一种MT1-MMP可激活的前药型天花粉蛋白药物递送系统及应用

摘要

本发明属于药物领域，涉及一种MT1‑MMP可激活的前药型天花粉蛋白药物递送系统及应用。该药物递送系统包括由N端至C端的：天花粉蛋白TCS、细胞穿膜肽CPP、MT1‑MMP特异性酶切位点、氨基酸连接体、MT1‑MMP特异性结合肽。本发明构建的MT1‑MMP可激活的前药型天花粉蛋白药物递送系统能够借助CPP和靶向肽，增强CPP对肿瘤细胞的选择性胞内递送效率，提高天花粉蛋白的跨膜效率，增强其抗肿瘤活性。

说明书

技术领域

本发明属于药物领域，具体地，涉及一种MT1-MMP可激活的前药型天花粉蛋白药物递送系统及应用。

背景技术

卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤，其中上皮性卵巢癌是最常见的类型。卵巢癌的发病率低于宫颈癌和子宫体癌，但其死亡率位于妇科肿瘤疾病之首。据报道，2020年全球有313959名女性患病，207252名患者因此死亡。卵巢癌患者在五年内的总生存率低于50％，如此高的死亡率主要归因于卵巢癌患者发病早期无明显症状，缺乏早期诊断手段，超过70％的卵巢癌患者确诊时已处于卵巢癌晚期。目前，卵巢癌的临床治疗方案一般采用手术切除肿瘤组织并辅以铂药/紫杉醇为后续治疗药物。尽管随着治疗水平的提高，卵巢癌患者生存率有所提升，但提升幅度远低于其他癌种。大多数患者经过初期治疗后会再次复发，并产生耐药性，治疗难度大。因此，对于卵巢癌的高复发、难治疗、预后性差的治疗现状，寻求新型药物改善卵巢癌患者生存水平至关重要。

天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是一种Ⅰ型核糖体失活蛋白，TCS可通过裂解真核细胞中的28SrRNA的4324位碱基腺嘌呤的N-C糖苷键，改变rRNA的构象并影响延伸因子与GTPase相关中心的结合，从而抑制蛋白质合成。TCS在中国有一百多年的使用历史，早期临床上将其用于终止早期、中期妊娠。后期研究发现，TCS具有免疫调节、抗病毒及抗肿瘤等作用。

研究表明，TCS的细胞毒性取决于细胞内浓度，所以TCS的细胞跨膜运输是其发挥生物活性的关键步骤。TCS虽然可通过受体介导的内吞或非特异性结合跨过细胞膜，但其跨膜效率较低，并且，当TCS经细胞内吞进入细胞后，在细胞内容易被溶酶体降解而失活，使其细胞内浓度降低。因此，提高TCS跨膜效率，增加其在肿瘤细胞内浓度可有效提高TCS的增殖抑制作用。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，构建一种MT1-MMP可激活的前药型天花粉蛋白药物递送系统，借助CPP和靶向肽，提高天花粉蛋白的胞内递送效率，增强其抗肿瘤活性。

为了实现上述目的，本发明提供一种MT1-MMP可激活的前药型天花粉蛋白药物递送系统，该药物递送系统包括由N端至C端的：天花粉蛋白TCS、细胞穿膜肽CPP、MT1-MMP特异性酶切位点、氨基酸连接体、MT1-MMP特异性结合肽；所述天花粉蛋白TCS的序列为SEQ IDNO：1所示，所述细胞穿膜肽CPP的序列为SEQ ID NO：2所示，所述MT1-MMP特异性酶切位点的序列为SEQ ID NO：3所示，所述氨基酸连接体的序列为SEQ ID NO：4所示，所述MT1-MMP特异性结合肽的序列为SEQ ID NO：5所示。

