一种香豆素类比率型荧光探针及其制备方法与应用方法

摘要

本发明涉及荧光探针检测技术领域，尤其涉及一种香豆素类比率型荧光探针及其制备方法与应用。该探针以2，4‑二羟基苯甲醛和4‑氯苯乙酸为原料，先经缩合、酰化、水解反应得到荧光母体3‑(4‑氯苯基)‑7‑羟基香豆素(CHCO)，再与4‑溴丁酰氯经酰化反应得到探针COCB。在365nm紫外灯照射下，探针溶液本身呈现紫色荧光，与肼反应后显示强蓝色荧光，从而实现对肼的比率检测。在PBS：DMSO＝1:1的混合液中，探针COCB对肼具有专一的选择性、很强的抗干扰能力，较高的灵敏度，其检测限为0.15μM。此外，探针COCB还具有合成简便，检测范围宽等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及荧光探针检测技术领域，尤其涉及一种香豆素类比率型荧光探针及其制备方法与应用方法。

背景技术

肼作为一种重要的精细化工原料，已被广泛用于化学、制药、催化和农业等领域。由于具有高燃烧焓，肼还常被用作火箭推进和导弹系统中的高能燃料。但另一方面，肼也是一种高毒性物质，具有致突变性与致癌性，很容易经皮肤、呼吸或口服进入人体，对肝、肺、肾和神经系统等造成严重损害。美国环境保护署(EPA)已将肼列为可能的人类致癌物，建议其阈限值为0.31μM。因此，开发一种选择性识别和灵敏检测环境与生物体中痕量肼的方法具有重要的现实意义。

迄今为止，文献报道的肼检测方法有滴定法、电化学法和色谱法等，但这些方法存在仪器设备昂贵、样品前处理复杂、耗时且不能实时检测等缺点。与以上分析方法相比，荧光分析法因灵敏度高、特异性强、成本低、无侵入性，生物相容性好以及能实时检测，已被广泛应用于痕量肼的检测。近些年，文献报道了许多用于检测肼的荧光探针，但其中大部分荧光探针是荧光增强型或淬灭型，其检测信号容易受到物质浓度、外界环境以及设备稳定性等因素的影响。相比较而言，比率型荧光探针通过测定其与被测化合物反应前后双发射峰的比例变化来实现对被测物质的精确检测，克服了单纯依靠荧光增强或减弱带来的实验误差。目前，用于检测肼的比率型荧光探针的报道还相对较少，所以开发一种结构简单、性能优异的比率型肼荧光探针是本领域技术人员急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种香豆素类比率型荧光探针及其制备方法与应用方法，以解决现有技术存在的缺陷。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种香豆素类比率型荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)将2,4-二羟基苯甲醛、4-氯苯乙酸、三乙胺和醋酸酐混合后进行反应，反应产物顺次进行静置抽滤、水洗、干燥，得中间产物；

(2)将中间产物、浓盐酸和丙酮混合后进行反应，反应产物顺次进行静置抽滤、干燥、纯化，得到荧光母体3-(4-氯苯基)-7-羟基香豆素；

(3)将荧光母体3-(4-氯苯基)-7-羟基香豆素、缚酸剂、4-二甲氨基吡啶和二氯甲烷混合，再将4-溴丁酰氯的二氯甲烷溶液滴入混合液中反应，得到香豆素类比率型荧光探针。

优选的，所述步骤(1)中，2,4-二羟基苯甲醛、4-氯苯乙酸、三乙胺和醋酸酐的摩尔比为1:1～2：2～4：5～100；所述反应的温度为80～150℃，反应的时间为5～10h。

优选的，所述步骤(2)中，中间产物在丙酮和浓盐酸混合液中的质量分数为1～20％，所述丙酮与浓盐酸的体积比为1:1～3，浓盐酸的浓度为8～12mol/L；所述步骤(2)反应的温度为60～100℃，反应的时间为4～10h。

优选的，所述步骤(3)中，荧光母体3-(4-氯苯基)-7-羟基香豆素、4-溴丁酰氯、缚酸剂的摩尔比为1:1～2：2～4；所述荧光母体3-(4-氯苯基)-7-羟基香豆素与4-二甲氨基吡啶的摩尔比为5～20:1，混合液中荧光母体3-(4-氯苯基)-7-羟基香豆素与二氯甲烷的质量体积比为0.1g：15～25mL。

