一种抗真菌药物作用靶点的体外制备、活性检测及其应用

摘要

本发明涉及一种抗真菌药物作用靶点的体外制备、活性检测及其应用，属于药物靶点材料及其制备和应用领域。本发明中的药物靶点为抑制真菌细胞壁合成的关键酶FKS(β‑1,3‑葡聚糖合成酶)。通过真核生物表达系统体外制备了具有活性的药物作用靶点蛋白，利用其能够将底物转变成UDP(尿苷二磷酸)的特点建立了有效的酶活分析体系，可以应用于检测具有抑制酶活的药物或化合物，该体系具有进行药物筛选的可行性；另外还开展了FKS酶活检测方法在鉴定真菌耐药突变株方面的应用。

说明书

技术领域

本发明属于药物靶点材料及其制备和应用领域，更具体地，涉及一种抗真菌药物作用靶点的体外制备、活性检测及其应用。

背景技术

广谱抗生素、免疫抑制剂、类固醇等药物的广泛使用，使真菌感染呈上升趋势。侵袭性真菌感染每年造成150多万人死亡，而这种感染对于免疫受损人群以及新冠(COVID-19)患者危害更大。而耐药性真菌菌株的出现，给治疗感染患者带来了更为严峻的挑战。因此，我们迫切需要开发多种新型抗真菌药物以应对当前需求。

真菌细胞壁是真菌细胞的重要组成结构，由β-1,3-葡聚糖等真菌特有的必需成分组成，因此催化β-1,3-葡聚糖合成的葡聚糖合成酶FKS是抗真菌药物开发的理想靶标。FKS为含有17个跨膜螺旋的膜结合型β-1,3-葡聚糖合成酶，它催化的生化反应是：将葡萄糖从供体UDP-葡萄糖上以β-1,3-糖苷键转移到生长中的葡聚糖链上，使葡聚糖链得以延长。真菌FKS发挥催化功能受到辅助因子GTP-γ-S和Rho1调节。

FKS及其同源物在多种真菌病原体生存过程中发挥重要作用。例如在光滑梭菌和酿酒酵母中，FKS1和FKS2的同时缺失导致菌体死亡；白色念珠菌和新生隐球菌中的FKS1对菌体的生存能力至关重要；FKS1缺失的烟曲霉则具有严重的生长缺陷和细胞溶解现象。而真菌中的FKS高度保守，这种结构的保守性使得针对该靶点开发的药物具有广谱抗真菌的效果。目前，市场上已有两种类型的针对FKS的抗真菌药物，即临床实践中广泛使用的一线抗真菌药物棘白菌素类(包括卡泊芬净和米卡芬净等)，及新批准的口服杀真菌药物Ibrexafungerp(2021年美国FDA批准)。

针对上述靶点继续开发抑制真菌细胞壁合成的新型抗真菌药物将是药物基础研究、临床应用研究领域的长期的研究热点。

发明内容

本发明涉及一种抗真菌药物作用靶点的体外制备、活性检测及其应用，所针对的药物作用靶点为提纯的真菌FKS1蛋白。

利用提纯的真菌FKS1蛋白在辅助因子GTP-γ-S和Rho1作用下具备体外催化底物UDP-葡萄糖转变为产物UDP的活性，建立针对FKS1蛋白的体外活性检测体系。

本发明的目的还在于利用体外建立的FKS1蛋白酶活检测方法进行抗真菌药物的筛选。

本发明的目的还在于将体外建立的FKS1蛋白酶活检测方法应用于对真菌耐药突变株的鉴定。

根据本发明第一方面，提供了一种抗真菌药物靶点FKS1的体外制备方法，首先利用真菌细胞表达系统在基因组水平表达含重组标签的FKS1蛋白，然后以溶膜缓冲液溶解真菌细胞膜，最后以亲和层析法纯化FKS1蛋白；具体包括以下步骤：

(1)使用基于PCR的基因重组方法，将FLAG标签连接到酿酒酵母菌株染色体FKS1序列的C末端；

(2)将步骤(1)得到的菌株培养后，通过离心收集细胞，加入裂解缓冲液，随后用高压破碎法进行裂解；

(3)离心去除细胞碎片，将上清液离心以收集细胞膜；

(4)将步骤(3)收集的膜溶解在溶膜缓冲液中；使用抗FLAG M2亲和凝胶纯化FKS1及其突变体蛋白，并以含FLAG肽的洗脱缓冲液进行洗脱，即得到抗真菌药物靶点FKS1。