MDVSFRLSGATSSSYGVFISNLRKALPNERKLYDIPLLRSSLPGSQRYALIHLTNYADETISVAIDVTNVYIMGYRAGDTSYFFNEASATEAAKYVFKDAMRKVTLPYSGNYERLQTAAGKIRENIPLGLPALDSAITTLFYYNANSAASALMVLIQSTSEAARYKFIEQQIGKRVDKTFLPSLAIISLENSWSALSKQIQIASTNNGQFESPVVLINAQNQRVTITNVDAGVVTSNIALLLNRNNMALEG(SEQ ID NO：1)

VSRRRRRRGGRRRRGG(SEQ ID NO：2)

SLAPLGLQRR(SEQ ID NO：3)

GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：4)

HWKRLHNTKTFL(SEQ ID NO：5)

根据本发明一种优选实施方式，所述药物递送系统的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

MDVSFRLSGATSSSYGVFISNLRKALPNERKLYDIPLLRSSLPGSQRYALIHLTNYADETISVAIDVTNVYIMGYRAGDTSYFFNEASATEAAKYVFKDAMRKVTLPYSGNYERLQTAAGKIRENIPLGLPALDSAITTLFYYNANSAASALMVLIQSTSEAARYKFIEQQIGKRVDKTFLPSLAIISLENSWSALSKQIQIASTNNGQFESPVVLINAQNQRVTITNVDAGVVTSNIALLLNRNNMALEG-VSRRRRRRGGRRRRGG-SLAPLGLQRR-GGGGSGGGGSGGGGS-HWKRLHNTKTFL(SEQ ID NO：6)

本发明MT1-MMP激活的前药型天花粉蛋白递送系统(简称TCCLB)的结构及细胞选择性递送机理如下：递送系统由任选的6×His标签、TCS、CPP、MT1-MMP特异性酶切位点、Linker、MT1-MMP结合肽组成，如，6×His-TCS-CPP-SLAPLGLQRR-(GGGGS)

根据本发明一种优选实施方式，所述药物递送系统的N端还包括6×His标签。CPPs主要入胞机制是细胞内吞，通过内吞途径进入细胞的CPPs主要聚集在囊泡中，囊泡中的CPPs及其携载的药物容易被溶酶体降解。组氨酸残基在细胞内可产生内体缓冲作用(endosomal buffering effect)，造成溶酶体破裂，从而释放内容物，因此，优选利用组氨酸残基6×His标签作为蛋白的纯化收集标签，同时实现溶酶体逃逸，减少溶酶体对蛋白药物的降解。

本发明的第二方面提供所述前药型天花粉蛋白药物递送系统在制备卵巢癌细胞增殖抑制剂和/或卵巢癌细胞凋亡促进剂中的应用。

优选地，所述卵巢癌细胞为上皮性卵巢癌细胞SKOV3。

本发明的第三方面提供所述前药型天花粉蛋白药物递送系统在制备卵巢癌药物中的应用。

本发明构建MT1-MMP可激活的前药型天花粉蛋白药物递送系统，该药物递送系统能够借助CPP和靶向肽，增强CPP对肿瘤细胞的选择性胞内递送效率，提高天花粉蛋白的跨膜效率，增强其抗肿瘤活性。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

图1示出了TCCLB及对照组融合蛋白SDS-PAGE检测结果，其中，泳道M：Marker；泳道1：TCCLB；泳道2：TCS；泳道3：TCCLB-BP；泳道4：TCCLB-CPP；泳道5：TCCLB-CS。

图2示出了TCCLB及对照组在SKOV3细胞中的摄取图，其中，A：药物孵育2h的细胞摄取结果；B：药物孵育4h的细胞摄取结果；C：药物孵育6h的细胞摄取结果；Scale bar：20μm；FITC(绿色)标记融合蛋白，DAPI(蓝色)标记细胞核。

图3示出了TCCLB及对照组在SKOV3细胞中的摄取量化结果，其中，A：药物孵育2h的细胞摄取量化；B：药物孵育4h的细胞摄取量化；C：药物孵育6h的细胞摄取量化；ns无显著性差异，*P<0.05，***P<0.001，****P<0.0001，n＝3。

