一种地屈孕酮的制备方法

摘要

本发明公开了一种地屈孕酮的制备方法。本发明中制备方法包括如下步骤：将式Ⅰ所示的化合物进行光化学转化使C‑10位的甲基由β构型翻转为α构型，得到式Ⅱ所示的化合物；将所述式Ⅱ所示的化合物经过生物发酵，得到式Ⅲ所示的化合物；在质子酸条件下，经反应将所述式Ⅲ所示的化合物7,8位双键移位到6,7位，得到式Ⅳ所示的化合物；将所述式Ⅳ所示的化合物的21位羟基氧化为醛基，然后醛基进行烯胺化反应，最后C‑20位氧化为羰基，即得到式Ⅶ所示的地屈孕酮；本发明具有收率高、反应条件温和的特点，具有良好的应用前景；

说明书

技术领域

本申请涉及医药合成技术领域，具体涉及一种地屈孕酮的制备方法。

背景技术

地屈孕酮(Dydrogesterone)，又名去氢孕酮，化学名为9β,10α-孕甾-4,6-二烯-3,20-二酮，CAS号：152-62-5，地屈孕酮的化学式如下：

地屈孕酮以孕甾烷为母核，孕甾烷具有如下的骨架结构，具有ABCD四个环(从左到右，四个环依次定义为A、B、C和D)，碳的标号(1-21)如下，在下文中记为C-1位、C-2位等。

地屈孕酮既广泛用于保胎及预防流产，还广泛用于治疗内源性孕酮不足引起的各种疾病，如：痛经、子宫内膜异位症、继发性闭经、月经周期不规则、功能失调性子宫出血、经前期综合征、孕激素缺乏所致先兆性流产或习惯性流产、黄体不足所致不孕症等。

目前已知的一条合成路线是从麦角甾醇出发，经过光化学合成C-10α构型中间体，然后经过羟基氧化、双键臭氧氧化、烯胺化、最后氧化获得地屈孕酮。此过程需要用到臭氧氧化，存在安全风险，且副产物较多。

发明内容

本发明提供一种地屈孕酮的制备方法，包括如下步骤：

(1)将式Ⅰ所示的化合物进行光化学转化使C-10位的甲基由β构型翻转为α构型，得到式Ⅱ所示的化合物；

式Ⅰ和式Ⅱ中，

(2)将所述式Ⅱ所示的化合物经过生物发酵，得到式Ⅲ所示的化合物；

(3)在质子酸条件下，经反应将所述式Ⅲ所示的化合物7,8位双键移位到6,7位，得到式Ⅳ所示的化合物；

(4)将所述式Ⅳ所示的化合物的21位羟基氧化为醛基，得到式Ⅴ所示的化合物；

(5)将所述式Ⅴ所示的化合物的醛基进行烯胺化反应，得到式Ⅵ所示的化合物；

(6)将所述式Ⅵ所示的化合物的C-20位氧化为羰基，得到式Ⅶ所示的地屈孕酮；

在上述的方法中，所述光化学转化的过程如下：紫外光下开环，波长为270～295nm；然后经紫外光照射闭环，波长范围为300～350nm；

所述光化学转化采用的光源为紫外灯，采用的所述紫外灯具体可为紫外线高压汞灯或LED紫外灯；

当采用紫外线高压汞灯时，在所述光化学转化的反应器和光源之间设置容纳有滤光液的装置，使所述光源产生的光线透过滤光液，将光线滤光，再照射到反应器内；

所述滤光液为铜盐溶液。

相比LED紫外灯，采用紫外线高压汞灯(功率更大)成本更低，但紫外线高压汞灯光谱范围较宽(紫外区在254nm-365nm有广谱分布)，需要滤除对反应不利的光(例如254nm左右等波长的光)。在本发明的具体的一个实施例中，如果采用紫外线高压汞灯，优选在反应器和光源之间设置容纳有滤光液的装置，使光线先透过滤光液，将光线滤光，再照射到反应器内。