根据本发明另一方面，提供了一种抗真菌药物靶点FKS1的体外酶活测定方法，以纯化的FKS1蛋白为抗真菌药物检测靶点，以FKS1催化反应的产物尿苷二磷酸的产量为检测指标；具体包括以下步骤：

(1)将FKS1蛋白添加到反应体系中，所述反应体系含有辅助因子GTP-γ-S和Rho1；随后添加尿苷二磷酸-葡萄糖底物，进行酶活反应；

(2)加入荧光显色试剂，使用酶标仪读取荧光值，根据荧光显色水平再计算得到反应产生的尿苷二磷酸水平，换算得到抗真菌药物靶点FKS1的体外酶活。

优选地，步骤(2)具体为：加入糖基转移酶检测试剂盒荧光显色试剂，使用Pherastar FS酶标仪系统读取荧光值，再计算得到反应产生的尿苷二磷酸水平，换算得到抗真菌药物靶点FKS1的体外酶活。

根据本发明另一方面，提供了体外建立的FKS1蛋白酶活检测方法用于测试药物和/或化合物对靶点FKS1抑制作用的应用，抗真菌药物与FKS1孵育后，检测加药后FKS1的体外酶活相对加药前FKS1的体外酶活水平；具体包括以下步骤：

(1)首先将药物与FKS1孵育，然后再添加Rho1、GTP-γ-S、氟化钾和尿苷二磷酸-葡萄糖，进行酶活反应；使用酶标仪读取荧光值；

(2)以抗真菌药物靶点FKS1的体外酶活测得的荧光值为标准值100，将加药后FKS1蛋白测得的荧光值与加药前FKS1测得的荧光值的比值定义为药物抑制后FKS1的相对活性，抑制后FKS1的相对活性值低于50被认为相应药物对FKS1活性有显著抑制，以此确定所述药物对FKS1的抑制效果。

根据本发明另一方面，提供了体外建立的FKS1蛋白酶活检测方法用于真菌耐药突变株鉴定的应用，包括以下步骤：

(1)通过基因重组表达和亲和层析的方法，表达纯化野生型真菌FKS1蛋白和突变型真菌FKS1对应的蛋白，分别添加到反应体系中，所述反应体系含有辅助因子GTP-γ-S和Rho1；随后添加尿苷二磷酸-葡萄糖底物，进行酶活反应；加入荧光显色试剂，使用酶标仪读取荧光值；

(2)使用梯度稀释的抗真菌药物分别与野生型真菌和突变型真菌孵育，然后再添加Rho1、GTP-γ-S、氟化钾和尿苷二磷酸-葡萄糖，进行酶活反应，使用酶标仪读取荧光值；

(3)以加药前酶活体系测得的荧光值为标准值100，将加药后蛋白测得的荧光值与加药前蛋白测得的荧光值的比值定义为FKS1或突变体加药后的相对活性；根据50％酶活对应的抗真菌药物浓度确定药物的半数抑菌浓度IC

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：

(1)现有的检测β-1,3-葡聚糖合成酶FKS活性的方法为1)提取真菌细胞膜以同位素标记法检测带有[

(2)本检测方法基于提纯的FKS1蛋白展开活性检测，检测过程不受真菌细胞膜中其他蛋白干扰，特异性强。

(3)本检测方法可通过纯化突变体蛋白建立耐药突变体库，基于该库可建立高通量检测方法，结合临床患者体内菌株PCR结果即可快速确定相应敏感药物，具有潜在的广泛应用于临床的价值。

附图说明

图1：体外纯化的FKS1野生型及突变体的相对酶活。

图2：应用FKS1的体外酶活测定方法测试药物/化合物对靶点FKS1的抑制作用，说明该方法可有效用于筛选靶向FKS1的抗真菌化合物。

图3：应用FKS1体外酶活测定方法测试真菌药物卡泊芬净对FKS1突变体酶活的影响。

图4：带有FKS1突变(与图3中对应)的真菌菌株对卡泊芬净的耐受分析。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明涉及一种抗真菌药物作用靶点的体外制备、活性检测及其应用，所述药物靶点为抑制真菌细胞壁合成的关键酶FKS(β-1,3-葡聚糖合成酶)。通过真核生物表达系统体外制备了具有活性的药物作用靶点蛋白，利用其能够将底物转变成尿苷二磷酸的特点建立了有效的酶活分析体系，可以应用于检测具有抑制酶活的药物或化合物，利用该体系具有进行药物筛选的可行性。

