公开/公告号CN114957491A
专利类型发明专利
公开/公告日2022-08-30
原文格式PDF
申请/专利权人 湖北工业大学;
申请/专利号CN202210748997.3
申请日2022-06-29
分类号C07K19/00(2006.01);C07K1/107(2006.01);A61K38/10(2006.01);A61K47/64(2017.01);A61P35/00(2006.01);
代理机构武汉智嘉联合知识产权代理事务所(普通合伙) 42231;
代理人姜婷
地址 430068 湖北省武汉市洪山区南李路28号
入库时间 2023-06-19 16:33:23
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2023-05-23
授权
发明专利权授予
2022-09-16
实质审查的生效 IPC(主分类):C07K19/00 专利申请号:2022107489973 申请日:20220629
实质审查的生效
技术领域
本发明属于药物技术领域,具体涉及一种靶向结合β-catenin蛋白的多肽和多肽衍生物,以及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
Wnt信号通路广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中,是一类在物种进化过程中高度保守的信号通路。Wnt信号在动物胚胎的早期发育、器官形成、组织再生和其它生理过程中,具有至关重要的作用。如果这条信号通路中的关键蛋白发生突变或者异常表达,导致信号异常活化,就可能诱导癌症的发生。
Wnt信号通路包括经典的Wnt信号通路与非经典的Wnt信号通路,在经典通路即Wnt-β-catenin信号通路中,Wnt因子通过激活细胞膜上的Frizzle/LRP5/6协同受体后抑制细胞内游离β-catenin蛋白的磷酸化和降解,细胞质中的β-catenin蛋白水平升高后将发生β-catenin蛋白的核移位,导致细胞核中β-catenin蛋白升高,胞核中β-catenin蛋白能够联合Pygo2、Bcl-9以及FoxM1蛋白共同与TCF/LEF-1转录因子家族形成复合体并激活Wnt信号通路下游靶基因的转录激活。因此,针对该信号通路设计特异性的蛋白药物,尤其是多肽药物来治疗肿瘤具有重要的价值和应用前景。
越来越多的研究表明,序列相似性为83的家族成员A基因(family with sequencesimilarity 83member A,FAM83A)与肿瘤的侵袭和转移相关,且FAM83A在肺癌、乳腺癌和胰腺癌中异常高表达,该基因的上调与肿瘤的形成、预后等指标具有密切的相关性。但FAM83A在癌症中的临床意义,以及在癌症中的作用机制仍不清楚。
发明内容
针对现有技术中的问题,本发明发现FAM83A蛋白能够与β-catenin蛋白发生直接的相互作用进而促进细胞内Wnt信号通路的异常激活,故基于FAM83A蛋白结构设计了能够阻断细胞内FAM83A与β-catenin相互作用的多肽,且实验结果表明该多肽分子对胰腺癌细胞的生长具有显著的抑制效果。
本发明的技术方案具体如下:
本发明首先提供了一种靶向FAM83A蛋白与β-catenin蛋白相互作用区域的多肽或多肽衍生物,其中,多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,多肽衍生物为上述多肽与细胞穿模肽连接形成的嵌合肽。
进一步地,在上述技术方案中,细胞穿模肽连接于所述多肽的N端;更进一步地,所述细胞穿模肽的序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地,在上述技术方案中,多肽或多肽衍生物的N端为乙酰化修饰且C端为酰胺化修饰。
本发明还提供了一种抗肿瘤的药物组合物,其活性成分含有氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的多肽或该多肽衍生物。
进一步地,在上述技术方案中,药物组合物还包括药物载体。
本发明进一步提供了上述多肽,或多肽衍生物,或抗肿瘤的药物组合物在制备抗肿瘤的药物中的应用。
进一步地,在上述技术方案中,肿瘤为胰腺癌。
进一步地,在上述技术方案中,对个体进行有效量的所述药物的给药。更进一步地,给药的方式为注射给药。
