酒石酸阿福特罗吸入溶液中非对映异构体的质量控制方法

摘要

本发明提供了一种通过使用基于十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒的色谱柱的高效液相色谱检测来对对酒石酸阿福特罗吸入溶液或者对酒石酸阿福特罗吸入溶液生产工艺进行质量控制的方法。本发明的方法可以实现优异的分离度、高灵敏度和低检测限。本发明的方法对于提高酒石酸阿福特罗吸入溶液产品的质量具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及药物的质量控制方法，具体涉及一种对酒石酸阿福特罗吸入溶液或者对酒石酸阿福特罗吸入溶液生产工艺进行质量控制的方法，更具体地涉及一种通过使用基于十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒的色谱柱的高效液相色谱检测来对酒石酸阿福特罗吸入溶液或者对酒石酸阿福特罗吸入溶液生产工艺进行质量控制的方法。

背景技术

酒石酸阿福特罗是一种针对支气管疾病的药物，其主要是通过作用β2受体，产生强大而持久的平喘作用。

酒石酸阿福特罗吸入溶液在临床上主要用于治疗慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者的支气管痉挛，其活性成分为阿福特罗，其剂型的主要优点包括配方组成简单、起效快、给药剂量小副作用低等。在酒石酸阿福特罗溶液剂型的生产过程中，需要有一种能够对所生产的酒石酸阿福特罗溶液剂型中可能含有的酒石酸阿福特罗非对映异构体杂质进行质量控制的方法。

发明内容

本发明提供的针对酒石酸阿福特罗吸入溶液或者对酒石酸阿福特罗吸入溶液生产工艺进行质量控制的方法通过以下方面或实施方式来体现。

一方面，本发明提供了一种对酒石酸阿福特罗吸入溶液或者对酒石酸阿福特罗吸入溶液生产工艺进行质量控制的方法，其特征在于，所述方法包括采用高效液相色谱法对所述酒石酸阿福特罗吸入溶液中非对映异构体的含量进行测定的步骤，其中所述高效液相色谱法检测条件包括：

-色谱柱：Waters XBridge Peptide BEH 300A C18，规格为4.6×150mm，3.5μm；

-流动相：磷酸盐溶液与乙腈的混合溶液，所述磷酸盐溶液的pH值为11.0～12.0，且所述磷酸盐溶液与所述乙腈的体积比(V/V)为88/12～80/20；优选地，所述磷酸盐溶液与所述乙腈的体积比(V/V)为85/15；

-流动相流速：0.5～1.5ml/min；

-色谱柱柱温：25℃～60℃；

-检测波长：220～230nm；优选地，所述检测波长：225nm；和

-进样量：50μl～100μl。

在一些实施方式中，所述酒石酸阿福特罗吸入溶液中的非对映异构体选自以下至少一种：

在一些实施方式中，所述高效液相色谱法的洗脱方式为等度洗脱。

在一些实施方式中，所述磷酸盐溶液选自由以下一种或多种制备：磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钾、以及它们的水合物；优选地，所述磷酸盐溶液选自由以下一种或多种制备：磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钾、以及它们的水合物；更优选地，所述磷酸盐溶液选自由磷酸钾三水合物制备。

在一些实施方式中，所述高效液相色谱法采用的高效液相色谱仪为安捷伦1260Ⅱ或Waters e2695；和/或所述高效液相色谱法采用的检测器为VWD检测器。

在一些实施方式中，所述方法进一步包括以下步骤中的一种或多种：

(a)配制空白溶液、灵敏度溶液、分离度溶液、对照品溶液和酒石酸阿福特罗吸入溶液的步骤，其中：

-所述空白溶液为枸橼酸及其盐的混合溶液；

-所述对照品溶液通过磷酸盐溶液与乙腈的混合溶液溶解酒石酸阿福特罗对照品，并用所述空白溶液稀释至一定浓度制备；

-所述灵敏度溶液通过所述对照品溶液稀释至一定浓度制备；和

-所述分离度溶液由一定浓度的阿福特罗与非对映异构体的混合溶液制备；

(b)将所述空白溶液、所述灵敏度溶液、所述分离度溶液、所述对照品溶液和所述酒石酸阿福特罗溶液连续顺序进样到色谱仪，采用高效液相色谱法对所述空白溶液、所述灵敏度溶液、所述分离度溶液、所述对照品溶液和所述酒石酸阿福特罗溶液依次进行分析，记录色谱图；