在上述的方法中，所述光化学转化的开环阶段，所述铜盐浓度为0.5～1wt％；闭环阶段，所述铜盐浓度为1.5～2wt％。所述滤光液具体可为硫酸铜、氯化铜等的水溶液；0.5～1wt％硫酸铜、氯化铜等的水溶液滤光后波长大部分大于270nm(基本滤掉270nm以下波长的光)，1.5～2wt％硫酸铜、氯化铜等的水溶液滤光后波长大部分大于300nm。开环时使用低浓度的滤光液有利于开环，有利于向所需构型转变，且减少对原料的破坏，而闭环需要更高浓度的滤光液，加强对低波长的过滤，让反应平衡向闭环偏移。

在上述的方法中，所述光化学转化在溶剂存在时进行；所述溶剂选自甲醇、乙醇、正己烷、石油醚、正庚烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、乙二醇和异丙醇中的至少一种；优选四氢呋喃/甲醇混合溶剂；

所述光化学转化的温度可为-20～50℃。

在上述的方法中，所述生物发酵所述生物发酵采用的菌属为分枝杆菌属；

所述分枝杆菌属具体菌种为分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRL B-3683。

在上述的方法中，所述生物发酵包括：将菌种经过斜面培养和种子培养后，分离出菌体，然后对式Ⅱ所示的化合物进行静息细胞生物转化，得到式Ⅲ所示的化合物。

在上述的方法中，所述斜面培养的培养基包括酵母膏0.01～0.02g/L，牛肉膏0.01～0.02g/L，甘油0.04～0.06g/L，氯化钠0.04～0.06g/L，蛋白胨0.04～0.06g/L；pH 7.1-7.2。

在上述的方法中，所述种子培养的培养基组分包括：柠檬酸1.5～2.5g/L，甘油15～25g/L，柠檬酸铁铵0.04～0.06g/L，七水硫酸镁1.2～1.8g/L，硝酸钠1.5～2.5g/L，磷酸氢二铵2～4g/L，玉米浆干粉0.5～1.5g/L，pH 7.3～7.7。种子培养包括摇瓶种子和种子罐培养两个阶段。所述种子罐培养条件为：25～35℃、250～350rpm、0.04～0.06MPa，溶氧饱和度DO>30％培养至对数生长期(48～64h)。

在上述的方法中，所述静息细胞生物转化条件如下：温度可为25～35℃，转速可为250～350rpm，溶氧饱和度可为5％～10％，时间可为96～180h。

区别于已知的一些甾体类发酵底物，C-10位的甲基为α构型，对发酵转化过程有一定影响，通过采用特定的发酵条件，转化收率较高。

在上述的方法中，所述式Ⅱ所示的化合物在进行所述静息细胞生物转化时，体系中加入增溶剂，助于原料溶解；

所述式Ⅱ所示的化合物与所述增溶剂的质量比可为10～40:100；

所述增溶剂包括羟丙基β环糊精。

上述的方法中，所述静息细胞生物转化的体系中还加入消泡剂；

所述增溶剂与所述消泡剂的质量比为100:2～10；

所述增溶剂具体包括羟丙基β环糊精。

在本发明的方法中，所述生物发酵的转化产物的分离纯化的过程如下：加入20％体积的氯仿，常温搅拌1小时，静置4小时，分层；下层液体过滤，滤饼淋洗，合并滤液，浓缩，甲醇置换至小体积，降温-20度冷冻1-2小时，过滤，烘干得到目标化合物。

在上述的方法中，所述质子酸选自盐酸、硫酸、高氯酸、冰醋酸、对甲苯磺酸和三氟乙酸中的至少一种；为了提高转化率，所述；质子酸优选是HCl，HBr等。

所述质子酸采用质子酸的醇溶液形式添加，添加至反应体系中；所述醇选自乙醇、异丙醇、丁醇和乙二醇中的至少一种，优选采用乙醇。

在上述的方法中，所述式Ⅲ所示的化合物的质量与所述质子酸的醇溶液的体积比可为1g：10mL～15mL(具体实施例中可记为10v～15v)；其中，所述质子酸的醇溶液中水的质量百分含量可为0～0.2％，所述质子酸的醇溶液中质子酸的质量百分含量可为25％～40％。

