一种抑制脂肪间充质干细胞生成脂肪细胞的生物制剂

摘要

本发明提供了一种抑制脂肪间充质干细胞生成脂肪细胞的生物制剂，属于细胞生物学技术领域。本发明所提供的生物制剂包括抑制LINC02516基因表达的基因抑制剂，还包括药学上可接受的载体。使用本发明所提供的生物制剂可以有效的抑制脂肪间充质干细胞向脂肪细胞分化。

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，尤其涉及一种抑制脂肪间充质干细胞生成脂肪细胞的生物制剂。

背景技术

随着人民生活水平的提高，我国居民的超重和肥胖呈现出快速的上升趋势，并且已经给国家和社会产生了沉重的疾病负担和经济负担。研究显示，超重和肥胖的人群是高血压、冠心病、血脂异常、胰岛素功能异常、2型糖尿病和脂肪肝的高危人群。

肥胖是由于脂肪细胞生成和变大，脂肪细胞生成主要取决于脂肪干细胞的增殖和分化。因此，如果有效的抑制脂肪间充质干细胞的成脂分化就可以有效的减少脂肪细胞的生成。目前，关于抑制脂肪干细胞成脂分化的生物制剂较少，因此，发明一种新的抑制脂肪干细胞生成脂肪细胞的生物制剂对于有效的减少脂肪细胞生成具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以有效抑制脂肪间充质干细胞生成脂肪细胞的生物制剂。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种抑制脂肪间充质干细胞生成脂肪细胞的生物制剂，所述生物制剂中包括抑制LINC02516基因表达的基因抑制剂，所述LINC02516基因的转录本序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述基因抑制剂为LINC02516基因的siRNA，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.4所示，所示siRNA的反义链序列如SEQ ID NO.5所示。

优选地，所述生物制剂还包括药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体为脂质体。

其次，本发明提供了抑制LINC02516基因表达的基因抑制剂在制备抑制脂肪间充质干细胞生成脂肪细胞的生物制剂中的应用，其特征在于，所述LINC02516基因的转录本序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述基因抑制剂为LINC02516基因的siRNA，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.4所示，所述siRNA的反义链序列如SEQ ID NO.5所示。

优选地，所述应用包括抑制脂肪间充质干细胞成脂分化基因PPARγ和aP2的蛋白表达。

最后，本发明提供了抑制LINC02516基因表达的基因抑制剂在制备脂肪间充质干细胞成脂分化基因PPARγ和aP2的蛋白表达抑制剂中的应用。

优选地，所述LINC02516基因的转录本序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述基因抑制剂为LINC02516基因的siRNA，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.4所示，所述siRNA的反义链序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种LINC02516基因的siRNA，使用该siRNA转染脂肪间充质干细胞后，能够有效的抑制脂肪间充质干细胞的成脂分化，并且可以有效的抑制成脂基因PPARγ和aP2的蛋白表达。

附图说明

图1 脂肪间充质干细胞成脂转化过程中LINC02516的表达水平变化；

图2 本发明所提供的siRNA的抑制效果；

图3 油红O染色的检测结果；

图4 转染siRNA后，成脂基因PPARγ和aP2的蛋白表达情况；

图5 转染siRNA后，细胞周期基因Cyclin-D1和CDK1的蛋白表达情况。

具体实施方式

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。

实施例1

检测在脂肪间充质干细胞成脂分化过程中LINC02516的表达量差异

（1）将脂肪间充质干细胞接种于6孔细胞培养板中，加入完全培养基进行培养；

（2）当脂肪间充质干细胞的细胞密度达到90%左右的时候，去除完全培养基，添加成脂诱导培养基，进行成脂诱导，分别在第0天，第3天，第7天，第10天和第14天的时候提取RNA；

（3）提取RNA后，使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA；

（4）根据LINC02516的转录本序列（SEQ ID NO.1）设计基因LINC02516的引物，引物序列如下：

上游引物：GTGTACTCCTGGGAGCTCCT（SEQ ID NO.2）；

下游引物：GGCAGGAAAGGACATTCTCCA（SEQ ID NO.3）；

（5）使用荧光定量PCR试剂盒检测LINC02516的相对表达量，内参使用GAPDH，结果使用2

其中，培养3天时，LINC02516的相对表达量为2.02±0.18，P小于0.05，差异具有统计学意义；

培养7天时，LINC02516的相对表达量为3.26±0.14，P小于0.05，差异具有统计学意义；

培养10天时，LINC02516的相对表达量为4.14±0.10，P小于0.05，差异具有统计学意义；

培养14天时，LINC02516的相对表达量为4.62±0.21，P小于0.05，差异具有统计学意义；

从上述的结果中，可以看出，在成脂分化的过程中LINC02516的表达量升高，说明LINC02516的表达量升高可能与促进脂肪间充质干细胞的成脂分化有关，因此，我们认为可以通过抑制成脂分化过程中LINC02516的表达量来抑制脂肪间充质干细胞的成脂分化。