(c)通过外标法(标准曲线法或外标一点法)根据色谱图的峰面积计算所述酒石酸阿福特罗溶液中非对映异构体的含量。

在一些实施方式中，如果所述酒石酸阿福特罗溶液中非对映异构体的含量大于1.0％(即0.075μg/ml或0.075ppm)，则认为所述酒石酸阿福特罗溶液中非对映异构体的含量不符合质量控制标准。

在一些实施方式中，所述方法具有低至0.01％的检测灵敏度(定量限)和低至0.00333％的检测限，以及大于5.0的分离度。

本发明的方法可以满足小规格酒石酸阿福特罗吸入溶液产品的质量控制要求，其具有高灵敏度(灵敏度(定量限)可以达到0.01％(即大于10的信噪比)且低至0.00333％的检测限)，优异的分离度(阿福特罗与杂质I的分离度远大于3.0，这保证了即使在加速稳定性条件测试下，未知峰也不会干扰杂质I的准确定量)，以及优异的准确度、精密度和耐用性(即使使用不同的检测器，即使在色谱条件微小波动或人为因素导致的误差下，对测定结果几乎无影响)。此外，本发明在较低进样量的条件下也能满足实现高检测灵敏度。本发明的方法对于提高酒石酸阿福特罗吸入溶液产品的质量具有重要意义。

附图说明

图1：采用中国药典类似物的检测方法测定酒石酸阿福特罗吸入溶液中的非对映异构体的色谱图；

图2：采用美国药典和欧洲药典类似物的检测方法测定酒石酸阿福特罗吸入溶液中的非对映异构体的色谱图；

图3：采用本发明的方法检测待测溶液(酒石酸阿福特罗吸入溶液)的非对映异构体的色谱图；

图4：采用Waters Xbridge C18 4.6*250mm 5μm色谱柱测定酒石酸阿福特罗吸入溶液(100μl进样量)中的非对映异构体的色谱图；

图5：采用SUPELCO apHera C18 4.6*150mm 5μm色谱柱测定酒石酸阿福特罗吸入溶液(100μl进样量)中的非对映异构体的色谱图；

图6：采用本发明的方法检测空白溶液/空白辅料得到的典型色谱图；

图7：采用本发明的方法检测分离度溶液得到的典型色谱图；

图8：采用本发明方法对定量限溶液检测得到的色谱图；

图9：采用本发明方法对检测限溶液检测得到的色谱图；

图10：采用本发明的方法检测阿福特罗的线性关系图；和

图11：采用本发明的方法检测非对映异构体(杂质I)的线性关系图。

具体实施方式

本发明意在通过酒石酸阿福特罗吸入溶液中非对映异构体的测定来实现针对酒石酸阿福特罗吸入溶液或者对酒石酸阿福特罗吸入溶液生产工艺的质量控制。为实现严格的质量控制要求，本发明的质量控制方法需要解决以下几个问题。

首先，本发明需要解决酒石酸阿福特罗吸入溶液检测中阿福特罗与非对映异构体之间分离度问题。本发明发现，酒石酸阿福特罗吸入溶液在储存期间会产生杂质I，随着杂质I的不断增长，在阿福特罗与杂质I色谱峰之间会出现的新的未知峰(如图3所示)，因此是否可以提供一种具有优异分离度的方法是准确定量测定杂质I含量的关键之一。

进一步，本发明还需要解决小规格酒石酸阿福特罗吸入溶液检测中对于非对映异构体检测的灵敏度问题。本发明发现，对于像酒石酸阿福特罗吸入溶液(2ml：15μg)这种小规格制剂产品，需要提供一种灵敏度最低至少达到0.1％(即0.0075μg/ml或0.0075ppm，对每日最大剂量小于1g的产品中，质量控制中杂质报告限度至少达到0.1％)的检测方法。如果使用目前现有方法在内的检测阿福特罗杂质所用的色谱方法，即使进样量调到最大100μl，也无法满足要求。

此外，本发明也还需要解决酒石酸阿福特罗吸入溶液检测中存在的色谱柱寿命短、重现性差、精密性低、耐受性差等问题。本发明发现，如果使用目前包括药典类似物检测方法在内的方法所常用的色谱柱(例如十八烷基键合聚乙烯醇类色谱柱)，这类色谱柱使用寿命较短，耐受性较差，对于结果的重现性和精密度也难以满足需求。

为此，本发明开发了一种通过使用基于十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒的色谱柱的高效液相色谱检测来对酒石酸阿福特罗吸入溶液或者对酒石酸阿福特罗吸入溶液生产工艺进行质量控制的方法。