图4示出了TCCLB及其对照组细胞孵育48h的毒性检测结果，其中，A：TCCLB的IC

图5示出了TCCLB及其对照组的IC

图6示出了细胞凋亡的流式检测结果，其中，A：流式细胞术分析SKOV3细胞凋亡；B：细胞凋亡定量分析结果；**P<0.01，n＝3。

图7示出了凋亡相关蛋白免疫印迹分析结果，其中，A：TCCLB及TCS对SKOV3细胞凋亡通路相关蛋白表达的免疫印迹分析；B-E：凋亡通路相关蛋白表达量化分析结果。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。

实施例中未注明具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下实施例中，蛋白酶抑制剂、PMSF、FITC、MTT、高效RIPA裂解液购自北京索莱宝生物科技有限公司。AnnexinV-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒、特超敏ECL发光液购自大连美仑生物技术有限公司。分析型流式细胞仪Verse、脱脂奶粉购自美国BD公司。

主要溶液的配制：

1)FITC溶液的配制：取FITC粉末2mg，加入DMSO溶解为1mM，PBS溶液稀释为0.01mM，-20℃避光保存备用。

2)MTT溶液的配制：取MTT粉末10mg，加入2mL无菌PBS溶解，使用0.22μm的无菌滤膜进行过滤，并于-20℃避光保存备用。

3)0.2M磷酸盐(PB)溶液的配制：取1.7g的NaH

4)A1液的配制：A1液为含20mM PB、20mM咪唑及200mM NaCl的缓冲液，取0.2M的PB溶液100mL，50mL NaCl储备液(4.0M)、50mL甘油和6.25mL咪唑储备液(4.0M)于烧杯中，纯水定容至1L，使用0.22μm水系滤膜过滤，超声去除气泡，4℃保存备用。

5)透析液的配制：透析液为含20mM PB及200mM NaCl的缓冲液，取0.2M的PB溶液100mL，50mL NaCl储备液(4.0M)，定容至1L，4℃保存备用。

6)电泳缓冲液的配制：取10×蛋白电泳缓冲液0.1L，纯水稀释至1L，玻璃棒搅匀，室温保存备用，可重复使用3次。

7)转膜缓冲液的配制：取10×转移缓冲液0.1L，加入0.2L无水甲醇，纯水稀释至1L，室温保存备用。

8)TBST的配制：取20×TBS溶液0.05L，纯水稀释至1.0L，1mL Tween-20，玻璃棒搅匀，室温保存备用。

9)5％脱脂牛奶的配制：称取脱脂牛奶5g，加入至80mL的TBST溶液，涡旋完全溶解后，TBST定容至0.1L，4℃保存备用。

1、质粒构建

由基因合成公司根据所提供蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：6所示)优化合成编码该蛋白的DNA序列，进而通过Nde I–Hind III酶切位点连入pET-30a载体，构建得到融合蛋白表达质粒。

2、质粒转化

将重组质粒及感受态细胞分别从-20℃及-80℃冰箱取出，放置于冰盒中解冻30min，取1μL重组质粒加入至50μL BL21(DE3)pLysS感受态细胞中，冰上放置30min，42℃金属浴加热90s，再于冰上放置2min，于超净台中加入800μL 37℃的2×YT培养基，180rpm、37℃培养1h使感受态细胞复苏。将复苏的感受态细胞在离心机中以3000rpm的转速离心3min，在超净台中小心吸取上清液600μL，剩余的菌液使用移液枪小心混匀，并用涂布棒均匀涂布于含50μg/mL的KANA的琼脂板上，将琼脂板置于37℃条件下过夜培养，长出单菌落，4℃保存备用。

3、诱导与表达

挑取琼脂板上的单菌落于含50μg/mL KANA抗生素的2×YT培养基(25mL)中，220rpm、37℃过夜培养。第二天按3-5％的比例将培养液转移至500mL的2×YT培养基中，继续培养至OD