本发明的有益效果为:基于FAM83A蛋白与β-catenin蛋白的直接结合现象,本发明提供的多肽和多肽衍生物能够有效阻断FAM83A蛋白与β-catenin蛋白的连接,达到抑制Wnt通路活性的效果,试验结果也显示,本发明的多肽能够抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭等能力,从而能够很好的发挥抗肿瘤功能。
附图说明
图1为实施例1中FAM83A蛋白与β-catenin蛋白的western blotting检测结果图;
图2为实施例1中FAM83A蛋白的二级结构图;
图3为不同浓度的FaP3与β-catenin蛋白的表面等离子共振检测结果图;
图4为多肽FaP3与β-catenin蛋白的相互所用模式示意图;
图5为短肽CP-FaP3抑制胰腺癌细胞增殖的检测结果图;
图6为短肽CP-FaP3抑制胰腺癌细胞侵袭和迁移能力的检测结果图;
图7为短肽CP-FaP3抑制小鼠体内胰腺癌肿瘤体积的检测结果图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明,下面结合具体实施例进一步阐明本发明的内容。应当理解的是,此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明,并不用于限制本发明。
下述实施例中,若无特殊说明,均为常规方法;所述试剂和材料,若无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例1
本发明将FAM83A蛋白与β-catenin蛋白分别与His标签和GST标签融合,体外诱导后纯化得到His-FAM83A和GST-β-catenin蛋白,将两种蛋白孵育,并进行洗脱,将洗脱液进行western blotting实验进行检测。
结果如图1所示:GST-β-catenin能够下拉His-FAM83A,表明β-catenin和FAM83A具有直接的结合。
基于此,进一步对FAM83A蛋白结构(pdb:4urj)进行分析,进而选择稳定性比较好的四段α螺旋结构的肽段为基础设计多肽序列(FaP1、FaP2、FaP3、FaP4,具体见图2),其中FaP3的氨基酸序列为GVKLFQEMCDKVQ(SEQ ID NO:1),FaP4的氨基酸序列为QAVELFDEEFRHLYAS(SEQ ID NO:4)。
采用表面等离子共振(SPR)对上述四个多肽序列做进一步的筛选,具体为:先将体外诱导的GST-β-catenin键合在生物传感器表面,再将分别含有商业合成的上述多肽片段(FaP1、FaP2、FaP3、FaP4)的溶液注入并流经生物传感器表面;生物分子间的结合引起生物传感器表面质量的增加,导致折射指数按同样的比例增强,生物分子间反应的变化即被观察到,这种反应用反应单位(RU)来衡量:1RU=1pg蛋白/mm2=1×10
在本实验里,多肽片段在被注入的过程中,由对流和扩散流经与β-catenin相互作用表面而与靶分子形成复合物,导致反应增强;而当多肽被注入完毕后,多肽与β-catenin复合物解离,导致反应减弱;通过结合式相互作用模型拟合这种反应曲线即可反应出两者之间的相互作用。
筛选结果显示FaP3与GST-β-catenin具有较好的相互作用,其表面等离子共振结果如图3所示:随着多肽FaP3浓度的提高,其与GST-β-catenin蛋白的相互作用变强。
进一步采用online的小分子对接软件,对短肽FaP3与β-catenin的530-666区间蛋白结构进行对接的预测结果,显示短肽FaP3结合在β-catenin蛋白二级结构形成的小沟上(图4)。
综上,多肽FaP3可以靶向结合β-catenin蛋白且作用力强。
实施例2
在实施例1获得的多肽FaP3的基础上,在其N端连接上细胞穿膜肽TAT,且穿模肽的序列为YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:2),并对多肽N端进行乙酰化修饰,C端进行酰胺化修饰。将所得带有细胞穿膜肽的短肽命名为CP-FaP3。
以对照肽FaPC为参照物,其氨基酸序列为YIQAQAREPPCPPD(SEQ ID NO:3),进一步在对照肽上连接同样的细胞穿肽膜并进行相同的修饰,所得短肽记为CP-FaPC。
对CP-FaP3的抗肿瘤功能进行以下验证:
(1)CP-FaP3对胰腺癌细胞增殖的影响
采用Edu(5-乙炔基-2’-脱氧尿苷,5-Ethynyl-2′-deoxyuridine)细胞增殖实验进行检测(本实施例按照碧云天BeyoClick