一方面，本发明提供了一种对酒石酸阿福特罗吸入溶液或者对酒石酸阿福特罗吸入溶液生产工艺进行质量控制的方法，所述方法采用高效液相色谱法对所述酒石酸阿福特罗吸入溶液中非对映异构体的含量进行测定的步骤。

另一方面，本发明提供了一种检测酒石酸阿福特罗吸入溶液中是否存在杂质方法，其特征在于，所述方法包括采用高效液相色谱法对所述酒石酸阿福特罗吸入溶液中是否存在杂质进行测定的步骤。

又一方面，本发明提供了一种酒石酸阿福特罗溶液中非对映异构体的检测方法，其包括采用高效液相色谱法测定酒石酸阿福特罗溶液中非对映异构体的含量的步骤。

再一方面，本发明提供了一种检测酒石酸阿福特罗吸入溶液中是否存在杂质方法，其包括采用高效液相色谱法对所述酒石酸阿福特罗吸入溶液中是否存在杂质进行测定的步骤。

如本文中所使用的术语“酒石酸阿福特罗(Arformoterol Tartrate)”是一种长效β2-肾上腺素受体激动剂，可用于治疗诸如支气管哮喘、慢性气管炎、喘息型支气管炎、肺气肿等气道阻塞性疾病所引起的呼吸困难的化合物，其CAS编号为201815-49-2。酒石酸阿福特罗的结构式如下：

如本文中所使用的术语“非对映异构体”是指酒石酸阿福特罗的非对映异构体。由于分子有两个手性中心，因此共产生4种光学构型，其中阿福特罗为R,R构型，酒石酸阿福特罗吸入溶液中也存在S,S异构体；另外两种构型，即R,S与S,R构型的两个福莫特罗光学异构体被称为非对映异构体。酒石酸阿福特罗的非对映异构体被认为是杂质。在本文中，术语“酒石酸阿福特罗的非对映异构体”、“非对映异构体”、“非对映异构体杂质”、“酒石酸阿福特罗的杂质”、和“杂质”、“杂质I”具有相同含义，可以互换使用。酒石酸阿福特罗非对映异构体的结构式如下：

在一些实施方式中，所述酒石酸阿福特罗溶液或吸入溶液中的非对映异构体或者杂质选自以下至少一种：

在一些实施方式中，所述酒石酸阿福特罗溶液或吸入溶液中的非对映异构体或者杂质为以下的混合物：

在本文中，术语“酒石酸阿福特罗吸入溶液”是指通过雾化器产生连续共吸入用气溶胶的溶液。例如，酒石酸阿福特罗吸入溶液是通过将酒石酸阿福特罗药液直接倒入雾化杯中，通过雾化器进行雾化吸入的溶液。

如本文中所使用的术语“高效液相色谱法”英文名称为High Performance LiquidChromatography(HPLC)，也被称为“高压液相色谱”、“高速液相色谱”等。高效液相色谱法的原理、操作方法和工艺条件可以参见例如：张旦亚，杨吉兴，高效液相色谱分类及工作原理[J].化工管理，2017(20):113；冷晓晨，张影，胡娟等，实验室高效液相色谱安全使用及注意事项[J].广州化工，2022,50(4):115-117,120.DOI:10.3969/j.issn.1001-9677.2022.04.038；和杨玉娟，高效液相色谱仪的维护及使用注意事项。现代食品,2015(19):66-68.DOI:10.3969/j.issn.1007-3582.2015.19.032。本领域技术人员可以熟练掌握高效液相色谱法的操作和实现色谱分离所需的条件。

色谱柱中的固定相通常由固体填料组成，其通过样品分子与其之间作用力类型以及作用强度的不同，进而实现组分的分离。根据填料不同，色谱柱可以分为：(1).硅胶柱；(2).化学键合固定相的色谱柱；(3).高分子球色谱柱；(4).包覆聚合物的色谱柱；和(5).微粒多孔碳填料的色谱柱，其中化学键合固定相色谱柱又分为非极性键合的色谱柱(十八烷基硅烷键合硅胶为最常用的非极性反相色谱柱)和极性键合的色谱柱(常用的有氨基柱、氰基柱、二醇基柱等)。或者，根据填料不同，色谱柱也可以分为硅胶填料的色谱柱、聚合物填料的色谱柱和其他无机填料的色谱柱，其中硅胶填料主要是以硅胶为基础，表面可以键合各种极性或弱极性官能团(如C18(ODS)、C8、C4、C6H5或正乙烷、氯、二氯甲烷等)，而聚合物填料多为聚本乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等；其他无机填料如石墨化碳填料、氧化铝、氧化锆等。