4、菌体裂解

将菌体从-20℃冰箱转移至冰上融化30min，加入适量A1液使其重悬，并以1：100的体积比加入蛋白酶抑制剂，用细胞破碎仪超声将细胞破碎，参数设置为：plus on 3s，plusoff 7s，频率20％，温度4℃，总时间15min。将细胞裂解液于9000rpm、4℃离心45min，收集上清液，使用0.22μm滤膜过滤去除黏性物质及残余大肠杆菌碎片，将离心上清液装入50mL规格的Super loop中。

5、TCCLB纯化

采用快速蛋白纯化系统(FPLC)纯化TCCLB。蛋白纯化过程利用系统自带MethodEditor进行方法编写，实现仪器的自动纯化。

按实施例1的方法，另外构建4组TCS递送体系，通过E.coli原核表达体系表达，经过蛋白纯化仪对融合蛋白进行纯化收集，各组融合蛋白组成如表1所示。为了验证酶切底物对MT1-MMP响应的有效性，将MT1-MMP特异性响应模块中的底物肽突变为MT1-MMP酶切效率较低的SGASENIRT，即TCCLB-CS；为了验证结合肽对MT1-MMP响应的有效性，将MT1-MMP特异性响应模块中的结合肽序列突变为GGGGGGSGGGGS，即TCCLB-BP；为考察CPP对蛋白药物入胞效率的影响，设计MT1-MMP的酶切底物为对照组，即MCCLB-CPP；此外，设计TCS为对照组。

表1

将5组融合蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳检测。检测结果如图1所示，TCS的分子量为27.0kDa左右，TCCLB和TCCLB-BP的分子量在33.1kDa左右，TCCLB-CS的分子量为31.6kDa左右，TCCLB-CPP的分子量为30.0kDa左右，这均与它们的理论分子量一致，表明MT1-MMP前药型天花粉蛋白递送体系及对照组的成功构建。

1、FITC荧光标记蛋白

融合蛋白经蛋白快速纯化仪纯化收集后，透析去除咪唑，测定蛋白浓度，将蛋白溶液稀释为10μM。将蛋白溶液依次加入至6孔板中，1mL/孔，分别加入FITC的PBS溶液，4℃、120rpm避光反应12h，以1：100的体积比加入50mM氯化铵停止反应2h，透析去除游离FITC。

2、细胞培养与种板

上皮性卵巢癌细胞SKOV3购自中国上海细胞库，细胞培养基为含20％的FBS，1％的青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基，细胞培养方式为：一天一次换液，三天一次传代，以1传3的比例传代，在37℃、5％CO

3、细胞摄取实验

细胞培养过夜后，弃去培养基，加入含2μM蛋白药物(即TCCLB及对照融合蛋白)的新鲜培养基，给药浓度为2μM，给药体积为0.5mL，在药物孵育2h、4h、6h后，弃去含药培养基，使用无菌PBS清洗3次后，用37℃预热的4％多聚甲醛固定10min，再用无菌PBS清洗3次，最后使用2μg/mL的DAPI溶液进行细胞核染色，细胞核染色7min后弃去染色液，并用无菌PBS清洗3次，立刻进行抠片。载玻片上滴一滴荧光封片剂，扣出细胞玻片，放置荧光封片剂处，于激光扫描显微镜下成像。

成像结果如图2、3所示，在各组蛋白与细胞孵育2h、4h、6h时，SKOV3细胞对TCS没有明显的细胞摄取，这说明TCS在卵巢癌细胞中的细胞跨膜效率较低。而TCCLB-CPP在细胞孵育2h、4h、6h时的荧光强度较强，说明CPP携载TCS跨膜提高了TCS的跨膜运输。SKOV3细胞在与TCCLB孵育2h、4h、6h时均有明显的细胞摄取，且细胞摄取量随着孵育时间的延长而逐渐增多，在孵育2h时荧光强度低于TCCLB-CPP、TCCLB-CS及TCCLB-BP，但在孵育4h后，荧光强度明显增强，说明递送系统中引入的ACPP和MT1-MMP结合肽提高了TCS的跨膜效率。

