一种酶催化乳糖联产D-半乳糖和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的方法

摘要

本发明公开了一种酶催化乳糖联产D‑半乳糖和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的方法。所述方法是以乳糖为原料，加入β‑半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶。β‑半乳糖苷酶将乳糖转化为D‑半乳糖和D‑葡萄糖，葡萄糖氧化酶将D‑葡萄糖转化为葡萄糖酸并产生过氧化氢；过氧化氢酶水解过氧化氢产生水和氧气，解除过氧化氢对葡萄糖氧化酶的抑制作用。葡萄糖酸可以利用阴离子交换树脂分离出来，分别得到高纯度D‑半乳糖和葡萄糖酸。葡萄糖酸又可以与金属碱溶液反应生成相应的葡萄糖酸盐。本发明利用酶催化和简单的分离方法可以得到高纯度D‑半乳糖和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐，工艺简单、效率高，增加产品种类，提高生产效益，具有广阔的工业化应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酶催化乳糖联产D-半乳糖和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的方法。

背景技术

由于过量食用食糖对人体造成的负面影响，使得各种低热量代糖产品开始被大量应用。多数代糖产品为人工合成，具有低毒性，不利于身体健康，或存在其它缺点，不能很好地满足市场需求。例如，常用代糖中木糖醇过量食用会导致血脂升高；阿斯巴甜热稳定性差，不能用于长时间加热的焙烤食品；安赛蜜在高浓度时具有苦涩味以及金属味等。因此，稀有糖（rare sugar）的研究受到了人们的关注。稀有糖是自然界存在但数量极少的一类单糖或其衍生物。D-塔格糖（D-tagatose）属于稀有糖的一种，其实具有特殊保健功能的甜味剂。但D-塔格糖价格昂贵。D-塔格糖工业化生产是利用酶转化法以D-半乳糖（D-galactose）为底物异构化为D-塔格糖。作为D-塔格糖生产原料，D-半乳糖价格过高是造成D-塔格糖成本和售价过高的一个主要原因。因此，降低D-半乳糖生产成本是D-塔格糖大规模生产和应用的关键。

工业上，D-半乳糖是以乳糖（lactose）为底物，利用β-半乳糖苷酶水解得到的。乳糖是一种双糖，由一分子D-半乳糖和一分子D-葡萄糖以β-1,4-糖苷键相连。乳糖经β-半乳糖苷酶水解得到D-半乳糖和D-葡萄糖。为获得高纯度D-半乳糖需要将二者分离开来。但由于二者分子大小一致，其它理化性质极为相近，因此将它们分离开来十分困难，目前工业上普遍使用模拟移动床色谱（simulated moving bed chromatography, SMBC）进行分离。模拟移动床色谱设备复杂、价格昂贵，从而导致D-半乳糖生产工艺复杂，成本提高，限制了其大规模应用。因此，如果能将与D-半乳糖难以分离的D-葡萄糖转化成为带负电荷的葡萄糖酸，则易于与D-半乳糖分离，即使不使用昂贵的设备也能够生产出高纯度D-半乳糖，大大降低生产难度和生产成本。将D-葡萄糖转化为葡萄糖酸或葡萄糖酸盐还增加了产品种类和产品价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种工艺简单、有效、低成本、高收益的酶催化乳糖联产D-半乳糖和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的方法。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种酶催化乳糖联产D-半乳糖和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）以乳糖为原料，配制乳糖溶液；

（2）将β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶加入步骤（1）的乳糖溶液中，进行催化反应，得到反应液，离心，取上清液；

（3）将步骤（2）的上清液流过吸附树脂柱，吸附葡萄糖酸，得到含D-半乳糖的透过液；

（4）将步骤（3）的吸附树脂柱用酸溶液解吸，得到高纯度葡萄糖酸溶液；

（5）将步骤（4）的葡萄糖酸溶液中加入含金属离子的碱溶液至pH中性，得到含金属离子的葡萄糖酸盐溶液。

进一步的，所述步骤（1）中乳糖溶液的浓度为5%-20%。

进一步的，所述步骤（2）中β半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶为游离酶或固定化酶，三者的添加量分别为乳糖溶液质量的1%~30%。

优选的，所述步骤（2）中β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的添加量分别为乳糖溶液质量的10%、10%和6%。