结果如图5所示:CP-FaP3确实能够抑制胰腺癌AsPC-1细胞的增殖。
(2)CP-FaP3对胰腺癌细胞迁移和侵袭的影响。
将trans-well小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上室内盛装上层培养液(2%血清浓度),下室内盛装下层培养液(20%血清浓度),上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。当将细胞铺到trans-well上室中后,由于血清浓度的匮乏,细胞会趋于穿过聚碳脂膜进而进入下室高血清的培养基中,迁移过去的细胞用结晶紫进行染色,便于统计。该方法用于检测细胞的迁移性。如果在上室铺一层人工基底膜,则可以模拟细胞穿过人工基底膜进而到下室的过程,该方法用于检测细胞的侵袭性。
基于上述原理,在上室铺好胰腺癌PANC-1细胞后,利用短肽CP-FaP3处理细胞24h后,发现迁移或者侵袭到下室的细胞数量明显减少,具体如图6所示,表明CP-FaP3具有抑制胰腺癌细胞侵袭和迁移的能力。
实施例3
本实施例直接在在动物体内研究短肽CP-FaP3对胰腺癌生长的影响,具体过程为:
首先分别在4周大小的雌性裸鼠尾部皮下和尾静脉注射3×10
结果如图7所示:注射有CP-FaP3的裸鼠体内的肿瘤体积明显小于对照肽处理的,说明CP-FaP3能够显著抑制胰腺癌细胞在裸鼠体内的生长。
综上所述,本发明提供的多肽FaP3及其衍生物CP-FaP3能够结合在β-catenin蛋白上,阻断了FAM83A蛋白与β-catenin蛋白的连接,进而调控到了Wnt通路的活性。而且试验证明上述多肽及其衍生物能够抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭等能力,且动物体内试验表明能够抑制胰腺癌肿瘤的体积增长,故本发明提供的多肽FaP3及其衍生物CP-FaP3在抗肿瘤药物的制备中有巨大的应用潜力。
以上所述是本发明的优选实施方式,不能以此来限定本发明之权利范围,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北工业大学
<120> 一种靶向结合β-catenin蛋白的多肽、多肽衍生物及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Val Lys Leu Phe Gln Glu Met Cys Asp Lys Val Gln
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Tyr Ile Gln Ala Gln Ala Arg Glu Pro Pro Cys Pro Pro Asp
1 5 10
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Ala Val Glu Leu Phe Asp Glu Glu Phe Arg His Leu Tyr Ala Ser
1 5 10 15
机译: 包含由丙型肝炎病毒基因组编码的氨基酸序列的多肽,一种包含有用多肽的组合物,使用常用多肽进行免疫测定,针对所述多肽的抗体,其中一种多肽与核苷酸结合在一起,形成一种多肽,由蛋白质和蛋白质组成,所述多肽包括蛋白质和蛋白质。使用所说的多核苷酸进行反应
机译: 分离的多肽,融合蛋白,核酸序列,表达载体或病毒,重组细胞,产生可溶性胞外域多肽或融合蛋白或其片段的方法,药物组合物,单克隆抗体或其多克隆或抗原结合片段的用途,使用抗体或抗原结合片段,使用任何分离的多肽,调节细胞因子的方法,诱导t细胞扩增,促进细胞免疫抗原特异性t并促进cd4 +和/或cd8 + t细胞活化受试者,在患者中增强继发于抗原的免疫应答的方法,使用以下至少一种的方法:分离的多肽,用于治疗或预防与免疫系统有关的病症的方法,用于治疗或预防传染病的方法,用于诊断受试者疾病的方法,产生可溶性胞外域多肽tmem25,vsig10,ly6g6f或其融合蛋白或片段的方法
机译: cpn10分离的多肽,分离的核酸,表达构建体,宿主细胞,抗体,药物组合物,治疗或预防疾病的方法,调节prr信号传导的方法,调节一种或多种免疫调节剂产生和/或分泌的方法,抑制一种或多种免疫调节剂的产生和/或分泌,鉴定与多肽结合的化合物的方法,筛选共蛋白和prr配体及功能性变体,衍生物,同源物,类似物或多肽片段的方法