1、细胞种板

细胞培养与种板操作方法参考测试例2。将细胞进行消化、离心、重悬、计数。计算所需细胞数量，将SKOV3细胞接种96孔细胞板，接种量为1×10

2、抑制细胞增殖检测

细胞培养24h后，吸出培养基，将蛋白药物依次用培养基稀释为不同浓度，进行细胞孵育。药物与细胞孵育48h后，去除含药培养基，将5mg/mL的MTT溶液与新鲜培养基以1：10的体积比混匀，以200μL/孔加入至96孔板中。细胞培养箱内避光孵育4h后，弃去MTT溶液，加入150μL的DMSO，室温避光摇床溶解20min，用酶标仪检测每孔在490nm波长处的吸光度值。

通过MTT分别检测了TCCLB及其对照组与细胞孵育48h时的细胞存活率，拟合曲线得IC

表2 TCCLB及对照组融合蛋白的IC

1、MT1-MMP激活的前药型天花粉蛋白递送系统促细胞凋亡流式实验

1.1细胞种板

SKOV3细胞的培养与种板操作方法参考测试例2，将细胞接种于24孔细胞板，接种量为1×10

1.2细胞凋亡检测

细胞培养过夜后，吸出培养基，将蛋白药物用培养基稀释为2μg/mL，细胞孵育24h后。弃去培养基，加入200μL不含EDTA的胰酶消化细胞，1min后加入细胞培养基停止消化，收集细胞，转移至离心管内，1000g离心5min，弃去上清，加入1mL预冷的PBS重悬细胞，再次离心去除上清，重复洗涤两次。使用AnnexinV-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒中1×Bindingbuffer工作液100μL重悬细胞，分别加入5μL Annexin V-PE及10μL7-AAD染料，轻轻混匀，室温避光孵育15min。尼龙网膜过滤，流式细胞仪检测。

使用细胞流式术考察蛋白药物递送体系TCS及TCCLB的促凋亡作用，在与SKOV3细胞孵育24h后，于镜下观察，TCCLB给药组漂浮细胞较多，且细胞密度较低，使用染料AnnexinV标记早期凋亡细胞中的磷脂酰丝氨酸，染料7-AAD标记凋亡晚期细胞中的细胞核，通过流式细胞仪检测其AnnexinV及7-AAD的荧光标记情况。结果如图6的A所示，结果表明，TCCLB的细胞凋亡率在11.5％左右，而TCS的促凋亡率在4.5％左右，与Control相比，TCS组没有明显的促凋亡效果；与Control及TCS给药组相比，TCCLB组具有明显的促凋亡效果。说明TCCLB的构建有效提高了TCS在卵巢癌细胞中的跨膜效率，增强了TCS在卵巢癌细胞内的细胞凋亡效果。

2、MT1-MMP激活的前药型天花粉蛋白递送系统诱导的凋亡相关信号通路蛋白的免疫印迹分析

2.1细胞种板与给药

SKOV3细胞的培养与种板操作方法参考测试例2，将细胞进行消化、离心、重悬、计数，计算所需细胞数量，将细胞接种6孔细胞板，接种量为3×10

2.2蛋白提取

准备冰盒，将RIPA裂解液、PMSF、无菌PBS缓冲液及1.5mL离心管放置于冰上遇冷。待细胞给药孵育24h后，弃去含药培养基，使用无菌的冰PBS洗涤细胞3次以洗去细胞培养基，并小心的吸取残留液体。向细胞6孔板加入90μL的RIPA裂解液及10μL的PMSF，4℃摇床裂解5min，使用干净的细胞刮刀小心将细胞依次刮下，并用枪头吸至预冷的离心管中4℃摇床继续裂解25min后，以12000rmp、4℃离心20min，收集细胞上清液，测定蛋白浓度，取上清液160μL并加入40μL的5×Loading buffer，混匀后于100℃金属浴加热5min，4℃保存。