在上述的方法中，步骤(3)中还包括在反应的体系中添加抗氧化剂来抑制过氧化的杂质，提高收率；

所述抗氧化剂与所述式Ⅲ所示的化合物的质量比为0.8～1.2：100；

所述抗氧化剂包括抗坏血酸钠和/或TBHQ。

在本发明中，步骤(3)中结构式Ⅳ化合物的熔点较低，较难得到固体，且在高浓度酸下有一定程度变质成油，影响固体的性状；因此后处理时采用乙醇作为溶剂边搅拌边梯度降温得到固体，粗品再用正庚烷打浆除油，以获得较高的收率。

上述的方法中，所述式Ⅰ所示的化合物具体包括如下结构式：

所示式Ⅱ所示的化合物具体包括如下结构式：

本发明至少具有以下优点：

1、本发明采用了一条全新的路线合成地屈孕酮，工艺路线短，经发酵可以一步得到式Ⅲ化合物，式Ⅳ化合物为未见报道的新中间体化合物，避免了臭氧氧化带来的安全风险和副产物。

2、采用成本更低的紫外线高压汞灯作为光化学转化的光源，通过滤光，尤其是在开环、闭环不同阶段采用不同浓度的铜盐溶液滤光，有利于反应的进行和收率的提高。

3、式Ⅲ所示的化合物7,8位双键移位到6,7位步骤，由于化学结构的特殊性，该步反应对水分含量、质子酸的种类和浓度、质子酸量、质子酸醇溶液中醇的种类要求较苛刻，通过进行大量的实验研究，对上述条件控制，获得了较高的转化率。

综上，本发明具有收率高、反应条件温和的特点，具有良好的应用前景。

具体实施方式

除非另有定义，本文所用所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。若存在矛盾，则以本申请提供的定义为准。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。本文引用的所有专利、已经公开的专利申请和出版物均通过引用并入到本文中。

术语“一个(种)或多个(种)”或者类似的表述“至少一个(种)”可以表示例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个(种)或更多个(种)。

本文所用的表述m-n指m至n的范围以及由其中的各个点值组成的亚范围以及各个点值。例如，表述“C1-C6”或“C1-6“”涵盖1-6个碳原子的范围，并应理解为还涵盖其中的任意亚范围以及每个点值，例如C2-C5、C3-C4、C1-C2、C1-C3、C1-C4、C1-C5、C1-C6等，以及C1、C2、C3、C4、C5、C6等。

术语“烷基”是指由碳原子和氢原子组成的直链或支链的饱和的脂肪烃基团，其通过单键与分子的其余部分连接。“烷基”可以具有1-6个碳原子，即“C1-8烷基”，例如C1-4烷基、C1-3烷基、C1-2烷基、C3烷基、C4烷基、C1-6烷基、C3-6烷基。烷基的非限制性实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基或1,2-二甲基丁基，或者它们的异构体。

本发明的化合物可以存在特定的几何或立体异构体形式。本发明设想所有的这类化合物，包括顺式和反式异构体、(-)-和(+)-对对映体、(R)-和(S)-对映体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体，及其外消旋混合物和其他混合物，例如对映异构体或非对映体富集的混合物，所有这些混合物都属于本发明的范围之内。此类物质的纯化和分离可通过本领域已知的标准技术实现。

下述发明详述旨在举例说明非限制性实施方案，使本领域其它技术人员更充分地理解本发明的技术方案、其原理及其实际应用，以便本领域其它技术人员可以以许多形式修改和实施本发明，使其可最佳地适应特定用途的要求。

