低钾胁迫响应相关的GhERF9蛋白及其相关生物材料与应用

摘要

本发明公开了一种与低钾胁迫响应相关的GhERF9蛋白质及其相关生物材料与应用。所述GhERF9蛋白质具体可为如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：A1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.1的蛋白质；A2)将A1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有75％以上的同一性且具有调控低钾胁迫活性的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。GhERF9蛋白质及其相关生物材料可用于调控植物的对低钾胁迫的响应能力。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中低钾胁迫响应相关的GhERF9蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

钾是植物细胞中含量最丰富的阳离子，是植物生长发育过程中所必须的大量矿质营养元素之一，对植物各阶段的生长发育都发挥着关键作用，决定了农作物最终的产量和品质，被称为作物的品质元素。

棉花是喜钾的经济作物，在其生长发育过程中需要大量的钾营养。钾能够促进棉花地上部和根系的生长发育，增加干物质积累。但近年来随着棉花复种指数和产量的逐步提高，以及转基因抗虫棉的推广普及，棉花生产中的缺钾现象和缺钾程度越来越普遍和严重。另外，由于不合理的肥料运筹，棉花生产中的缺钾现象进一步加剧，常常导致早衰并严重影响产量提高和品质改善。

自上世纪90年代起，人们对植物钾营养性状的分子遗传机制进行了系统和深入的研究。植物中众多的钾离子通道、钾转运体以及相关的调控蛋白被相继克隆出来。它们在钾亲和性、选择性和能量的偶联上的作用都是不相同的。根据钾转运和通道蛋白结构和功能上的不同，可将其分为3个钾通道家族和3个钾转运体家族。分别是：Shaker钾通道、TPK钾通道、Kir-like钾通道和KUP/HAK/KT钾转运体、TPK/HKT转运体、CPA阳离子质子反向转运体。

棉花是重要的经济作物，对经济发展具有重要意义。缺钾导致棉花早衰，严重影响棉花产量的提高和品质的改善。多年来，人们采用传统常规选育等方法解决棉花品种缺钾问题，但往往耗资大、工作量大和选择效率不高。随着分子生物学的不断发展，利用生物技术手段，培育耐低钾棉花品种成为可能。当前棉花的基因克隆工作虽然已经取得了一定的成果，但棉花的基因克隆工作远远落后于棉花、玉米、小麦等粮食作物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高低钾条件下植物产量。

本发明提供了一种蛋白质，名称为GhERF9，是如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：

A1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)将A1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有75％以上的同一性且具有调控低钾胁迫响应活性的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。

其中，SEQ ID No.1由222个氨基酸残基组成。

上述蛋白质可来源于棉花。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述75％以上的同一性可为至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的同一性。

上述蛋白质中，所述蛋白质标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白质一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白质的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白质标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等，部分可用标签的氨基酸序列见表1。

表1标签的序列

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

与蛋白质GhERF9相关的生物材料也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的与蛋白质GhERF9相关的生物材料，为下述B1)至B5)中的任一种：

为下述B1)至B5)中的任一种：

B1)编码所述蛋白质GhERF9的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子为如下b1)-b2)中任一所示的基因：

b1)编码链的编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；

b2)核苷酸是SEQ ID No.2的DNA分子。

上述生物材料中，B2)所述的含有所述DNA分子的表达盒(GhERF9基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GhERF9的DNA分子，该DNA分子不但可包括启动GhERF9基因转录的启动子，还可包括终止GhERF9转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiology 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白质酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 1 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白质、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I

可用现有的植物表达载体构建含有所述蛋白质GhERF9编码基因或所述蛋白质GhERF9编码基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体可为Gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pHBT-GFP、pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pGWB18、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。使用GhERF9构建重组载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌；如所述细菌可以为农杆菌GV3101菌株。

上述的蛋白质、或上述生物材料的下述C1-C2中的任一种中的应用也属于本发明的保护范围：

C1)调控植物低钾胁迫下响应能力中的应用；

C2)制备调控植物低钾胁迫下响应能力的产品中的应用。

本发明中，所述调控可为上调或增强或提高。所述调控也可为下调或减弱或降低。

本发明还提供一种提高植物低钾胁迫下响应能力的方法，所述方法包括步骤M，所述步骤M为增强、提高或上调目的植物中GhERF9蛋白的活性和/或含量，或/和，增强、提高或上调GhERF9蛋白的编码基因的表达量，来提高植物植物低钾胁迫响应能力。