2.3MTI-MMP的免疫印迹分析

凝胶电泳：进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后取出凝胶并放置于转移缓冲液中放置备用。

转印：准备7.5cm×5.5cm的PVDF膜，使PVDF膜浸泡至无水甲醇中活化5min，随后用转膜缓冲液洗涤5min。准备厚滤纸于转膜缓冲液中浸泡10min，使滤纸充分湿润。打开半干式转印槽，使用前用75％的酒精擦拭干净，以滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸的顺序依次铺到阳极板上，每铺一层，用滚筒赶一次气泡，否则影响转印效果，擦干滤纸区域外的缓冲液，防止电流泄漏。盖上阴极盖及安全盖，打开电源，参数设置为25V，20min，开始转印。

封闭：转印结束后，小心取出PVDF膜置于TBST中摇床清洗5min，于5％的脱脂牛奶中室温封闭1h。

抗体孵育：封闭结束后，TBST摇床清洗3次，每次5min。使用5％的脱脂牛奶将一抗以说明书推荐比例稀释，将PVDF膜置于一抗溶液中4℃摇床过夜孵育。弃去一抗溶液，使用TBST摇床清洗残余一抗溶液，清洗3次，每次5min。使用5％的脱脂牛奶将二抗以说明书推荐比例稀释，室温摇床孵育1h后，使用TBST摇床清洗残余二抗溶液，清洗3次，每次5min。

显影：将超敏ECL发光液中的A液、B液以1：1的比例进行混合，均匀滴加到PVDF上，避光孵育1min，使用显影仪进行显影。

通过流式细胞术检测TCCLB的构建对SKOV3卵巢癌细胞的促凋亡效果后，通过免疫印迹分析相关检测凋亡通路蛋白酶的表达。如图7所示，与TCS相比，TCCLB组的Caspase-3、Caspase-9及Caspase-8的表达明显下调，表明TCS参与了卵巢癌细胞内受体介导的凋亡通路的激活。另外，由于Bcl-2家族成员是线粒体凋亡通路的关键调节因子，且Bax/Bcl-2比率的上调会导致细胞更容易发生凋亡，本发明同时检测了TCS诱导的SKOV3细胞凋亡是否受Bax、Bcl-2的影响。如图7的E所示，与TCS组相比，TCCLB明显降低了Bcl-2的表达且上调了Bax/Bcl-2的比例，表明TCS激活线粒体凋亡通路。最后，Caspase-3是凋亡通路的关键“执行者”，当凋亡通路被激活时Caspase-3发生下调，免疫印迹分析结果与之相符。另外，如图7的D所示，与TCS组相比，基因修复蛋白PARP在TCCLB组中明显下调，影响SKOV3细胞中的DNA修复从而促使细胞凋亡。这些结果均证明TCS激活了卵巢癌细胞内的受体介导的凋亡通路及线粒体凋亡通路，从而调控卵巢癌细胞的凋亡，本发明构建的MTI-MMP激活的前药型蛋白递送体系TCCLB通过提高TCS在卵巢癌细胞中的跨膜效率从而增强了TCS的促卵巢癌细胞凋亡作用。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

序列表

<110> 天津医科大学

<120> 一种MT1-MMP可激活的前药型天花粉蛋白药物递送系统及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 251

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asp Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Ala Thr Ser Ser Ser Tyr Gly

1 5 10 15

Val Phe Ile Ser Asn Leu Arg Lys Ala Leu Pro Asn Glu Arg Lys Leu

20 25 30

Tyr Asp Ile Pro Leu Leu Arg Ser Ser Leu Pro Gly Ser Gln Arg Tyr

35 40 45

Ala Leu Ile His Leu Thr Asn Tyr Ala Asp Glu Thr Ile Ser Val Ala

50 55 60

Ile Asp Val Thr Asn Val Tyr Ile Met Gly Tyr Arg Ala Gly Asp Thr

65 70 75 80

Ser Tyr Phe Phe Asn Glu Ala Ser Ala Thr Glu Ala Ala Lys Tyr Val

85 90 95

Phe Lys Asp Ala Met Arg Lys Val Thr Leu Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr

100 105 110

Glu Arg Leu Gln Thr Ala Ala Gly Lys Ile Arg Glu Asn Ile Pro Leu

115 120 125

Gly Leu Pro Ala Leu Asp Ser Ala Ile Thr Thr Leu Phe Tyr Tyr Asn

130 135 140

Ala Asn Ser Ala Ala Ser Ala Leu Met Val Leu Ile Gln Ser Thr Ser

145 150 155 160

Glu Ala Ala Arg Tyr Lys Phe Ile Glu Gln Gln Ile Gly Lys Arg Val

165 170 175

Asp Lys Thr Phe Leu Pro Ser Leu Ala Ile Ile Ser Leu Glu Asn Ser

180 185 190

Trp Ser Ala Leu Ser Lys Gln Ile Gln Ile Ala Ser Thr Asn Asn Gly

195 200 205

Gln Phe Glu Ser Pro Val Val Leu Ile Asn Ala Gln Asn Gln Arg Val

210 215 220

Thr Ile Thr Asn Val Asp Ala Gly Val Val Thr Ser Asn Ile Ala Leu

225 230 235 240

Leu Leu Asn Arg Asn Asn Met Ala Leu Glu Gly

245 250

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg Gly Gly

1 5 10 15

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ser Leu Ala Pro Leu Gly Leu Gln Arg Arg

1 5 10

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

His Trp Lys Arg Leu His Asn Thr Lys Thr Phe Leu

1 5 10

<210> 6

<211> 304

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Asp Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Ala Thr Ser Ser Ser Tyr Gly

1 5 10 15

Val Phe Ile Ser Asn Leu Arg Lys Ala Leu Pro Asn Glu Arg Lys Leu

20 25 30

Tyr Asp Ile Pro Leu Leu Arg Ser Ser Leu Pro Gly Ser Gln Arg Tyr

35 40 45

Ala Leu Ile His Leu Thr Asn Tyr Ala Asp Glu Thr Ile Ser Val Ala

50 55 60

Ile Asp Val Thr Asn Val Tyr Ile Met Gly Tyr Arg Ala Gly Asp Thr

65 70 75 80

Ser Tyr Phe Phe Asn Glu Ala Ser Ala Thr Glu Ala Ala Lys Tyr Val

85 90 95

Phe Lys Asp Ala Met Arg Lys Val Thr Leu Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr

100 105 110

Glu Arg Leu Gln Thr Ala Ala Gly Lys Ile Arg Glu Asn Ile Pro Leu

115 120 125

Gly Leu Pro Ala Leu Asp Ser Ala Ile Thr Thr Leu Phe Tyr Tyr Asn

130 135 140

Ala Asn Ser Ala Ala Ser Ala Leu Met Val Leu Ile Gln Ser Thr Ser

145 150 155 160

Glu Ala Ala Arg Tyr Lys Phe Ile Glu Gln Gln Ile Gly Lys Arg Val

165 170 175

Asp Lys Thr Phe Leu Pro Ser Leu Ala Ile Ile Ser Leu Glu Asn Ser

180 185 190

Trp Ser Ala Leu Ser Lys Gln Ile Gln Ile Ala Ser Thr Asn Asn Gly

195 200 205

Gln Phe Glu Ser Pro Val Val Leu Ile Asn Ala Gln Asn Gln Arg Val

210 215 220

Thr Ile Thr Asn Val Asp Ala Gly Val Val Thr Ser Asn Ile Ala Leu

225 230 235 240

Leu Leu Asn Arg Asn Asn Met Ala Leu Glu Gly Val Ser Arg Arg Arg

245 250 255

Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg Gly Gly Ser Leu Ala Pro Leu

260 265 270

Gly Leu Gln Arg Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

275 280 285

Gly Gly Gly Ser His Trp Lys Arg Leu His Asn Thr Lys Thr Phe Leu

290 295 300