进一步的，所述步骤（2）中催化反应的条件为pH 5-6，温度50℃-60℃，搅拌100rpm -200 rpm，催化反应时间1 h -10 h。

优选的，所述步骤（2）中催化反应的条件为pH 5.0，温度55℃，搅拌100 rpm，催化反应时间5 h。

进一步的，所述步骤（2）中将β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶三种酶同时加入；或者先加入β-半乳糖苷酶进行乳糖水解反应2-8 h，再加入葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶进行葡萄糖氧化反应4-8 h。

进一步的，所述步骤（2）中，若选择游离酶，则需对反应液进行灭酶活处理，其步骤具体为：将反应液加热至100℃并维持20 min使酶灭活；冷却至室温后8000 rpm-10000 rpm离心10 min-20 min，取上清液；若选择固定化酶，则不需对反应液进行灭酶活处理。

进一步的，所述β-半乳糖苷酶的固定化步骤为：在活化的硅胶载体中先加入2.0%的戊二醛溶液，在30 ℃摇床中反应3 h后用大量去离子水冲洗干净，再加入与所述硅胶载体质量体积比为1:10、pH 6的酶液和pH 6的缓冲液，放入30 ℃ 160 rpm的摇床继续反应过夜，反应后的溶液静置分离得到硅胶，再用缓冲液将固定化后的硅胶冲洗干净，得到固定化β-半乳糖苷酶。

具体的，所述β-半乳糖苷酶的固定化步骤为：将1g活化的硅胶载体放入三角瓶中，先加入5 mL 2.0%的戊二醛溶液，在30 ℃ 160 rpm的摇床中反应3 h后用大量去离子水冲洗干净，再加入5 mL、pH 6的缓冲液以及10 mL pH 6的酶液，放入30 ℃ 160 rpm的摇床继续反应过夜，反应后的溶液静置分离得到硅胶，再用缓冲液将固定化后的硅胶冲洗干净，得到固定化β-半乳糖苷酶。

进一步的，所述硅胶载体的活化步骤为：将硅胶加入到25 mL的活化液（0.8 mol/LNaOH:二甲亚砜：环氧氯丙烷=7:10:8）中40 ℃，170 rpm的摇床上反应2.5 h，将活化后的硅胶用大量的去离子水冲洗，直到冲洗液为中性为止；将活化后的硅胶加入到30 mL 17.5%的氨水中，将混合液放入30 ℃，160 rpm的摇床上反应过夜。反应结束后再用大量的去离子水冲洗硅胶直到冲洗液为中性为止；将制作好的硅胶晾干，得到硅胶载体。

进一步的，所述步骤（2）中去除酶催化剂的方法，对于游离酶加热使之变性失活并在10000 rpm离心20 min去除变性酶蛋白；对于固定化酶8000 rpm离心20 min去除固体催化剂。

进一步的，所述步骤（3）中的吸附树脂柱为阴离子交换树脂柱，具体为大孔苯乙烯系弱碱性阴离子交换树脂柱；所述透过液中D-半乳糖的浓度不低于93%。

进一步的，所述步骤（4）中酸溶液为稀盐酸，其浓度为0.5M。

进一步的，所述步骤（5）中金属离子包括钾、钠、钙、铁、锌、镁；碱溶液的浓度为5 M或室温下饱和溶液。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

本发明利用混合酶催化乳糖反应得到D-半乳糖和葡萄糖酸，并利用过量的离子交换树脂吸附去除葡萄糖酸可以得到较高含量的D-半乳糖溶液；树脂解吸后得到葡萄糖酸溶液；葡萄糖酸可方便地转化为葡萄糖酸盐溶液；本发明的催化方法将与D-半乳糖难以分离的D-葡萄糖转化为带负电荷易分离的葡萄糖酸，不需要复杂分离设备就能够生产出较高纯度的D-半乳糖和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐，产品价值高，生产成本低，易于实现工业化生产，具有巨大的应用价值。

