一种分离纯化甘露二糖和甘露三糖的方法

摘要

本发明公开了一种分离纯化甘露二糖和甘露三糖的方法，涉及化合物的分离和提纯工艺。本发明对含2‑10糖的低聚甘露糖混合溶液先采用超滤的方式获得主要含1‑6糖的混合液，再纳滤后纳滤液中主要含甘露二糖和甘露三糖，4‑6糖主要以聚合形式存在，且含量低。通过氨基柱过滤纳滤液，第一峰段为甘露四糖‑甘露六糖的混合液，第二峰段为甘露三糖，第三峰段为甘露二糖。收集第二峰段和第三峰段的洗脱液，进行真空干燥，可获得高纯度的甘露二糖和甘露三糖，纯度可达到95%以上。本发明方法为获得高纯度的甘露二糖和甘露三糖开辟了新途径，且公开的方法操作简单、成本低、可连续化生产，适用于工业化大规模生产。

说明书

技术领域

本发明涉及低聚糖混合物的分离和提纯工艺，特别是一种分离纯化甘露二糖和甘露三糖的方法。

背景技术

低聚甘露糖(mannooligosaccharides，MOS)是指D-甘露糖以β-1,4-糖苷键相连的聚合度在2～10 之间的寡糖，又称甘露寡糖。其具有不被人体胃肠道消化，但可以促进生物体内以双歧杆菌为代表的肠道益生菌群的特异性增殖并抑制有害菌的生长，减少有毒代谢产物的生成，改善人体肠道功能的作用，防止便秘，保护肝脏，抗肿瘤及增强免疫力，可用作食品或饲料添加剂及保健食品。

进一步研究发现，不同聚合度的甘露糖其生物学功能不一样，如文献有报道甘露二糖和甘露三糖能显著抑制大肠杆菌对IPEC-1细胞的黏附与侵袭；甘露三糖具有促进造血细胞的增殖、提高免疫力、降血糖、抗肿瘤等药理活性等，不同聚合度的甘露糖作为功能性食品、药品等使用，有其广阔的用途。但是获得纯度较高的甘露二糖、甘露三糖等不同聚合度的甘露糖并不容易。

现有制备甘露二糖和甘露三糖的工艺不多，市场上多以标准品售卖，价格昂贵。甘露二糖市场上多为标准品，化学试剂，多是通过化学方法合成而得。甘露三糖报道的有水苏糖酸水解、纯化制备甘露三糖；熟地黄酸性条件下水解后，醇沉淀萃取获得化学合成制备三糖，但制备的质量尚不清楚。现有技术又报道采用内切甘露聚糖酶水解甘露聚糖，可获得以甘露2-10糖等为主的低聚甘露糖， 但是获得的还是混合糖液。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种从低聚甘露糖的混合溶液中分离纯化甘露二糖和甘露三糖的方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种分离纯化甘露二糖和甘露三糖的方法，它包括以下步骤：

S1. 超滤：将低聚甘露糖的混合溶液泵入超滤膜中，拦截分子量大于1000道尔顿的糖，当膜后压力高于膜前压力0.2MPa时，停止收集超滤液；

S2. 纳滤：将收集的超滤液采用纳滤膜进行浓缩，拦截分子量大于300道尔顿的糖，收集浓缩液，当浓缩液含糖量为15～25%时，停止纳滤；

S3. 氨基柱过滤：将步骤S2收集的浓缩液上样于DAC150的氨基柱，用60%的乙醇进行洗脱，分别收集第二峰段洗脱液和第三峰段洗脱液；

S4. 干燥：将第二峰段洗脱液和第三峰段洗脱液真空干燥，分别获得高纯度的甘露二糖和甘露三糖。

进一步地，步骤S1中所述低聚甘露糖的混合溶液采用酶解法酶解魔芋粉获得。

进一步地，所述酶解法酶解魔芋粉的具体操作为：魔芋粉中加入甘露聚糖酶并搅拌均匀，加入温度为45～55℃水中酶解至少4h，酶解过程中控制溶液的pH值为5～6，得低聚甘露糖的混合溶液。

进一步地，步骤S1中所述超滤膜为GE8040，超滤的膜前压力为0.5～0.8MPa。

进一步地，步骤S2中所述纳滤膜为HL4040，纳滤的膜前压力为0.7～1.0MPa。

进一步地，步骤S3中所述浓缩液与DAC150按体积比为1:1的比例装入氨基柱中。

进一步地，步骤S3中所述洗脱的洗脱速度为1L/min。

进一步地，步骤S4中所述真空干燥的条件为：温度65～70℃，真空度为0.06～0.07MPa。

本发明具有以下优点：本发明对含2-10糖的低聚甘露糖混合溶液先采用超滤的方式获得主要含甘露1-6糖（甘露6糖的分子量990）的混合液，再纳滤后得到甘露2-6糖混合液，纳滤液中主要含甘露二糖和甘露三糖，4-6糖主要以聚合形式存在，且含量低。通过氨基柱过滤纳滤液，第一峰段为甘露四糖-甘露六糖的混合液，第二峰段为甘露三糖，第三峰段为甘露二糖。收集第二峰段和第三峰段的洗脱液，进行真空干燥，可获得高纯度的甘露二糖和甘露三糖，纯度可达到95%以上。本发明方法可通过分离纯化不同聚合度的低聚糖混合液得到高纯度的甘露二糖和甘露三糖，而低聚糖的混合液可通过酶解法获得，比如酶解魔芋粉可获得大量的低聚甘露糖混合液，为获得高纯度的甘露二糖和甘露三糖开辟了新途径，且公开的方法操作简单、成本低、可连续化生产，适用于工业化大规模生产。