上述方法中，所述目的植物可为双子叶植物。所述双子叶植物可为锦葵科植物，进一步可为棉属植物，具体可为棉花。

上述方法中，所述低钾胁迫下响应能力，具体可表现为叶片叶绿素含量提高，目植物生物量增加，植物各部分钾离子含量提高。所述生物量可指地上部干重、叶片重、根重等。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了植物试剂，其作用为调控低钾胁迫响应能力。

本发明所提供的植物试剂含有所述的蛋白质或/和所述的蛋白质相关的生物材料。

上述植物试剂的活性成分可为所述的蛋白质或/和所述的蛋白质相关的生物材料，上述植物试剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述植物试剂的其他活性成分本领域技术人员可根据低钾胁迫下的响应能力效果确定。

所述目的植物可为双子叶植物。所述双子叶植物可为锦葵科植物，进一步可为棉属植物，具体可为棉花。

棉花中GhERF9基因沉默的实验证明，沉默GhERF9基因的转基因棉花与对照相比，对低钾胁迫更为敏感，其K

附图说明

图1为本发明实施例1中棉花GhERF9与拟南芥AtERF9的蛋白质序列同源比对。

图2为本发明实施例1中棉花GhERF9的亚细胞定位结果。

图3为本发明实施例1中棉花GhERF9基因组织特异性表达分析。SCRC22为“鲁棉研22号”，CCRI41为“中棉所41”。图中，*代表差异显著性分析结果为P<0.05，**代表差异显著性分析结果为P<0.01，***代表差异显著性分析结果为P<0.001。

图4为本发明实施例1中棉花GhERF9基因组受低钾胁迫的表达水平变化。不同小写字母代表处理间的差异显著性分析结果为P<0.05。

图5为本发明实施例2中VIGS-GhERF9植株的沉默效率检测及低钾胁迫表型。图5的A图为VIGS植株中GhERF9和GhHAK5的沉默检测，图5的B图为全植株表型照片，图5的C图为植株自下而上叶片的表型照片。图中，*代表差异显著性分析结果为P<0.05。

图6为本发明实施例2中VIGS-GhERF9植株的生理指标。图中，*代表差异显著性分析结果为P<0.05。

图7为本发明实施例2中VIGS植株的K

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的pHBT-GFP载体均记载于非专利文献“Bai L,Ma XN,Zhang GZ,Song SF,Zhou L,Gao LJ,Miao YC,Song CP.A receptor-like kinase mediatesammonium homeostasis and is important for the polar growth of root hairs inArabidopsis.The Plant Cell,2014,26(4):1497-1511.”，公众可以从中国农业大学(即申请人处)获得，以重复本申请实验。

下述实施例中的pTRV1、pTRV2、pTRV2-GhCLA1、pTRV2-GhHAK5和pTRV2-GFP载体均记载于非专利文献“Wang YR,Wang Y,Li B,Xiong CM,Eneji AE,Zhang MC,Li FJ,TianXL,Li ZH.The cotton high-affinity K

下述实施例中的棉花品种“中国棉所41”(钾低效型品种)和“鲁棉研22号”(钾高效型品种)记载于非专利文献“Yang DD,Li FJ,Yi F,Eneji AE,Tian XL,LiZH.Transcriptome analysis unravels key factors involved in response topotassium deficiency and feedback regulation of K

下述实施例采用SPSS 21.0(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用邓肯氏多重比较(Duncan multiplecomparison procedure)检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异。

实施例1、GhERF9蛋白及其编码基因的克隆及定位

从低钾胁迫酵母单杂交文库中筛选到结合在棉花钾转运体GhHAK5启动子上的转录因子，利用棉花数据库比对到Gh_D02G1817的蛋白序列，检索拟南芥蛋白同源基因序列，根据蛋白的多序列比对结果采用邻接法(neighbor joining)生成进化树。进化树结果与拟南芥AtERF9(AT5G44210)同源性最高，因此该基因命名为GhERF9(蛋白序列比对结果见图1)。从棉花品种“鲁棉研22号”中获得一个新蛋白，将其命名为GhERF9。具体如下：

根据棉花数据库得到的GhERF9基因序列,设计两条特异性引物，为F1和R1：

F1：5’-ATGGCTCCCCAAGACAAAA-3’；

R1：5’-TCAAGCATCGACTGGAGG-3’。

使用艾德莱RNA试剂盒抽提棉花“鲁棉研22号”叶片RNA，用M-MLV反转录试剂盒合成第一链cDNA，所得的第一链cDNA用于扩增GhERF9基因全长。

20μLPCR反应体系包括模板10xBuffer 2μL、10mmol/L dNTPs 2μL、MgSO

取PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳。电泳完毕在紫外灯下切下目的条带，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自天根生化科技有限公司)纯化，操作步骤参照该试剂盒的使用说明书。