附图说明

图1为本发明的酶催化方法的原理图，其中M为1价碱金属（也可以为高价金属）。

图2为不同硅胶活化方式对固定化酶酶活的影响。

图3为戊二醛浓度对固定化酶活力的影响。

图4为戊二醛交联时间对固定化酶活力的影响。

图5为pH值对酶固定化的影响。

图6为温度对酶固定化的影响。

图7为加酶量对酶固定化的影响。

图8为固定化酶与游离酶的最适pH 比较。

图9为固定化酶与游离酶的pH稳定性比较。

图10为固定化酶与游离酶最适温度比较。

图11为固定化酶与游离酶耐热性比较。

图12为固定化酶的重复利用稳定性。

图13为乳糖水解曲线。

图14为乳糖水解液的HPLC图。

具体实施方式

结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。

本发明利用β-半乳糖苷酶将乳糖转化为D-半乳糖和D-葡萄糖；然后，利用葡萄糖氧化酶将不易分离的D-葡萄糖转化为葡萄糖酸和过氧化氢；再利用过氧化氢酶把具有抑制作用的过氧化氢转化为水和氧气；葡萄糖酸还可以与碱反应生成葡萄糖酸盐（图1）。将D-葡萄糖转化为葡萄糖酸或葡萄糖酸盐不仅简化生产工艺、降低成本还增加了产品种类和产品价值。

本发明中的β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶均为市售产品。固定化酶为自制，步骤见下述实施例。固定化酶可以反复使用，节约了酶的成本；此外，固定化酶易于从转化液中分离出来、无需加热灭酶活步骤，既节能又避免加热造成糖液褐变。

实施例1、液体酶水解乳糖联产D-半乳糖和葡萄糖酸

（1）将结晶乳糖溶于纯净水，配制10%乳糖溶液；

（2）将步骤（1）所得乳糖溶液加入10%液体β-半乳糖苷酶、10%葡萄糖氧化酶和6%过氧化氢酶（相当于乳糖质量），在55℃，pH 5.0，100 rpm，催化反应5 h；

在该步骤中，可以将β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶三种酶同时加入进行反应，也可以先加入β-半乳糖苷酶进行乳糖水解反应2-8 h，再加入葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶进行葡萄糖氧化反应4-8 h，温度和搅拌条件维持不变；

（3）将步骤（2）所得反应液加热至100℃并维持20 min灭酶活；冷却至室温后10000rpm离心10 min，去除热变性酶蛋白，保留上清液；

（4）将步骤（3）所得离心上清液流经加载经过预处理的大孔苯乙烯系弱碱性阴离子交换树脂D309的树脂柱，吸附葡萄糖酸，得到含93%的D-半乳糖溶液；

（5）将步骤（4）离子交换树脂柱用0.5 M稀盐酸解吸得到葡萄糖酸溶液。

实施例 2、β-半乳糖苷酶固定化方法及优化

1、游离β-半乳糖苷酶的酶活测定方法

（1）称取0.1 g粉末状酶溶解到10 mL pH为5的缓冲液中；

（2）取1 mL酶液加入10 mL 10%的乳糖溶液（pH 5）中，震荡均匀，控制温度在50 ℃反应15 min后沸水浴20 min结束反应；冷却至室温后10000 rpm离心10 min，去除热变性酶蛋白，保留上清液；

（3）用HPLC测定反应后上清液中葡萄糖的含量。1个酶活单位（U）定义为每分钟水解乳糖生成1 μmol葡萄糖所需的酶量。测得初始β-半乳糖苷酶酶活为100 U/mL。

2、固定化β-半乳糖苷酶的酶活测定方法

（1）称取0.2 g的固定化β-半乳糖苷酶加入到10 mL 10%的乳糖溶液（pH 5）中；

（2）50 ℃反应15 min后过滤取出固定化酶，反应液沸水浴20 min，然后冷却至室温；

（3）用HPLC测定反应液葡萄糖的含量。1个酶活单位（U）定义为每分钟水解乳糖生成1 μmol葡萄糖所需的酶量。固定化酶的酶活回收率的计算方法为：

3、酶固定化载体硅胶活化方式的优化

将5 g硅胶用大量的去离子水充分洗干净后用下述四种活化方式进行活化比较：

①将硅胶加入到20 mL的浓盐酸中搅拌4 h后86 ℃回流2.5 h。

②将硅胶加入到25 mL的去离子水中67 ℃水浴搅拌2 h。

③将硅胶加入到25 mL的2%的NaOH溶液中40 ℃水浴搅拌1.5 h。

④将硅胶加入到25 mL的活化液（0.8 mol/L NaOH:二甲亚砜：环氧氯丙烷=7:10:8）中40 ℃，170 rpm的摇床上反应2.5 h。

将活化后的硅胶用大量的去离子水冲洗，直到冲洗液为中性为止。将活化后的硅胶加入到30 mL 17.5%的氨水中，将混合液放入30 ℃，160 rpm的摇床上反应过夜。反应结束后再用大量的去离子水冲洗硅胶直到冲洗液为中性为止。将制作好的硅胶晾干，放入冰箱备用。