一种地屈孕酮的制备方法，包括如下步骤：

(1)将式Ⅰ所示的化合物进行光化学转化使C-10位的甲基由β构型翻转为α构型，得到式Ⅱ所示的化合物；

式Ⅰ和式Ⅱ中，

(2)将所述式Ⅱ所示的化合物经过生物发酵，，得到式Ⅲ所示的化合物；

(3)在质子酸条件下，经反应将所述式Ⅲ所示的化合物7,8位双键移位到6,7位，得到式Ⅳ所示的化合物；

(4)将所述式Ⅳ所示的化合物的21位羟基氧化为醛基，得到式Ⅴ所示的化合物；

(5)将所述式Ⅴ所示的化合物的醛基进行烯胺化反应，得到式Ⅵ所示的化合物；

(6)将所述式Ⅵ所示的化合物的C-20位氧化为羰基，即得到式Ⅶ所示的地屈孕酮

进一步的，所述光化学转化的过程如下：紫外光下开环，波长为270-290nm；然后经紫外光照射闭环，波长范围为300-330nm。

进一步的，光化学转化采用的光源为紫外线高压汞灯或LED紫外灯；

当采用紫外线高压汞灯时，在光化学转化的反应器和光源之间设置容纳有滤光液的装置，使光源产生的光线透过滤光液，将光线滤光，再照射到反应器内；

滤光液为铜盐溶液。

本发明中具体的一个实施例中，如果采用紫外线高压汞灯，优选在反应器和光源之间设置容纳有滤光液的装置，使光线先透过滤光液，将光线滤光，再照射到反应器内。

进一步的，所述光化学转化的开环阶段，所述铜盐浓度为0.5～1wt％；闭环阶段，所述铜盐浓度为1.5～2wt％。

所述滤光液具体可为硫酸铜、氯化铜等的水溶液；0.5～1wt％硫酸铜、氯化铜等的水溶液滤光后波长大部分大于270nm，1.5～2wt％硫酸铜、氯化铜等的水溶液滤光后波长大部分大于300nm。开环时使用低浓度的滤光液有利于开环，且减少对原料的破坏，而闭环需要更高浓度的滤光液，加强对低波长的过滤，减少原料的破坏，且让反应平衡向闭环偏移。

进一步的，所述光化学转化在溶剂存在时进行；所述溶剂选自甲醇、乙醇、正己烷、石油醚、正庚烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、乙二醇和异丙醇中的至少一种；优选四氢呋喃/甲醇混合溶剂；

所述光化学转化的温度可为-20～50℃。

进一步的，所述生物发酵采用的菌属为分枝杆菌属；

所述分枝杆菌属具体菌种为分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRL B-3683。

进一步的，所述生物发酵包括：将菌种经过斜面培养和种子培养后，分离出菌体，然后对式Ⅱ所示的化合物进行静息细胞生物转化，得到式Ⅲ所示的化合物；

所述静息细胞生物转化条件如下：温度为25～35℃，转速为250～350rpm，溶氧饱和度为5％～10％，时间为96～180h。

进一步的，所述式Ⅱ所示的化合物在进行所述生物发酵时，体系中加入增溶剂；

所述式Ⅱ所示的化合物与所述增溶剂的质量比可为10～40:100；

所述增溶剂包括羟丙基β环糊精。

上述的方法中，所述生物发酵的体系中还加入消泡剂；

所述增溶剂与所述消泡剂的质量比为100:2～10。

在本发明的方法中，所述生物发酵的转化产物的分离纯化的过程如下：加入20％体积的氯仿，常温搅拌1小时，静置4小时，分层；下层液体过滤，滤饼淋洗，合并滤液，浓缩，甲醇置换至小体积，降温-20度冷冻1-2小时，过滤，烘干得到目标化合物。

进一步的，所述质子酸选自盐酸、硫酸、高氯酸、冰醋酸、对甲苯磺酸和三氟乙酸中的至少一种；

所述质子酸采用质子酸的醇溶液形式添加；所述醇选自乙醇、异丙醇、丁醇和乙二醇中的至少一种，所述质子酸优选是HCl、HBr。

进一步的，所述式Ⅲ所示的化合物的质量与所述质子酸的醇溶液的体积比可为1g：10mL～15mL；其中，所述质子酸的醇溶液中水的质量百分含量可为0～0.2％，所述质子酸的醇溶液中质子酸的质量百分含量可为25％～40％。