实施例2

抑制LINC02516的表达量，检测脂肪间充质干细胞成脂分化的变化情况

1.检测LINC02516的siRNA的抑制效果

（1） 根据基因LINC02516的转录本序列设计siRNA，该siRNA的序列如下所示：

siRNA正义链：GAGAGAGAGUGCAAAGCAA（SEQ ID NO.4）；

siRNA反义链：UUGCUUUGCACUCUCUCUC（SEQ ID NO.5）；

siNC由siRNA合成公司提供；

（2）将脂肪间充质干细胞接种于6孔细胞培养板中，将siNC和siRNA分别转染至脂肪间充质干细胞中；

（3）转染48h后，提取RNA，进行逆转录和荧光定量PCR反应，检测LINC02516的相对表达量，得到的结果如图2所示；

其中，转染siRNA后，细胞的相对表达量为0.16±0.06，抑制率约为84%，说明本发明所设计的siRNA能够有效的抑制LINC02516的表达。

2.油红O实验检测转染siRNA后，脂肪间充质干细胞成脂分化的变化

（1）将脂肪间充质干细胞接种于6孔细胞培养板中，分别转染siNC和siRNA；

（2）转染48h后，更改为成脂诱导培养基进行培养；

（3）培养7天后，去除培养基，使用PBS清洗培养孔，清洗3次后，去除PBS，加入10%的多聚甲醛固定细胞30min；

（4）固定结束之后，将多聚甲醛去除，加入配置好的油红O染色液，覆盖住细胞，常温下对细胞进行染色；

（5）染色30min，吸取染色液，使用PBS轻轻的冲洗细胞2-3次，置于倒置显微镜下观察和拍照，得到的结果如图3所示。

从中可以看出，转染LINC02516 siRNA的细胞油红O染色的细胞明显较少，说明抑制LINC02516的表达后，能够有效的抑制脂肪间充质干细胞的成脂分化。

实施例3

抑制LINC02516后，脂肪间充质干细胞成脂基因PPARγ和aP2的蛋白表达情况

（1）将脂肪间充质干细胞接种于6孔细胞培养板中，分别转染siNC和siRNA；

（2）转染48h后，更改为成脂诱导培养基进行培养；

（3）培养7天后，去除培养基，加入蛋白裂解液，充分裂解后，将细胞刮下，转移至1.5ml离心管中；

（4）冰上裂解30min后，将离心管放入离心机中，离心15min，将得到的上清液转移到新的1.5ml离心管中，并测量蛋白样品的浓度，

（5）添加上样缓冲液调整蛋白样品为统一的蛋白浓度，将离心管置于沸水中加热5min；

（6）配置蛋白电泳胶，上样后进行电泳，初始条件为恒压90v，待溴酚蓝到达分离胶时调整为恒压120V，直至溴酚蓝跑出电泳胶底部；

（7）电泳结束后，安装电转夹，设置电转条件，进行电转；

（8）电转结束后，将膜取出，置于封闭液中进行封闭，封闭1h后，进行PPARγ，aP2和GAPDH一抗孵育；

（9）孵育结束后，进行洗膜，洗膜后进行二抗的孵育；

（10）二抗孵育结束后，进行显影曝光，得到的实验结果如图4所示。

从图中可以看出，抑制LINC02516的表达后，可以有效的抑制脂肪间充质干细胞成脂基因PPARγ和aP2的蛋白表达。

实施例4

抑制LINC02516后，脂肪间充质干细胞的增殖情况

（1）将转染了siNC和siRNA的脂肪间充质干细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔添加100ul，每100ul含有细胞2000个；

（2）将96孔板置于细胞培养箱中培养72h后，参照cck-8的说明书对细胞检测检测。

检测结果发现，转染siNC的细胞的OD值为0.59±0.04，转染siRNA的细胞的OD值为0.48±0.05，P值小于0.05，差异具有统计学意义。上述结果说明，抑制脂肪间充质干细胞中LINC02516的表达可以有效的抑制脂肪间充质干细胞的增殖。

实施例5

抑制LINC02516后，脂肪间充质干细胞细胞周期基因Cyclin-D1和CDK1的蛋白表达情况

（1）将脂肪间充质干细胞接种于6孔细胞培养板中，分别转染siNC和siRNA；

（2）转染48h后，更改为成脂诱导培养基进行培养；

（3）培养7天后，去除培养基，加入蛋白裂解液，充分裂解后，将细胞刮下，转移至1.5ml离心管中；

（4）冰上裂解30min后，将离心管放入离心机中，离心15min，将得到的上清液转移到新的1.5ml离心管中，并测量蛋白样品的浓度，

（5）添加上样缓冲液调整蛋白样品为统一的蛋白浓度，将离心管置于沸水中加热5min；

（6）配置蛋白电泳胶，上样后进行电泳，初始条件为恒压90v，待溴酚蓝到达分离胶时调整为恒压120V，直至溴酚蓝跑出电泳胶底部；

（7）电泳结束后，安装电转夹，设置电转条件，进行电转；

（8）电转结束后，将膜取出，置于封闭液中进行封闭，封闭1h后，进行Cyclin-D1，CDK1和GAPDH一抗孵育；

（9）孵育结束后，进行洗膜，洗膜后进行二抗的孵育；

（10）二抗孵育结束后，进行显影曝光，得到的实验结果如图4所示。

本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述，当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。