如本文中所使用的术语“十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒”是一种利用无机、有机杂化颗粒技术，由两种高纯单体合成的高纯硅胶填料，其主要被应用于肽和蛋白质的分析。本发明采用十八烷基键合亚乙基桥杂质颗粒的色谱柱属于在硅胶类色谱柱。

在一些实施方式中，所述高效液相色谱法检测条件包括使用十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒作为色谱柱固定相的填充料。在一些实施方式中，所述采用十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒作为固定相填充料的色谱柱为Waters XBridge Peptide BEH 300A C18，规格为4.6×150mm，3.5μm。

在一些实施方式中，所述高效液相色谱法检测条件包括使用十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒作为色谱柱固定相的填充料。在一些实施方式中，所述采用十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒作为固定相填充料的色谱柱为YMC Triart C18、YMC Triart ExRs C18和Phenomenex Titank C18，规格为4.6×150mm，3.5μm。

在一些实施方式中，采用十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒作为固定相填充料的色谱柱选自以下的一种：Waters XBridge Peptide BEH 300A C18、YMC Triart C18、YMCTriart ExRs C18和Phenomenex Titank C18。在一些实施方式中，所述采用十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒作为固定相填充料的色谱柱具有的规格为4.6×150mm，3.5μm，且所述色谱柱选自以下的一种：Waters XBridge Peptide BEH 300A C18、YMC Triart C18、YMCTriart ExRs C18和Phenomenex Titank C18。

本发明人通过实验证实无论是采用当前中国、美国或欧洲药典中类似物的测试方法(使用十八烷基键合聚乙烯醇色谱柱的HPLC)，还是原料药厂家的测试方法(使用十八烷基键合聚乙烯醇色谱柱的HPLC)，当对酒石酸阿福特罗溶液进行测定时，得到的色谱图均显示出酒石酸阿福特罗主峰与其非对映异构体杂质峰达不到基线分离，无法实现酒石酸阿福特罗溶液中的非对映异构体的准确定量检测。

本发明人推测上述方法均是用于测试酒石酸阿福特罗原料药而不是用于酒石酸阿福特罗吸入溶液中非对映异构体的检测方法。例如，上述方法中大多数是检测酒石酸阿福特罗原料药中非对映异构体的方法，正常进样原料药的供试品浓度为100μg/ml，而对于酒石酸阿福特罗吸入溶液正常进样浓度为7.5μg/ml，两者相差13倍。而且，上述方法中仅可实现对吸入用酒石酸阿福特罗溶液中含50ppm的非对映异构体的检测，但是对比本发明的方法，其可以实现对酒石酸阿福特罗吸入溶液中含0.0075ppm的非对映异构体的检测，两者相差6666倍。

本发明人通过实验意外地发现，当采用通常被用在肽和蛋白质的分析中十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒作为色谱柱固定相的填充料时，HPLC方法可以实现对于阿福特罗溶液中的非对映异构体的检测，而且检测结果显示此方法同时可实现优异的分离度、灵敏度和准确度。本发明的方法的检测灵敏度(定量限)最低可以达到0.01％且检测限可以低至0.00333％；并且在大多数情况下可以实现大于5.0的分离度。

如本文中所使用的术语“检测限”是指分析方法在规定实验条件下所能检出被测组分的最低浓度或最低量。

如本文中所使用的术语“定量限”是指分析方法可定量测定样品中待测组分的最低浓度或最低量。定量限越低，灵敏性越高。

对于酒石酸阿福特罗吸入溶液，尤其是小规格的酒石酸阿福特罗吸入溶液，本发明方法的高灵敏度和低检测限是十分关键的。如本文中所使用的术语“小规格制剂”或“小规格酒石酸阿福特罗吸入溶液”是指含活性药物成分浓度为5μg/ml-15μg/ml的制剂产品。例如，酒石酸阿福特罗吸入溶液的规格为2ml:15μg是一种示例性的小规格制剂，其是指单剂量包装的每支样品为2ml，其中含有15μg的阿福特罗，阿福特罗的浓度为7.5μg/ml。此规格产品可以每日给药两次，因此最大单日摄入量相当于4ml，就是30μg。

此外，在本文中，酒石酸阿福特罗吸入溶液中的活性药物成分是以阿福特罗计算。故在本文中，例如当实施例中提到称取10.8mg的酒石酸阿福特罗(分子量为494.5)对照品，其实际相当于称取了阿福特罗(分子量为344.5))对照品为7.5mg。

