌大学

<120> 一种用于快速直接二重PCR扩增的处理液、扩增体系及试剂盒

<130> CP122030184C

<160> 48

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgacagtggt cccaaaga 18

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aagacgtggt tggaacgtct tc 22

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tggaccccca cccacgagga gcatc 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

attgatgtga tatctccact gacgt 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tctctccaaa tgaaatgaac ttcct 25

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cccactatcc ttcgcaagac ccttcct 27

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcctctgccg acagtggt 18

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aagacgtggt tggaacgtct tc 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caaagatgga cccccaccca cg 22

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

catcattgcg ataaaggaaa ggc 23

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgctttgaag acgtggttgg a 21

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccgacagtgg tcccaaagat gg 22

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgtcttcaaa gcaagtggat tg 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tcttgcgaag gatagtggga tt 22

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tctccactga cgtaagggat gacgca 26

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cggtggatgc taaggctgat g 21

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

aaagggccag gttcattatc ctc 23

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

taaggagcac tcgccgccgc atctg 25

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cgtcgtttcc catctcttcc tcc 23

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ccactccgag accctcagtc 20

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

aatcagggct cattttctcg ctcctca 27

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ttggactaga aatctcgtgc tga 23

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gctacatagg gagccttgtc ct 22

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

caatccacac aaacgcacgc gta 23

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

cgctctgtac aagcgtgc 18

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gcaaagtgtt gtgcttggac c 21

<210> 27

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

cacgtgagaa tttccgtcta ctcgagc 27

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gccattgggt accatgaacc 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

tactgcatcc atgggttcat 20

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

agcttgatgg cgtgtccgtc cct 23

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

tggtgagcgt tttgcagtct 20

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

ctgatccact agcaggaggt cc 22

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

tgttgtgctg ccaatgtggc ctg 23

<210> 34

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

ttgcgcctga acggatat 18

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

cggttgatct tttcgggatg 20

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

tccgagccgt ccgtgcgtc 19

<210> 37

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

atcgttcaaa catttggca 19

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

attgcgggac tctaatcata 20

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

catcgcaaga ccggcaacag g 21

<210> 40

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

catgtaatgc atgacgttat ttatg 25

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

ttgttttcta tcgcgtatta aatgt 25

<210> 42

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

atgggttttt atgattagag tcccgca 27

<210> 43

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

ggccagggct tccgtgat 18

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

ccgtcgttgt agaaccattg g 21

<210> 45

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

agtccttatg tgctccactt tctggtgca 29

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

gtcgtttccc gccttcagtt 20

<210> 47

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

ggtgcctgga agacaagttc ta 22

<210> 48

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

agctcaacca catcgcccga cgc 23