实施例1：抗真菌药物靶点FKS1的体外制备

1)使用基于PCR的基因重组方法，将3×FLAG tag连接到酿酒酵母菌株染色体FKS1(ScFKS1)序列的C末端。

2)该菌株在30℃的YPD培养基中培养20小时。之后通过离心收集细胞，并以裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、2mM MgCl

3)以15000×g离心半小时去除细胞碎片。再将上清液以100000×g超速离心1小时以收集细胞膜。

4)将收集的膜溶解在溶膜缓冲液中(50mM Tris-HCl pH 7.4、1mM EDTA和33％(v/v)甘油、去垢剂、4uM GTP-γ-S、蛋白酶抑制剂混合物)。

5)使用抗FLAG M2亲和凝胶(Sigma)纯化FKS1及其突变体蛋白，并以含150μg/ml 3×FLAG肽的洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.4、1mM EDTA、33％(v/v)甘油、去垢剂)进行洗脱。

6)FKS1浓缩至0.1mg/ml冻存于液氮中。

7)FKS1相应突变体蛋白表达纯化方法参考本法实施例1 1)-6)。

实施例2：抗真菌药物靶点FKS1的体外酶活测定体系的建立

1)将2.5μL FKS1或其突变体添加到反应体系中(30μL洗脱缓冲液添加Rho1、4μMGTP-γ-S、20mM KF)。随后添加UDP-葡萄糖底物至最终浓度2.5mM，37℃开始反应。

2)反应60min后，加入30μL的糖基转移酶检测试剂盒(Promega)荧光显色试剂，室温反应30min。

3)使用Pherastar FS酶标仪系统(BMG Labtech)读取荧光值，检测反应产生的UDP水平。

4)以野生型FKS1测得的荧光值为标准值100，FKS1的突变体蛋白测得的荧光值：野生型FKS1测得的荧光值所得比值定义为突变体FKS1的相对活性，不同的突变体显示出不同的活性。(图1)

实施例3：利用体外建立的FKS1酶活检测方法测试药物/化合物对靶点FKS1的抑制作用

1)棘白菌素类抗真菌药物卡泊芬净(caspofungin)或米卡芬净(micafungin)为临床抗真菌药物，利用该两种药物确定本方法应用于抗真菌药物筛选的有效性。首先将药物(浓度100μM)与FKS1在室温下孵育10分钟，然后再添加Rho1、4μM GTP-γ-S、20mM KF、2.5mMUDP-葡萄糖，37℃开始酶活反应。

2)使用Pherastar FS酶标仪系统(BMG Labtech)读取荧光值，确定添加抗真菌药物后FKS1活性降低水平。以未添加任何抗菌药物的FKS1酶活体系测得的荧光值为标准值100，加药后FKS1蛋白测得的荧光值：加药前FKS1测得的荧光值所得比值定义为药物抑制后FKS1的相对活性，抑制后FKS1的相对活性值低于50被认为FKS1活性受到显著抑制，以此确定药物对FKS1的抑制效果。(图2)

实施例4：将体外建立的FKS蛋白酶活检测方法应用于真菌耐药突变株的鉴定

1)白色念珠菌FKS1突变(CaFKS1)F641S和S645P为已报道的对卡泊芬净药物效果不敏感的突变菌株，这两个突变位点对应于酿酒酵母的FKS1蛋白分别为ScFKS1 F639S和S643P。通过基因重组表达的方法表达纯化ScFKS1 F639S和S643P。参考实施例1的步骤1)-步骤6)。

2)使用梯度稀释的卡泊芬净(0.001-100μM)与酿酒酵母ScFKS1、ScFKS1 F639S、ScFKS1 S643P分别在室温下孵育10分钟，然后再添加Rho1、4μM GTP-γ-S、20mM KF、2.5mMUDP-葡萄糖，37℃开始酶活反应。

3)使用Pherastar FS酶标仪系统(BMG Labtech)读取荧光值，以加药前野生型FKS1酶活体系测得的荧光值为标准值100，加药后FKS1或突变体蛋白测得的荧光值：加药前FKS1或突变体蛋白测得的荧光值所得比值为FKS1或突变体加药后的相对活性。根据50％酶活对应的卡泊芬净浓度确定药物的半数抑菌浓度IC

4)以突变菌株的存活率水平确定本法检测结果的一致性和有效性。将ScFKS1F639S和ScFKS1 S643P突变体基因序列通过同源重组方法引入酿酒酵母相应位点建立FKS1的染色体突变，并通过测序验证。在酵母培养基中加入梯度稀释的卡泊芬净(0-16μM)，30℃培养48小时后，观察酿酒酵母的存活情况，以确定本法用于鉴定真菌耐药突变的有效性(图4)。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。