回收完的片段末端需要加A，10μL反应体系为：10xBuffer 1μL、dATP1μL、Taq酶0.5μL、回收片段7.5μL，72℃反应半小时，得到加A后的回收片段。加A后的回收片段与PMD18-T载体(购自TaKaRa公司)连接，操作按照TaKaRa公司的说明书进行，PCR管中依次加入：加A后的回收片段4.5μL、PMD18-T 0.5μL、Solution I5μL，总体积为10μL；于16℃连接过夜。

取5μL连接产物，采用热击法(参照J.萨姆布鲁克，等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L氨苄霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个克隆测序(测序工作由上海invitrogen公司完成)，获得所需的全长基因cDNA。测序结果表明，GhERF9基因的cDNA序列全长669bp，核苷酸序列见SEQID No.2，编码222个氨基酸的完整的ORF阅读框，其编码蛋白质GhERF9，该蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1。GhERF9的编码序列(CDS)为SEQ ID No.2。

二、GhERF9蛋白的亚细胞定位

提取“鲁棉研22号”的根系总RNA并反转录为cDNA，以F2和R2为引物进行PCR扩增，F2和R2的序列如下：

F2：5’-CGGGATCCATGGCTCCCCAAGACAAAA-3’；

R2：5’-GAAGGCCTAGCATCGACTGGAGG-3’。

将得到的PCR扩增产物用限制性内切酶BamHI和StuI双酶切，同时用限制性内切酶BamHI和StuI双酶切pHBT-GFP载体，回收产物进行同源重组，将GhERF9的cDNA序列构建在pHBT-GFP载体上，得到以GhERF9的cDNA序列(SEQ ID No.2)替换pHBT-GFP载体的限制性核酸内切酶BamHI和StuI识别位点间的片段(包括BamHI的识别位点和StuI识别位点在内的小片段)，保持pHBT-GFP载体的其它序列不变，得到GhERF9蛋白的重组表达载体，命名为pHBT-GFP-GhERF9。

重组表达载体pHBT-GFP-GhERF9在拟南芥叶片原生质体中瞬时转化。显微镜观察结果显示，GhERF9与核定位marker出现共定位(定位结果见图2)，说明GhERF9蛋白是细胞核定位的蛋白。

三、GhERF9基因的组织特异性表达

通过荧光实时定量PCR对棉花品种“中国棉所41”和“鲁棉研22号”材料中GhERF9基因的表达部位进行分析：荧光实时定量PCR所用的仪器为ABI 7500Fast(AppliedBiosystem)，所用的引物对为F3和R3，序列如下：

F3：5’-GCGTGAGTTTCGTGGACCTA-3’；

R3：5’-TGTTGACTCCACGCTCCAC-3’。

用于检测组织特异性表达的样本为正常营养水平下三叶期棉花各部位的总RNA反转录得到的cDNA，PCR程序：94℃变性30s；94℃变性5s、60℃退火35s、40个循环；相对表达量采用2

F-Actin9：5’-GCCTTGGACTATGAGCAGGA-3’；

R-Actin9：5’-AAGAGATGGCTGGAAGAGGA-3’。

正常营养水平下三叶期棉花各部位GhEF9基因的相对表达量见图3，GhERF9在棉株体内呈组成型表达，茎、顶芽、叶和根中均有表达，且除茎以外，GhERF9在钾高效型品种“鲁棉研22号”中的表达量均高于钾低效型品种“中棉所41”。

四、不同钾处理GhERF9基因的组织特异性表达

以“鲁棉研22号”为试验材料，在幼苗三叶期时进行0.03mM K

实施例2、VIGS沉默植株表型

一、VIGS-GhERF9沉默载体的构建

1、提取棉花品种“鲁棉研22号”叶片的总RNA并反转录为cDNA。

2、以步骤1得到的cDNA为模板，用F4和R4组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F4：5’-CCG

R4：5’-CGG

(请核对引物序列)

3、用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切步骤2得到的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切pTRV2载体，回收载体骨架。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到以GhERF9的cDNA片段(核苷酸序列是SEQ ID No.2的第165-467位)替换pTRV2载体的限制性核酸内切酶EcoRI和KpnI识别位点间的片段(包括EcoRI的识别位点和KpnI识别位点在内的小片段)，保持pTRV2载体的其它序列不变，得到的重组质粒命名为pTRV2-GhERF9。