在一些实施方式中，所述酒石酸阿福特罗溶液为小规格酒石酸阿福特罗吸入溶液。在一些实施方式中，所述酒石酸阿福特罗吸入溶液为小规格酒石酸阿福特罗吸入溶液。在一些实施方式中，所述酒石酸阿福特罗吸入溶液为具有2ml：15μg规格的酒石酸阿福特罗吸入溶液。在一些实施方式中，所述酒石酸阿福特罗溶液具有的阿福特罗的浓度为5μg/ml-15μg/ml。在一些实施方式中，所述酒石酸阿福特罗吸入溶液具有的阿福特罗的浓度为5μg/ml-15μg/ml。在一些实施方式中，所述酒石酸阿福特罗溶液具有的阿福特罗的浓度为7.5μg/ml。在一些实施方式中，所述酒石酸阿福特罗吸入溶液具有的阿福特罗的浓度为7.5μg/ml。

在一些实施方式中，所述高效液相色谱法检测条件包括使用等度洗脱。

在一些实施方式中，所述高效液相色谱法检测条件包括高效液相色谱仪。在一些实施方式中，高效液相色谱仪选自以下的一种：安捷伦1260Ⅱ、Waters e2695、戴安Ulitimate 3000、岛津LC-2050C/2060C或其他任何同类型的色谱仪。

在一些实施方式中，所述高效液相色谱法检测条件包括使用磷酸盐溶液与乙腈的混合溶液作为流动相。在一些实施方式中，所述磷酸盐溶液的pH值为10.0～12.5。在一些实施方式中，所述磷酸盐溶液的pH值选自以下数值：10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12.0、12.1、12.2、12.3、12.4和12.5。在一些实施方式中，所述磷酸盐溶液的pH值选自由以下任意两个数值组成的范围：10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12.0、12.1、12.2、12.3、12.4和12.5。例如，所述磷酸盐溶液的pH值选自由数值11.0和数值12.0所组成的范围，即所述磷酸盐溶液的pH值为11.0～12.0。本发明人通过实验证明高pH值的流动相会越有利于阿福特罗与杂质I的分离。因此，在一些实施方式中，所述磷酸盐溶液的pH值选自12.0。

在一些实施方式中，所述磷酸盐溶液与所述乙腈的体积比(V/V)为90/10～75/25。在一些实施方式中，所述磷酸盐溶液与所述乙腈的体积比(V/V)选自以下数值：90/10、89/11、88/12、87/13、86/14、85/15、84/16、83/17、82/18、81/19、80/20、79/21、78/22、77/23、76/24和75/25。在一些实施方式中，所述磷酸盐溶液与所述乙腈的体积比(V/V)选自由以下任意两个数值组成的范围：90/10、89/11、88/12、87/13、86/14、85/15、84/16、83/17、82/18、81/19、80/20、79/21、78/22、77/23、76/24和75/25。例如，所述磷酸盐溶液与所述乙腈的体积比(V/V)选自由数值88/12和数值80/20所组成的范围，即所述磷酸盐溶液与所述乙腈的体积比(V/V)为88/12～80/20。在一些实施方式中，所述磷酸盐溶液与所述乙腈的体积比(V/V)为85/15。

在一些实施方式中，所述磷酸盐溶液选自由以下一种或多种制备：磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钾、以及它们的水合物。在一些实施方式中，所述磷酸盐溶液选自由以下一种或多种制备：磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钾、以及它们的水合物。在一些实施方式中，所述磷酸盐溶液选自由磷酸钾三水合物制备。

在一些实施方式中，所述磷酸盐溶液通过以下方法制备：取磷酸钾三水合物5.3g，加水1000ml超声溶解并混合均匀，用氢氧化钾溶液或磷酸调节pH值至12.0±0.1。在一些实施方式中，使用磷酸盐溶液与乙腈的混合溶液作为流动相，所述流动相通过以下方法制备：取磷酸钾三水合物5.3g，加水1000ml超声溶解并混合均匀，用氢氧化钾溶液或磷酸调节pH值至12.0±0.1，随后按照磷酸盐溶液与乙腈的体积比(V/V)为85∶15，混合均匀来配制流动相。