进一步的，步骤(3)中还包括在反应的体系中添加抗氧化剂来抑制过氧化的杂质，提高收率；

所述抗氧化剂与所述式Ⅲ所示的化合物的质量比为0.8～1.2：100；

所述抗氧化剂包括抗坏血酸钠和/或TBHQ。

本发明中，步骤(3)中结构式Ⅳ化合物的熔点较低，较难得到固体，且在高浓度酸下有一定程度变质成油，影响固体的性状；因此后处理时采用乙醇作为溶剂边搅拌边梯度降温得到固体，粗品再用正庚烷打浆除油，以获得较高的收率。

进一步的，所述式Ⅰ所示的化合物具体包括如下结构式：

所示式Ⅱ所示的化合物具体包括如下结构式：

实施例1：

地屈孕酮的合成路线如下所示：

(一)光化

在光化反应瓶里加50g(130mmol)化合物1a和300mL四氢呋喃，300mL甲醇，5-10℃紫外线高压汞灯(500W)下先开环，开环时加滤光液(1wt％氯化铜水溶液)，光照8小时，HPLC监测原料：产物＝75：16左右，再补加滤光液(氯化铜浓度达到2wt％)，继续光照8h，HPLC监测，原料：产物＝58：30左右停止；有机相浓缩，甲醇置换至小体积，降温-20度冷冻1小时，过滤，烘干得白色固体20g，主要为原料；母液浓缩乙腈出料，降温-20度冷冻1小时，过滤，烘干得白色固体11g化合物2a，收率约22％。

经检测，

按上述反应步骤方法进行如下对比试验，具体对比实验的条件如表1所示，其它条件与本实施例相同。

表1实验条件和结果

由表1可知：化合物1a在甲醇中溶解性差，转化率低，收率低；而在溶剂性更好的四氢呋喃或者四氢呋喃/甲醇混合溶剂转化率高，收率高。

(二)发酵

化合物3a的制备：

(1)斜面培养，采用分枝杆菌为生产菌种，将分枝杆菌(Mycobacterium sp.NRRLB-3683菌体，购于江南大学微生物研究中心)，在斜面上划线，29℃培养4-5天，斜面活化2-3次。斜面培养基组分为：酵母膏0.015g/L，牛肉膏0.015g/L，甘油0.05g/L，氯化钠0.05g/L，蛋白胨0.05g/L；pH 7.1-7.2。

(2)种子培养，①摇瓶种子，取一支培养4～5天的分枝杆菌新鲜斜面，在无菌条件下用接种环刮取一环菌体接入100ml种子培养基中，30℃、200rpm培养至对数生长期(48～64h)。②10升罐种子培养，火圈保护下，将摇瓶种子接入10升罐中，接种量10％，30℃、300rpm、0.05MPa，溶氧DO>30％培养至对数生长期(48～64h)。种子培养结束，过滤或离心，菌体在pH＝8.0 0.05M的PBS中暂存。其中，种子培养基组分如下：柠檬酸2g/L，甘油20g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，七水硫酸镁1.5g/L，硝酸钠2g/L，磷酸氢二铵3g/L，玉米浆干粉1g/L，pH7.5，121℃高压蒸汽灭菌30min。

(3)静息细胞转化，分枝杆菌静息细胞以底物量2倍接入转化体系中，转化体系中投40g的化合物2a，转化条件，30℃、300rpm，DO 5％，转化96h，转化结束，化合物2a摩尔转化率大于90％，主产物为目标产物3a(约占55％左右)。其中，转化体系组分如下：消泡剂2g，羟丙基β环糊精100g，底物2a 10g，加入菌体，并用0.05M的PBS定容到1L。

(4)转化产物的分离纯化，加入20％体积的氯仿，常温搅拌1小时，静置4小时，分层；下层液体过滤，滤饼淋洗，合并滤液，浓缩，甲醇置换至小体积，降温-20度冷冻1小时，过滤，烘干得黄色固体12g，摩尔收率约35％。