称取0.1 g β-半乳糖苷酶粉，用缓冲液溶解。分别称取0.5 g上述4种不同方法活化的硅胶载体放入三角瓶中，先加入5 mL 2.0%的戊二醛溶液，在30 ℃ 160 rpm的摇床中反应2-3 h后用大量去离子水冲洗干净，再加入5 mL、pH 6的缓冲液以及5 mL pH 6的酶液，放入30 ℃ 160 rpm的摇床继续反应过夜，反应后的溶液静置分离得到硅胶，再用缓冲液将固定化后的硅胶冲洗干净，得到固定化酶。测定固定化酶的相对酶活，结果如图2，结果显示最佳活化方式为方法④。

（2）戊二醛浓度对β-半乳糖苷酶固定化的影响及优化

称取6份硅胶载体，每份0.2 g分别加入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的戊二醛5 mL放入30 ℃ 160 rpm的摇床中反应2-3 h，取出用大量去离子水冲洗干净后加入5 mLpH 6的缓冲液，再加入5 mL pH 6的酶液后放入30 ℃ 160 rpm的摇床继续反应过夜，反应后的溶液静置分离得到硅胶，再用缓冲液将固定化后的硅胶冲洗干净，得到固定化酶。测定固定化酶的酶活，确定戊二醛的最适浓度为2%（图3）。

（3）戊二醛交联时间对β-半乳糖苷酶固定化的影响及优化

称取6份硅胶载体，每份0.2 g分别加入确定浓度的戊二醛5 mL放入30 ℃ 160rpm的摇床，分别反应2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h后取出，用大量去离子水冲洗干净后加入5mL pH 6的缓冲液，再加入5 mL pH 6的酶液后放入30 ℃160 rpm的摇床继续反应过夜，反应后的溶液静置分离得到硅胶，再用缓冲液将固定化后的硅胶冲洗干净，得到固定化酶。测定固定化酶的酶活，确定戊二醛的最适交联时间为3 h（图4）。

（4）固定化pH对β-半乳糖苷酶固定化的影响及优化

称取6份硅胶载体，每份0.2 g分别加入确定浓度的戊二醛5 mL放入30 ℃ 160rpm的摇床反应一定时间后取出，用大量去离子水冲洗干净后加入5 mL pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的缓冲液，再加入5 mL 相应pH的酶液后放入30 ℃ 160 rpm的摇床继续反应过夜，反应后的溶液静置分离得到硅胶，再用缓冲液将固定化后的硅胶冲洗干净，得到固定化酶。测定固定化酶的酶活，确定固定化最适pH 6（图5）。

（5）固定化温度对β-半乳糖苷酶固定化的影响

称取6份硅胶载体，每份0.2 g分别加入确定浓度的戊二醛5 mL放入30 ℃160 rpm的摇床反应一定时间后取出，用大量去离子水冲洗干净后加入5 mL pH 6.0的缓冲液再加入5 mL 相应pH的酶液后分别放入20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃，160 rpm的摇床继续反应过夜，反应后的溶液静置分离得到硅胶，再用缓冲液将固定化后的硅胶冲洗干净，得到固定化酶。测定固定化酶的酶活，确定固定化最适温度为30℃（图6）。

（6）加酶量对β-半乳糖苷酶固定化的影响及优化

称取6份硅胶载体，每份1 g分别加入确定浓度的戊二醛5 mL放入30 ℃160 rpm的摇床分别反应固定时间后取出用大量去离子水冲洗干净，分别加入1 mL、3 mL、6 mL、9 mL、12 mL、15 mL固定 pH的酶液，再加入相应pH的缓冲液补足至15 mL，放入30 ℃ 160 rpm的摇床继续反应过夜，反应后的溶液静置分离得到硅胶，再用缓冲液将固定化后的硅胶冲洗干净，得到固定化酶。测定固定化酶的酶活，确定最适加酶量为10 mL（图7）。