在一些实施方式中，所述高效液相色谱法检测条件包括使用0.5ml/min～1.5ml/min的流动相流速。在一些实施方式中，所述流动相流速选自以下数值：0.5ml/min、0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min、1ml/min、1.1ml/min、1.2ml/min、1.3ml/min、1.4ml/min和1.5ml/min。在一些实施方式中，所述流动相流速选自由以下任意两个数值组成的范围：0.5ml/min、0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min、1ml/min、1.1ml/min、1.2ml/min、1.3ml/min、1.4ml/min和1.5ml/min。例如，所述流动相流速选自由数值0.9ml/min和数值1.1ml/min所组成的范围，即所述流动相流速为0.9ml/min～1.1ml/min。在一些实施方式中，所述流动相流速为1.0ml/min。

在一些实施方式中，所述高效液相色谱法检测条件包括使用25℃～60℃的色谱柱柱温。在一些实施方式中，所述色谱柱柱温为选自以下数值：25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃。在一些实施方式中，所述色谱柱柱温为选自由以下任意两个数值组成的范围：25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃。例如，所述色谱柱柱温选自由数值25℃和数值35℃所组成的范围，即所述色谱柱柱温为25℃～35℃。在一些实施方式中，所述色谱柱柱温为25℃～35℃。在一些实施方式中，所述色谱柱柱温为28℃～33℃。在一些实施方式中，所述色谱柱柱温为30℃。

在一些实施方式中，所述高效液相色谱法检测条件包括使用UV检测器来测定波长。在一些实施方式中，所述检测器选自以下的一种：VWD检测器、DAD检测器、PDA检测器或其他任何同类型的检测器。在一些实施方式中，所述检测器为VWD检测器。

在一些实施方式中，所述高效液相色谱法检测条件包括使用214nm～230nm的检测波长。在一些实施方式中，所述检测波长为选自以下数值：214nm、215nm、216nm、217nm、218nm、219nm、220nm、221nm、222nm、223nm、224nm、225nm、226nm、227nm、228nm、229nm和230nm。在一些实施方式中，所述检测波长为选自由以下任意两个数值组成的范围：214nm、215nm、216nm、217nm、218nm、219nm、220nm、221nm、222nm、223nm、224nm、225nm、226nm、227nm、228nm、229nm和230nm。例如，所述检测波长选自由数值220nm和数值230nm所组成的范围，即检测波长为220nm～230nm。在一些实施方式中，所述检测波长为220nm～230nm。在一些实施方式中，所述检测波长为225nm。

在一些实施方式中，所述高效液相色谱法检测条件包括使用甲醇的水溶液作为洗针水。在一些实施方式中，洗针水使用体积比(V/V)为50:50的水-甲醇配制的溶液。

在一些实施方式中，所述高效液相色谱法检测条件包括使用10μl～100μl进样量。在一些实施方式中，所述进样量为选自以下数值：10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、35μl、40μl、45μl、50μl、55μl、60μl、65μl、70μl、75μl、80μl、85μl、90μl、95μl、和100μl。在一些实施方式中，所述进样量为选自由以下任意两个数值组成的范围：10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、35μl、40μl、45μl、50μl、55μl、60μl、65μl、70μl、75μl、80μl、85μl、90μl、95μl、和100μl。例如，所述进样量选自由数值50μl和数值100μl所组成的范围，即进样量为50μl～100μl。在一些实施方式中，所述进样量为50μl～100μl。在一些实施方式中，所述进样量为100μl。

本发明通过实验证明与采用十八烷基硅烷键合相色谱柱和十八烷基键合聚乙烯醇为填充剂的色谱柱的HPLC方法相比，在同等条件下，本发明的方法可以使用更低的进样量。这提示，本发明采用的十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒色谱柱具有更高的峰响应，致使相同进样量条件下，信噪比更大，灵敏度更高。

在一些实施方式中，所述高效液相色谱法检测条件包括使用以下条件中的一种或多种、或者它们的组合：

-色谱系统：Agilent 1260Ⅱ或Waters e2695或同类型仪器

-色谱柱：十八烷基键合为填充剂的肽分离色谱柱(Waters XBridge Peptide BEH300A C18 4.6mm×150mm,3.5μm)

-流动相：磷酸盐溶液与乙腈的体积比(V/V)为85∶15的混合溶液，等度洗脱

-检测器：UV

-检测波长：225nm

-流速：1.0ml/min

-柱温：30℃

-进样量：100μL

-运行时间：20min

-洗针水：水-甲醇(50:50)。

在一些实施方式中，本发明的酒石酸阿福特罗吸入溶液的质量控制的方法、本发明的酒石酸阿福特罗吸入溶液生产工艺的质量控制的方法、本发明的酒石酸阿福特罗溶液中非对映异构体的检测方法或者本发明的检测酒石酸阿福特罗吸入溶液中是否存在杂质的方法进一步包括其他步骤。