(三)转位

化合物4a的制备：

在1L的三口烧瓶里加840mL的无水乙醇，低温通入干燥的氯化氢气体，制备得无水乙醇/氯化氢溶液(水分要小于0.2％，含量约35wt％)；在2L的三口烧瓶里，加70g(0.145mol)化合物3a和700mL二氯甲烷以及0.7g特丁基对苯二酚(TBHQ)，溶清，氮气保护，0℃～10℃下，滴加840mL自制的无水乙醇/氯化氢溶液，控温反应1小时左右，TLC检测原料剩余小于3％，加纯净水淬灭反应，分液，有机相用碳酸氢钠溶液洗至PH＝7～8，有机相50℃以下浓缩，乙醇置换，保留约500mL乙醇，边搅拌边梯度降温，黄色固体析出，降温-20℃冷冻1～2小时，过滤，粗品再用正庚烷打浆，冷析过滤，烘干得黄色固体4a 53.5g，摩尔收率约75％。

经检测：

质谱：C

按上述反应步骤进行表2中的对比试验，其它条件与本实施例相同。

表2实验条件和结果

注：以HCl/无水乙醇为例，表中v表示每g化合物3a所需的HCl/无水乙醇的体积量ml，12v表示每g化合物3a所需的HCl/无水乙醇的体积量12ml，5v表示每g化合物3a所需的HCl的体积量5ml。

由表2可知，该反应对水分要求高，浓盐酸或者95％乙醇反应转化率低，需要干燥的氯化氢气体/无水乙醇体系反应才能大大提高转化率。该反应对酸的浓度有要求，酸含量较低(20％)，转化率相对较低，酸含量在30-38％能到达到较好的效果。该反应对酸量有要求，10v～15v较为合适，太低转化率低，太高会导致产物降解，表现为后处理固体油性较重，难析出固体，收率降低。此外，反应跟酸的强度有关，浓硫酸，三氟乙酸以及三氟甲磺酸转化率也有差异。使用无水甲醇做溶液，转化率也较低，四氢呋喃和异丙醇做溶剂，转化率也低于无水乙醇。反应加抗氧化剂，可以抑制过氧化的杂质，提高收率。

化合物4a→5a→6a→7a的合成：

(1)4a→5a

在250mL的三口烧瓶里加30g(91.3mmol)化合物4a和150mL二氯甲烷，搅拌下加1.5g(9.6mmol)tempo和溶解好的1.08g溴化钠(10.5mmol)和30mL 5％的碳酸氢钠水溶液，氮气保护，降温0℃～5℃，滴加次氯酸钠，控温小于15℃，反应0.5～1小时。TLC监测反应完全。硫代硫酸钠溶液淬灭，搅拌10分钟，分液，有机相用食盐水洗涤一次，有机相50℃以下浓缩，石油醚置换至小体积。降温到0℃冷析2小时，过滤，滤饼用冰石油醚淋洗，烘干得28g固体化合物5a，摩尔收率约92％。

质谱：C22H30O2，327.0。

(2)5a→6a→7a(地屈孕酮)

在100mL的三口烧瓶里加28g(85.8mmol)化合物5a和42mL无水乙腈，搅拌下加22g(122mmol)环己烯哌啶(含量约90％)，氮气保护，40℃搅拌溶清，加冰醋酸，继续反应3-6小时，降温到-20℃，冷析2小时，过滤，滤饼用冰乙腈淋洗，抽干，固体35℃真空干燥箱烘，得28g化合物6a。

在100mL的三口烧瓶里加0.42g(4.2mmol)氯化亚铜和42mL DMF，氮气置换三次，加热至65℃，氮气保护保温搅拌1小时，降温至室温备用。在500mL的三口烧瓶里加28g(71.2mmol)化合物6a和280mL二氯甲烷，降温至0-5℃，加入氯化亚铜溶液，通入已干燥的空气，保持气体流量1L/min，反应4～8小时，TLC检测原料剩余小于2％，延长时间无变化则可停止。加入10％硫酸溶液淬灭，分液，加1％硫酸溶液洗涤有机相，有机相加0.43g醋酸，搅拌5分钟，再加6％亚氯酸钠溶液，室温搅拌30min，TLC原料几乎消失。加硫代硫酸钠淬灭，分液，有机相依次用0.5％氢氧化钠，食盐水洗涤，有机相50℃以下浓缩，水置换出料得粗品。粗品加280mL丙酮加热溶清，浓缩到小体积，降温到-20℃，冷析2小时，过滤，滤饼用冰丙酮淋洗，抽干，45℃烘箱烘干。得20g固体化合物7a，摩尔收率约74.6％。