优选的，所述缚酸剂为N,N-二异丙基乙胺、三乙胺和吡啶中的一种或几种。

优选的，所述4-溴丁酰氯的二氯甲烷溶液中4-溴丁酰氯的浓度为0.05～0.15mol/L。

本发明还提供了一种由上述制备方法制备得到的香豆素类比率型荧光探针，所述香豆素类比率型荧光探针的结构式为：

本发明还提供了一种上述香豆素类比率型荧光探针检测肼含量的方法，包括以下步骤：

(1)将肼的缓冲溶液和香豆素类比率型荧光探针COCB混合，得到含有探针COCB的标准溶液；

(2)测定所述标准溶液的荧光发射光谱，激发波长为350nm，以肼浓度为横坐标，以I

(3)向待测样品中加入探针COCB，控制其浓度与所述标准溶液中探针COCB的浓度相等，测定其在激发波长为350nm激发光下的荧光发射光谱，根据标准曲线计算得出待测样品中肼的含量。

优选的，所述标准溶液的pH值为4～11；标准溶液中探针COCB的浓度为0.1～10μM；标准溶液中肼的浓度为0.1μM～1mM。

优选的，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液或HEPES缓冲溶液。

经由上述技术方案可知，与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明的香豆素类荧光探针COCB结构简单，易于合成。探针COCB基于荧光母体3-(4-氯苯基)-7-羟基香豆素的分子内电荷转移(ICT)过程来实现对肼的选择性识别。在紫外灯照射下，不加肼时探针溶液呈现紫色荧光，加肼后探针溶液显示强蓝色荧光，是一种荧光比率型荧光探针，能有效消除检测条件差异对检测结果的影响，提高检测的灵敏度。探针还能在较宽的浓度(0～250μM)和pH(4～11)范围内，灵敏、特异性的识别与检测肼，基本不受其他竞争性物质的干扰，对肼的最低检测限为0.15μM，能很好满足复杂环境中或生物体内痕量肼的定量检测，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例1所制备的荧光母体3-(4-氯苯基)-7-羟基香豆素的

图2为实施例1所制备的荧光母体3-(4-氯苯基)-7-羟基香豆素的

图3为实施例1所制备的荧光母体3-(4-氯苯基)-7-羟基香豆素的高分辨质谱图；

图4为实施例1所制备的探针COCB的

图5为实施例1所制备的探针COCB的

图6为实施例1所制备的探针COCB的高分辨质谱图；

图7为实施例1所制备的探针COCB以及探针COCB与肼反应的荧光强度比值I

图8为实施例1所制备的探针COCB加入不同浓度(μM)肼的荧光光谱变化；

图9为实施例1所制备的探针COCB加入不同浓度肼的荧光强度比值I

图10为实施例1所制备的探针COCB以及探针COCB与肼反应的荧光强度比值I

图11为实施例1所制备的探针COCB在PBS:DMSO＝1:1体系中加入不同干扰物的荧光光谱；

图12为其他干扰物对实施例1所制备的探针COCB加肼体系荧光强度比值I

具体实施方式

本发明提供了一种香豆素类比率型荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)将2,4-二羟基苯甲醛、4-氯苯乙酸、三乙胺和醋酸酐混合后进行反应，反应产物顺次进行静置抽滤、水洗、干燥，得中间产物；

(2)将中间产物、浓盐酸和丙酮混合后进行反应，反应产物顺次进行静置抽滤、干燥、纯化，得到荧光母体3-(4-氯苯基)-7-羟基香豆素；

(3)将荧光母体3-(4-氯苯基)-7-羟基香豆素、缚酸剂、4-二甲氨基吡啶和二氯甲烷混合，再将4-溴丁酰氯的二氯甲烷溶液滴入混合液中反应，得到香豆素类比率型荧光探针。

在本发明中，所述步骤(1)中，2,4-二羟基苯甲醛、4-氯苯乙酸、三乙胺和醋酸酐的摩尔比为1:1～2：2～4：5～100，优选为1:1.2～1.6：2～4：5～100；所述反应的温度为80～150℃，优选为100～140℃，反应的时间为5～10h，优选为6～8h。

在本发明中，所述步骤(2)中，中间产物在丙酮和浓盐酸混合液中的质量分数为1～20％，优选为5～8％，所述丙酮与浓度为8～12mol/L浓盐酸的体积比为1:1～3，优选为1：1.5～2.5，浓盐酸的浓度为10～12mol/L；所述步骤(2)反应的温度为60～100℃，优选为70～90℃，反应的时间为4～10h，优选为5～7h。