在一些实施方式中，所述其他步骤包括制备空白溶液、灵敏度溶液、分离度溶液、对照品溶液、和/或酒石酸阿福特罗溶液的步骤。在一些实施方式中，所述空白溶液为枸橼酸及其盐的混合溶液。在一些实施方式中，所述对照品溶液通过磷酸盐溶液与乙腈的混合溶液溶解酒石酸阿福特罗对照品，并用空白溶液稀释至一定浓度制备。在一些实施方式中，所述灵敏度溶液通过所述对照品溶液稀释至一定浓度制备。在一些实施方式中，所述分离度溶液由一定浓度的阿福特罗与非对映异构体的混合溶液制备。

在一些实施方式中，所述其他步骤还包括制备稀释剂-1、稀释剂-2、供试品溶液、对照品贮备液、对照品溶液、灵敏度溶液、杂质I贮备液和/或分离度溶液的步骤。这些溶液的配制方法都是本领域已知的。本领域技术人员可以根据HPLC检测的要求来选择配制所需的溶液。

在一些实施方式中，配制稀释剂-1，即磷酸盐缓冲液和乙腈的混合溶液，其中磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比(V/V)为84:16。

在一些实施方式中，配制稀释剂-2(即空白溶液)，即枸橼酸及其盐的混合溶液。

在一些实施方式中，配制对照品贮备液(75μg/mL)，即取酒石酸阿福特罗对照品约10.8mg(约相当于含阿福特罗7.5mg)，精密称定，于100mL容量瓶中，加入适量稀释剂-1溶解。

在一些实施方式中，配制对照品溶液(0.075μg/mL)，即取精密移取0.1mL对照品贮备液于100mL容量瓶中，稀释剂-2定容，摇匀，即得。

在一些实施方式中，配制灵敏度溶液(0.0075μg/mL)，即取5.0mL工作对照品溶液于50mL容量瓶中，稀释剂-2定容，摇匀，即得。

在一些实施方式中，配制杂质I贮备液(37.5μg/mL)，即取杂质I对照品约3.8mg，于100mL容量瓶中，稀释剂(水：乙腈＝90:10)溶解并稀释至刻度。

在一些实施方式中，配制分离度溶液(阿福特罗:7.5μg/mL；杂质I:0.075μg/mL)即分别取0.5mL杂质I贮备液及10mL对照品贮备液于100mL容量瓶中，稀释剂-2定容，摇匀，即得。

在一些实施方式中，所述其他步骤包括将选自以下的一种或多种溶液进样至高效液相色谱仪的步骤：空白溶液、灵敏度溶液、分离度溶液、对照品溶液、和/或待测试的酒石酸阿福特罗溶液。

在一些实施方式中，所述其他步骤包括将以下溶液依次进样至高效液相色谱仪的步骤：空白溶液、灵敏度溶液、分离度溶液、对照品溶液、待测试的酒石酸阿福特罗溶液和对照品溶液。

在一些实施方式中，所述其他步骤包括将选自以下的溶液按照以下顺序和次数进样至高效液相色谱仪的步骤：(1)空白溶液(进样次数≥1针)、(2)灵敏度溶液(进样次数≥1针)、(3)分离度溶液(进样次数≥1针)、(4)对照品溶液(进样次数≥6针)、(5)供试品溶液(即待测试的酒石酸阿福特罗溶液；进样次数≥1针；供试品溶液进6针需进一针随行对照品溶液)、和(6)随行对照品溶液(进样次数≥1针)。

在一些实施方式中，所述其他步骤包括记录色谱图的步骤。

在一些实施方式中，所述其他步骤包括判断是否酒石酸阿福特罗吸入溶液的色谱图中有非对映异构体的色谱峰的步骤。在一些实施方式中，如果酒石酸阿福特罗吸入溶液的色谱图中有非对映异构体的色谱峰，则确定酒石酸阿福特罗吸入溶液中包含作为杂质的非对映异构体。

在一些实施方式中，所述其他步骤进一步包括测定所述酒石酸阿福特罗吸入溶液中杂质含量的步骤：当确定所述酒石酸阿福特罗吸入溶液的色谱图中有非对映异构体的色谱峰，通过外标法(外标一点法)测定杂质I的含量；或通过标准曲线法，计算出杂质I的含量。