实施例 3、β-半乳糖苷酶固定化酶与游离酶稳定性比较

1、固定化酶与游离酶的最适pH及pH稳定性

（1）分别取一定量的固定化酶和游离酶在其他条件都一定的条件下在不同pH（3、4、5、6、7、8）下按照测定固定化酶和游离酶酶活力。将各自的最大酶活设定为100%，得到不同pH下固定化酶和游离酶相对于最适pH的相对酶活力。结果显示固定化酶和游离酶最适pH4.5（图8）。

（2）分别取一定量的固定化酶和游离酶，室温下，将其放置在不同pH值的缓冲中30min。然后再在最适pH值下测量剩余酶活力。各自最大剩余酶活力设为100%，分别计算固定化酶和游离酶经不同pH条件下放置后相对剩余酶活力。结果如图9，pH值小于4时游离酶迅速失活，pH值在4-8之间时游离酶与固定化酶的稳定性都很好，但是固定化酶的酶活比游离酶高10%左右。酶固定化后耐酸和耐碱性都有所提高。

2、固定化酶与游离酶的最适温度及温度稳定性

（1）分别取一定量的固定化酶和游离酶在不同温度（0、20、40、50、55、60、80 ℃）下按照测定固定化酶和游离酶酶活力。将各自的最大酶活设为100%，分别计算不同温度下固定化酶和游离酶的相对酶活力。结果见图10，固定化酶与游离酶的最适温度均为55 ℃。

（2）分别取一定量的固定化酶和游离酶，将其放置在不同温度（0、20、40、60、70、80℃）的恒温水浴中维持20 min。然后在最适温度下各自测量它们的剩余酶活力。将各自最大剩余酶活设定为100%，分别计算不同温度放置后，固定化酶和游离酶相对剩余酶活力。结果显示固定化酶在温度高于40 ℃时稳定性高于游离酶（图11）。

实施例 4、固定化β-半乳糖苷酶重复利用稳定性

称取1 g的固定化酶加入到10%的乳糖溶液中反应3 h后将固定化酶与底物分离，用缓冲液冲洗三次，再次进行反应。分别测定每一次反应后的酶活，以反应前固定化酶酶活力为100%，计算各反应批次相对酶活力。结果显示固定化β-半乳糖苷酶重复利用10次后它的酶活仅略有下降（图12），可以多次使用，节约酶的成本。

实施例 5、固定化β-半乳糖苷酶水解乳糖

称取0.5 g硅胶加入到10 mL pH 5的10%的乳糖溶液中，放入55 ℃震荡水浴锅中反应，分别在反应15 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min时取样测定乳糖水解进程。

乳糖水解进程可以用酶电极分析仪测定反应过程中的葡萄糖含量并推算出乳糖消耗量，也可以用高效液相色谱仪（HPLC，示差折光检测器，固定相Carbomix Pb-NP column(10:8 %，7.8×300 mm，10 μm)，流动相为水，流速0.5 mL/min）来精确测定反应液中的各种糖含量。图13显示乳糖在150 min基本酶解完成，图14显示酶解产物为D-半乳糖和D-葡萄糖。

实施例6、共固定化葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶

（1）取适量的氨基树脂，加入100 mM的K

（2）步骤（1）所得活化氨基树脂置于缓冲液中，加入适量的戊二醛溶液，25 ℃，120rpm交联5 h，然后，用K

（3）将步骤（2）所得改性树脂用K

（4）将步骤（3）所得固定化酶经200 μm孔径滤器过滤，除去含混合酶液的缓冲液，然后用4℃ K

实施例 7、固定化酶催化乳糖联产D-半乳糖和葡萄糖酸钠

（1）将结晶乳糖溶于纯净水，配制10%乳糖溶液；

（2）将步骤（1）所得乳糖溶液加入20%（相当于乳糖质量）固定化β-半乳糖苷酶、共固定化葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，在55℃，100 rpm，催化反应5 h；

（3）将步骤（2）所得反应液8000 rpm，离心5 min除去固定化酶；

（4）将步骤（3）所得上清液流经加载了经过预处理的大孔苯乙烯系弱碱性阴离子交换树脂D309的树脂柱，吸附葡萄糖酸，得到含95%的D-半乳糖的透过液；

（5）将步骤（4）离子交换树脂柱用0.5 M稀盐酸解吸得到葡萄糖酸溶液；

（6）将步骤（5）得到的葡萄糖酸溶液中加入5 M NaOH溶液至pH中性，得到葡萄糖酸钠溶液。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。