在本发明中，所述步骤(3)中，荧光母体3-(4-氯苯基)-7-羟基香豆素、4-溴丁酰氯、缚酸剂的摩尔比为1:1～2：2～4，优选为1:1.2～1.7:3～3.8；所述荧光母体3-(4-氯苯基)-7-羟基香豆素与4-二甲氨基吡啶的摩尔比为5～20:1，优选为10～15:1；混合液中荧光母体3-(4-氯苯基)-7-羟基香豆素与二氯甲烷的质量体积比为0.1g：15～25mL，优选为0.1g：18～22mL。

在本发明中，所述缚酸剂为N,N-二异丙基乙胺、三乙胺和吡啶中的一种或几种，优选为N,N-二异丙基乙胺或三乙胺。

在本发明中，所述4-溴丁酰氯的二氯甲烷溶液中4-溴丁酰氯的浓度为0.05～0.15mol/L，优选为0.1～0.13mol/L。

本发明还提供了一种由上述制备方法制备得到的香豆素类比率型荧光探针，所述香豆素类比率型荧光探针的结构式为：

本发明还提供了一种上述香豆素类比率型荧光探针检测肼含量的方法，包括以下步骤：

(1)将肼的缓冲溶液和探针COCB混合，得到含有探针COCB的标准溶液；

(2)测定所述标准溶液的荧光发射光谱，激发波长为350nm，以肼浓度为横坐标，以I

(3)向待测样品中加入探针COCB，控制其浓度与所述标准溶液中探针COCB的浓度相等，测定其在激发波长为350nm激发光下的荧光发射光谱，根据标准曲线计算得出待测样品中肼的含量。

在本发明中，所述标准溶液的pH值为4～11；标准溶液中探针COCB的浓度为0.1～10μM，优选为0.2～2μM；标准溶液中肼的浓度为0.1μM～1mM，优选为0.1～250μM。

在本发明中，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液或HEPES缓冲溶液，优选为磷酸盐缓冲溶液。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

将2，4-二羟基苯甲醛(0.5g，3.6mmol)，4-氯苯乙酸(0.93g，5.4mmol)以及三乙胺(1.1g，10.8mmol)置于圆底烧瓶中，加入醋酸酐(10mL，90.8mmol)，120℃油浴加热，反应7h后，停止反应，冷却，加水20mL后析出大量固体，抽滤、水洗、干燥，得中间产物；

将中间产物置于圆底烧瓶中，加入8mL浓度为12mol/L浓盐酸，4mL丙酮，中间产物在丙酮和浓盐酸混合液中的质量分数为10％，在80℃油浴中加热搅拌反应，6h后停止反应，冷却，加水抽滤，干燥，得固体粗品；经硅胶柱(流动相为乙酸乙酯:石油醚＝1:2，V:V)纯化得荧光母体3-(4-氯苯基)-7-羟基香豆素(CHCO)0.6g，产率为61％。

将荧光母体3-(4-氯苯基)-7-羟基香豆素(CHCO)(0.1g，0.37mmol)，DIPEA(0.14g，1.1mmol)以及DMAP(4.5mg，0.037mmol)置于圆底烧瓶中，加入20mL二氯甲烷，室温下搅拌(搅拌速率为300r/min)。将4-溴丁酰氯0.1g(0.56mmol)溶于5mL二氯甲烷中，缓慢滴至反应液中；30min滴完后，室温下搅拌(搅拌速率为300r/min)反应7h，除去溶剂，过硅胶柱(乙酸乙酯：石油醚＝1：3，V：V)纯化得产物0.13g，收率83％。

实施例1所制备的荧光母体CHCO的

实施例1所制备的荧光母体CHCO的

实施例1所制备的荧光母体CHCO的高分辨质谱谱图如图3所示，ESI-HRMS Calcdfor C

实施例1所制备的探针COCB的

实施例1所制备的探针COCB的

实施例1所制备的探针COCB的高分辨质谱谱图如图6所示，ESI-HRMS Calcd forC

实施例2

将2，4-二羟基苯甲醛(0.5g，3.6mmol)，4-氯苯乙酸(0.61g，3.6mmol)以及三乙胺(0.73g，7.2mmol)置于圆底烧瓶中，加入醋酸酐(8mL，72.6mmol)，100℃油浴加热，反应约4h后，停止反应，冷却，加水22mL后析出大量固体，抽滤、水洗、干燥，得中间产物；

将中间产物置于圆底烧瓶中，加入6mL浓度为10mol/L浓盐酸，6mL丙酮，中间产物在丙酮和浓盐酸混合液中的质量分数为5％，在100℃油浴中加热搅拌反应，约10h后停止反应，冷却，加水抽滤，干燥，得固体粗品；经硅胶柱(流动相为乙酸乙酯:石油醚＝1:2，V:V)纯化得荧光母体3-(4-氯苯基)-7-羟基香豆素(CHCO)0.49g，产率为50％；