附图说明

图1为甘露聚糖酶酶解魔芋粉后所得的低聚甘露糖的混合溶液的高效液相色谱图。

图2为甘露聚糖酶酶解魔芋粉后所得的低聚甘露糖的混合溶液的硅胶板薄层层析图。

图3为经氨基柱过滤的第二峰段洗脱液和第三峰段洗脱液进行硅胶板薄层层析图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：

实施例1：一种分离纯化甘露二糖和甘露三糖的方法，它包括以下步骤：

S1. 超滤：魔芋粉中加入甘露聚糖酶并搅拌均匀，加入温度为45℃水中酶解4h，酶解过程中控制溶液的pH值为5，得低聚甘露糖的混合溶液，将低聚甘露糖的混合溶液泵入超滤膜GE8040中，拦截分子量大于1000道尔顿的糖，超滤的膜前压力为0.5MPa，当膜后压力高于膜前压力0.2MPa时，停止收集超滤液；

S2. 纳滤：将收集的超滤液采用纳滤膜HL4040进行浓缩，拦截分子量大于300道尔顿的糖，收集浓缩液，纳滤的膜前压力为0.7MPa，当浓缩液含糖量为15%时，停止纳滤；

S3. 氨基柱过滤：将步骤S2收集的浓缩液上样于DAC150的氨基柱，所述浓缩液与DAC150按体积比为1:1的比例装入氨基柱中，用60%的乙醇进行洗脱，洗脱速度为1L/min，分别收集第二峰段洗脱液和第三峰段洗脱液；

S4. 干燥：将第二峰段洗脱液和第三峰段洗脱液真空干燥，所述真空干燥的条件为：温度65℃，真空度为0.06MPa，真空干燥后分别获得高纯度的甘露二糖和甘露三糖。

实施例2：一种分离纯化甘露二糖和甘露三糖的方法，它包括以下步骤：

S1. 超滤：魔芋粉中加入甘露聚糖酶并搅拌均匀，加入温度为55℃水中酶解至少4h，酶解过程中控制溶液的pH值为6，得低聚甘露糖的混合溶液，将低聚甘露糖的混合溶液泵入超滤膜GE8040中，拦截分子量大于1000道尔顿的糖，超滤的膜前压力为0.8MPa，当膜后压力高于膜前压力0.2MPa时，停止收集超滤液；

S2. 纳滤：将收集的超滤液采用纳滤膜HL4040进行浓缩，拦截分子量大于300道尔顿的糖，收集浓缩液，纳滤的膜前压力为1.0MPa，当浓缩液含糖量为25%时，停止纳滤；

S3. 氨基柱过滤：将步骤S2收集的浓缩液上样于DAC150的氨基柱，所述浓缩液与DAC150按体积比为1:1的比例装入氨基柱中，用60%的乙醇进行洗脱，洗脱速度为1L/min，分别收集第二峰段洗脱液和第三峰段洗脱液；

S4. 干燥：将第二峰段洗脱液和第三峰段洗脱液真空干燥，所述真空干燥的条件为：温度70℃，真空度为0.07MPa，真空干燥后分别获得高纯度的甘露二糖和甘露三糖。

实施例3：一种分离纯化甘露二糖和甘露三糖的方法，它包括以下步骤：

S1. 超滤：魔芋粉中加入甘露聚糖酶并搅拌均匀，加入温度为50℃水中酶解至少4h，酶解过程中控制溶液的pH值为5.5，得低聚甘露糖的混合溶液，将低聚甘露糖的混合溶液泵入超滤膜GE8040中，拦截分子量大于1000道尔顿的糖，超滤的膜前压力为0.6MPa，当膜后压力高于膜前压力0.2MPa时，停止收集超滤液；

S2. 纳滤：将收集的超滤液采用纳滤膜HL4040进行浓缩，拦截分子量大于300道尔顿的糖，收集浓缩液，纳滤的膜前压力为0.8MPa，当浓缩液含糖量为20%时，停止纳滤；

S3. 氨基柱过滤：将步骤S2收集的浓缩液上样于DAC150的氨基柱，所述浓缩液与DAC150按体积比为1:1的比例装入氨基柱中，用60%的乙醇进行洗脱，洗脱速度为1L/min，分别收集第二峰段洗脱液和第三峰段洗脱液；

S4. 干燥：将第二峰段洗脱液和第三峰段洗脱液真空干燥，所述真空干燥的条件为：温度68℃，真空度为0.065MPa，真空干燥后分别获得高纯度的甘露二糖和甘露三糖。

取实施例1、实施例2和实施例3中魔芋粉中加入甘露聚糖酶酶解后所得的低聚甘露糖的混合溶液为三个样品，分别为样品1、样品2和样品3，对三个样品进行高效液相色谱检测，结果如图1所示，从图1可知：第一个峰主要是2-3糖，第二个峰主要是4-6糖，后面是更大分子量的糖液和其他杂质。

取实施例1、实施例2和实施例3中魔芋粉中加入甘露聚糖酶酶解后所得的低聚甘露糖的混合溶液为三个样品，分别为样品1、样品2和样品3，对样品进行硅胶板薄层层析，结果如图2所示，从图2可知，混合溶液中主要含甘露二糖和甘露三糖。

将实施例1步骤S3经氨基柱过滤的第二峰段洗脱液和第三峰段洗脱液进行硅胶板薄层层析，结果如图3所示，如图3可知：经本发明方法纯化后的产品，与图2未分离纯化的混合液对比，几乎看不见其他杂色点，纯度达到95%以上。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。