二、VIGS-GhERF9沉默植株的获得

1、将重组质粒pTRV2-GhERF9导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。然后，用VIGS溶液悬浮所述重组农杆菌，得到OD

2、将pTRV1载体导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。然后，用VIGS溶液悬浮所述重组农杆菌，得到OD

3、将步骤1得到的菌液和步骤2得到的菌液等体积混合，得到混合液甲。

4、将pTRV2-GhCLA1、pTRV2-GhHAK5和pTRV2-GFP分别导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。然后，用VIGS溶液悬浮所述重组农杆菌，分得到OD

5、将步骤4得到的pTRV2-GhCLA1、pTRV2-GhHAK5和pTRV2-GFP菌液分别和步骤2得到的菌液等体积混合，分别得到混合液乙、丙和丁。

6、分组注射

试验组(VIGS-GhERF9，即GhERF9基因沉默组)：对子叶期的“鲁棉研22号”植株进行操作：在子叶下表面注射混合液甲(每株植株均对两片子叶进行注射，注射至充满子叶为止)。

阳性对照组1(VIGS-GhCLA1，即GhCLA1基因沉默组)：对子叶期的“鲁棉研22号”植株进行操作：在子叶下表面注射混合液乙(每株植株均对两片子叶进行注射，注射至充满子叶为止)。

阳性对照组2(VIGS-GhHAK5，即GhHAK5基因沉默组)：对子叶期的“鲁棉研22号”植株进行操作：在子叶下表面注射混合液丙(每株植株均对两片子叶进行注射，注射至充满子叶为止)。

阴性对照组(VIGS-Ctrl)：对子叶期的“鲁棉研22号”植株进行操作：在子叶下表面注射混合液丁(每株植株均对两片子叶进行注射，注射至充满子叶为止)。

各组植株均在Hoagland’s营养液中进行水培，每周更换新的营养液。

三、VIGS-GhERF9沉默植株的表型

按上述方法得到沉默GhERF9基因的棉花植株，注射第14天后注射pTRV2-GhCLA1菌液的阳性对照组1(VIGS-GhCLA1)植株出现白化表型。

检测试验组(VIGS-GhERF9)植株的基因沉默效率(图5的A图)。并将试验组(VIGS-GhERF9)沉默植株、阳性对照组2(VIGS-GhHAK5)沉默植株及阴性对照组(VIGS-Ctrl)进行正常营养液(CK,2.5mM K

叶绿素含量测定方法：Tang DQ,Qian HM,Zhao LX,Huang DF,TangKX.2005.Transgenic tobacco plants expressing BoRS1 gene from Brassicaoleracea var.acephala show enhanced tolerance to water stress.J.Biosci 30,647–655。检测自下而上第一叶(1L)、第二叶(2L)、第三叶(3L)和第四叶(4L)的叶绿素含量。每种处理下每组植株抽取12个植株的样本，结果取平均值。

干重的检测方法：80℃(烘干至恒重)，称重。检测叶片(Leaf)/茎(Stem)/根(Root)的干重。每种处理下每组植株抽取12个植株的样本，结果取平均值。

钾含量测定方法：Xu J,Tian XL,Eneji A E,Li ZH.2014.Functionalcharacterization of GhAKT1,a novel Shaker-like K

图5的B图为全植株表型照片。图5的C图为植株自下而上叶片的表型照片。在低钾条件下，与阴性对照组植株相比，试验组植株的叶片黄化更为严重。

叶绿素含量、钾离子含量以及干重的结果见图6。在低钾条件下，与阴性对照组(VIGS-Ctrl)植株相比，试验组(VIGS-GhERF9)植株叶片的叶绿素含量更低、地上部干重、各部分钾离子含量更低、叶片重和根重更低。

以上结果表明，试验组植株(VIGS-GhERF9，即GhERF9基因沉默植株)对低钾更为敏感。

四、VIGS-GhERF9沉默植株的根系钾离子吸收速率

VIGS-GhERF9沉默植株、VIGS-GhHAK5沉默植株和对照VIGS-Ctrl，在充足供钾的培养条件下生长至三叶期后，一部分继续正常供钾(CK，2.5mM K