经检测：

质谱：C21H28O2，313.0。

实施例2：

地屈孕酮的合成，其制备方法与本发明实施例1中不同点为化合物3a的合成方法不同(具体路线如下所示)，其余步骤及条件均相同。

在光化反应瓶里加50g(130mmol)化合物1b和300mL四氢呋喃，300mL甲醇，5-10℃紫外线高压汞灯(500W)下先开环，开环时加滤光液(1wt％氯化铜水溶液)，光照8小时，HPLC监测原料：产物＝72：18左右，再补加滤光液(氯化铜浓度达到2wt％)，继续光照8h，HPLC监测，原料：产物＝58：30左右停止；有机相浓缩，甲醇置换至小体积，降温-20度冷冻1小时，过滤，烘干得白色固体20g，主要为原料；母液浓缩乙腈出料，降温-20度冷冻1小时，过滤，烘干得白色固体10g化合物2b，收率约20％。

(2)发酵：

化合物3a的制备：

(1)斜面培养，采用分枝杆菌为生产菌种(来源同本发明实施例1)，将取自甘油管的菌株在斜面上划线，29℃培养4-5天，斜面活化2-3次。所述斜面培养基组分为：酵母膏0.015g，牛肉膏0.015g，甘油0.05g，氯化钠0.05g，蛋白胨0.05g；pH7.1-7.2。

(2)种子培养，①摇瓶种子，取一支培养4～5天的分枝杆菌新鲜斜面，在无菌条件下用接种环刮取一环菌体接入100ml种子培养基中，30℃、200rpm培养至对数生长期(48～64h)。②10升罐种子培养，火圈保护下，将摇瓶种子接入10升罐中，接种量10％，30℃、300rpm、0.05Mpa，溶氧DO>30％培养至对数生长期(48～64h)。种子培养结束，过滤或离心，菌体在pH＝8.0 0.05M的PBS中暂存。其中种子培养基组分如下：柠檬酸2g/L，甘油20g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，七水硫酸镁1.5g/L，硝酸钠2g/L，磷酸氢二铵3g/L，玉米浆干粉1g/L，pH7.5，121℃高压蒸汽灭菌30min。

(3)静息细胞转化，分枝杆菌静息细胞以底物量2倍接入转化体系中，转化体系中投40g的化合物2b，转化条件，30℃、300rpm，DO 5％，转化96h，转化结束，化合物2b摩尔转化率大于90％，主产物为目标产物3a(约占50％左右)。其中，转化体系组分如下：消泡剂2g，羟丙基β环糊精100g，底物2b 10g，加入菌体，并用0.05M的PBS定容到1L。

(4)转化产物的分离纯化，加入20％体积的氯仿，常温搅拌1小时，静置4小时，分层；下层液体过滤，滤饼淋洗，合并滤液，浓缩，甲醇置换至小体积，降温-20度冷冻1小时，过滤，烘干得黄色固体11.3g，摩尔收率约34％，即得到化合物3a。

化合物3a制备化合物4a，化合物4a→5a→6a→7a的合成方法及条件与本发明实施例1中完全相同。

实施例3：

其他步骤方法及条件与本发明实施例1中相同，不同点为发酵中化合物3a的制备步骤(3)-(4)，具体如下：

(3)静息细胞转化，分枝杆菌静息细胞以底物量2倍接入转化体系中，转化体系中投40g的化合物2a，转化条件，30℃、300rpm，DO 10％，转化180h，转化结束，化合物2a摩尔转化率大于90％，主产物为目标产物3a(约占53％左右)。其中，转化体系组分如下：消泡剂10g，羟丙基β环糊精100g，底物2a 40g，加入菌体，并用0.05M的PBS定容到1L。

(4)转化产物的分离纯化，加入20％体积的氯仿，常温搅拌1小时，静置4小时，分层；下层液体过滤，滤饼淋洗，合并滤液，浓缩，甲醇置换至小体积，降温-20度冷冻2小时，过滤，烘干得黄色固体11g，摩尔收率约32％。