将荧光母体3-(4-氯苯基)-7-羟基香豆素(CHCO)(0.1g，0.37mmol)，三乙胺(0.075g，0.74mmol)以及DMAP(3mg，0.025mmol)置于圆底烧瓶中，加入20mL二氯甲烷，室温下搅拌(搅拌速率为350r/min)。将4-溴丁酰氯0.069g(0.37mmol)溶于5mL二氯甲烷中，缓慢滴至反应液中；28min滴完后，室温下搅拌(搅拌速率为350r/min)反应10h，除去溶剂，过硅胶柱(乙酸乙酯：石油醚＝1：3，V：V)纯化得产物0.12g，收率64％。

实施例3

将2，4-二羟基苯甲醛(0.5g，3.6mmol)，4-氯苯乙酸(1.23g，7.2mmol)以及三乙胺(1.44g，14.4mmol)置于圆底烧瓶中，加入醋酸酐(15mL，136.2mmol)，150℃油浴加热，反应约5h后，停止反应，冷却，加水20mL后析出大量固体，抽滤、水洗、干燥，得中间产物；

将中间产物置于圆底烧瓶中，加入9mL浓度为9mol/L浓盐酸，3mL丙酮，中间产物在丙酮和浓盐酸混合液中的质量分数为15％，在60℃油浴中加热搅拌反应，约10h后停止反应，冷却，加水抽滤，干燥，得固体粗品；经硅胶柱(流动相为乙酸乙酯:石油醚＝1:2，V:V)纯化得荧光母体3-(4-氯苯基)-7-羟基香豆素(CHCO)0.55g，产率为56％；

将荧光母体3-(4-氯苯基)-7-羟基香豆素(CHCO)(0.1g，0.37mmol)，吡啶(0.12g，1.48mmol)以及DMAP(9mg，0.074mmol)置于圆底烧瓶中，加入20mL二氯甲烷，室温下搅拌(搅拌速率为400r/min)。将4-溴丁酰氯0.14g(0.74mmol)溶于5mL二氯甲烷中，缓慢滴至反应液中；32min滴完后，室温下搅拌(搅拌速率为400r/min)反应4h，除去溶剂，过硅胶柱(乙酸乙酯：石油醚＝1：3，V：V)纯化得产物0.12g，收率77％。

测试例1

探针COCB光谱性质的测试方法

将实施例1制备的探针COCB溶于DMSO配成10mM的储备液，低温保存；将阳离子(K

测试例2

实施例1制备的探针COCB与肼的反应时间对荧光强度的影响

如图7所示，在PBS缓冲液(50％DMSO,10mM,pH＝7.4)中，探针COCB(5μM)在0～90min内荧光发射比(I

测试例3

肼的浓度对实施例1制备的探针COCB荧光强度的影响

在PBS缓冲液(50％DMSO，10mM,pH＝7.4)中，肼浓度为0～1000μM的范围内，探针COCB(5μM)荧光发射光谱的变化情况，如图8所示，当激发波长为350nm时，未添加肼的COCB在420nm处有较强的荧光发射，而在480nm处没有荧光。随着肼浓度不断增加(0～100μM)，COCB在420nm处的荧光逐渐减弱，480nm处的荧光强度逐渐增强，荧光发射表现出较大的红移(60nm)，溶液的荧光从紫色变成蓝色，这表明探针COCB可用于肼的比率检测。

图9为实施例1所制备的探针COCB加入不同浓度肼(浓度如图9所示)的荧光强度比值I

测试例4

pH对实施例1制备的探针COCB检测性能的影响

图10为实施例1所制备的探针COCB以及探针COCB与肼反应的荧光强度比值I

测试例5

实施例1制备的探针COCB对其他竞争性物质的选择性和抗干扰性研究

选取部分可能干扰的阳离子(K

为了进一步检验探针COCB在肼与其他竞争性分析物共存时检测肼的能力，对探针COCB进行了抗干扰性实验。在5μM探针COCB和100当量上述各种分析物的混合溶液中，再加入100当量的肼，测定混合液的荧光光谱变化。如图12所示，在肼和这些干扰物共存的情况下，探针COCB的荧光发射比(I

由以上实施例和测试例可知，本发明提供了一种香豆素类比率型荧光探针及其制备方法与应用方法，本发明的香豆素类荧光探针COCB结构简单，易于合成，能很好满足复杂环境中或生物体内痕量肼的定量检测，具有重要的应用价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。