VIGS-GhERF9的棉花幼苗，其K

棉花是重要的经济作物，在国民经济中占有十分重要的地位。但随着转Bt基因抗虫棉的推广普及，以及不合理的肥水运筹，使棉花缺钾现象越来越严重，而棉花又是喜钾的作物，缺钾导致棉花早衰现象越来越严重，严重影响了棉花产量和品质。解决棉花的缺钾问题对于棉花产量的提高和品质的改善具有重要意义。随着分子生物学的不断发展，利用生物技术手段，培育耐低钾棉花品种成为可能。当前棉花的基因克隆工作虽然已经取得了一定的成果，但棉花的基因克隆工作远远落后于水稻、玉米、小麦等粮食作物。病毒诱导的基因沉默(Virus—induced gene silencing，VIGS)作为一种有效的反向遗传学技术广泛的用于植物基因组功能的鉴定，病毒诱导的基因沉默可以在植株的不同部位成功沉默内源基因，为研究不同生长时期的基因功能提供了切实可行的手段。本研究发现并克隆了棉花GhERF9基因，通过VIGS技术在棉花中沉默GhERF9，探究了GhERF9基因的生物学功能，我们目前的工作主要是证实GhERF9对棉花钾转运体GhHAK5的调控作用，解析GhERF9在棉花响应低钾胁迫过程中的调控途径，从分子水平上研究低钾胁迫下基因的表达与调控，完善胁迫条件下信号的传递与基因表达调控网络，更深入的研究植物对低钾胁迫信号的响应机制，为有效提高植物耐低钾胁迫奠定良好的分子基础。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 低钾胁迫响应相关的GhERF9蛋白及其相关生物材料与应用

<130> GNCSY220301

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 222

<212> PRT

<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum)

<400> 1

Met Ala Pro Gln Asp Lys Asn Ala Ser Lys Ile Leu Lys Lys Ala Asn

1 5 10 15

Val Thr Gly Ser Thr Ser Ser Gln Glu Val His Phe Arg Gly Val Arg

20 25 30

Lys Arg Pro Trp Gly Arg Tyr Ala Ala Glu Ile Arg Asp Pro Gly Lys

35 40 45

Lys Ser Arg Val Trp Leu Gly Thr Phe Asp Thr Ala Glu Glu Ala Ala

50 55 60

Arg Ala Tyr Asp Ala Ala Ala Arg Glu Phe Arg Gly Pro Lys Ala Lys

65 70 75 80

Thr Asn Phe Pro Leu Pro Asp Glu Thr Asn Cys Tyr Lys Gly Gln Asn

85 90 95

Gln Gln Ser Pro Ser Gln Ser Ser Thr Val Glu Glu Ser Gly Ser Pro

100 105 110

Thr Val Glu Arg Gly Val Asn Thr Leu Ser Gly Ala Val Gly Arg Phe

115 120 125

Pro Phe Ala Cys His Gln Gln Leu Ala Leu Gly Gly Gly Val Ala Asn

130 135 140

Gly Gly Ile Ser Gly Val Thr Arg Ser Arg Pro Val Leu Phe Phe Glu

145 150 155 160

Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val Val Gly Gln Val Tyr Pro Val Arg Phe

165 170 175

Asp Pro Val Gly Val Gln Leu Gly Met Gly Phe Ala Ser Val Val Arg

180 185 190

Ser Glu Pro Asp Ser Ser Ser Ala Ile His Cys Lys Ala Arg Arg Pro

195 200 205

Gly Leu Ala Leu Asp Leu Asn Leu Pro Pro Pro Val Asp Ala

210 215 220

<210> 2

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctcccc aagacaaaaa tgcgagcaaa atcttgaaga aagctaacgt tactggaagt 60

acgagcagcc aagaggtgca tttcagggga gtaaggaaga ggccatgggg taggtacgct 120

gccgaaatca gagatcccgg caagaaaagc cgtgtttggc ttggtacttt cgatacggct 180

gaggaagctg ccagagccta cgacgcggcg gcgcgtgagt ttcgtggacc taaggctaag 240

accaacttcc ctttaccgga tgaaaccaac tgttacaagg gccagaacca gcagagccct 300

agccaaagca gcacggtgga ggaatctgga agcccaacgg tggagcgtgg agtcaacacc 360

ttgtccgggg cagtagggag attccctttc gcgtgccacc agcagctggc tctgggtggt 420

ggagtcgcta atggtgggat tagcggggtg acccggtcgc ggccggttct atttttcgaa 480

gcgttggggg gagctggcgt tgttggtcag gtttatccgg ttcggttcga tccggtggga 540

gtacagttgg gtatgggatt tgcaagtgta gtccgaagtg aaccggactc ttcatcggcc 600

attcattgca aggcaaggag acctggcctt gccctcgatc ttaaccttcc tcctccagtc 660

gatgcttga 669