在一些实施方式中，所述其他步骤进一步包括通过以下方法计算所述酒石酸阿福特罗溶液中非对映异构体的含量。在一个实施方式中，可以使用例如药典中公开的以下公式计算酒石酸阿福特罗溶液中非对映异构体的含量。

其中，A

在一些实施方式中，如果酒石酸阿福特罗吸入溶液中的杂质I含量大于1.0％(即0.075μg/ml或0.075ppm)，则认为酒石酸阿福特罗吸入溶液中的杂质I不符合质量控制标准。在一些实施方式中，如果酒石酸阿福特罗吸入溶液的色谱图有与分离度溶液中已知杂质I保留时间一致的色谱峰，按不加校正因子的外标法计算，应不得大于1.0％(即0.075μg/ml或0.075ppm)；否则被认为酒石酸阿福特罗吸入溶液中的杂质I含量超过质量控制要求。质量控制标准可以由本领域技术人员依据不同情况具体制定。可发明的方法可以用于执行高标准的质量控制标准。

在一些实施方式中，本发明提供了一种对酒石酸阿福特罗吸入溶液或者对酒石酸阿福特罗吸入溶液生产工艺进行质量控制的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)配制空白溶液、灵敏度溶液、分离度溶液、对照品溶液、和酒石酸阿福特罗溶液的步骤，其中：

-所述空白溶液为枸橼酸及其盐的混合溶液；

-所述对照品溶液通过磷酸盐溶液与乙腈的混合溶液溶解酒石酸阿福特罗对照品，并用所述空白溶液稀释至一定浓度制备；

-所述灵敏度溶液通过所述对照品溶液稀释至一定浓度制备；和

-所述分离度溶液由一定浓度的阿福特罗与非对映异构体的混合溶液制备；

(b)将所述空白溶液、所述灵敏度溶液、所述分离度溶液、所述对照品溶液和所述酒石酸阿福特罗溶液连续顺序进样到色谱仪，采用高效液相色谱法对所述空白溶液、所述灵敏度溶液、所述分离度溶液、所述对照品溶液和所述酒石酸阿福特罗溶液依次进行分析，记录色谱图，

其中所述高效液相色谱法检测条件包括：

-色谱柱固定相的填充料：十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒；

-流动相：磷酸盐溶液与乙腈的混合溶液，所述磷酸盐溶液的pH值为12.0，且所述磷酸盐溶液与所述乙腈的体积比(V/V)为88/12～85/15；

-流动相流速：0.9～1.1ml/min；

-色谱柱柱温：25℃～35℃；

-检测波长：25℃～35℃；和

-进样量：50μl～100μl；

(c)通过外标一点法根据色谱图的峰面积计算所述酒石酸阿福特罗溶液中非对映异构体的含量；

(d)如果酒石酸阿福特罗吸入溶液中的非对映异构体含量大于1.0％(即0.075μg/ml或0.075ppm)，则认为酒石酸阿福特罗吸入溶液中的非对映异构体I不符合质量控制标准；

其中所述酒石酸阿福特罗溶液中的非对映异构体为以下的混合物：

在一些实施方式中，本发明的方法的检测灵敏度(定量限)低至0.1％且检测限低至0.0333％。在一些实施方式中，本发明的方法的检测灵敏度(定量限)低至0.01％且检测限低至0.00333％。在一些实施方式中，本发明的方法的分离度大于3.0。在一些实施方式中，本发明的方法的分离度大于4.0。在一些实施方式中，本发明的方法的分离度大于5.0。

本发明利用基于十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒的HPLC技术建立了一种能准确定量检测酒石酸阿福特罗吸入溶液中非对映异构体的高效液相色谱检测方法。本发明一系列实验证明该方法具有分离度好，灵敏度高，检测限低，专属性好，准确度高，精密度高，耐用性强等众多优点，适合酒石酸阿福特罗吸入溶液中非对映异构体的检测及质量控制。本发明的方法为合理的质量标准制定提供依据，以便更好控制和掌握产品质量，确保临床用药的安全性。

实施例

下面的实施例仅用于进一步说明本发明但并不将本发明的范围限制于这些实施例。

实验材料和试剂：

实施例

下面的实施例仅用于进一步说明本发明但并不将本发明的范围限制于这些实施例。

实验材料和试剂：

用于本发明的原料和试剂可以通过商购渠道获得或者由相关技术人员配制获得。此外，除非有特别说明或描述，本发明实施例中提及的相同名称的实验材料和试剂具体如下所述：

-磷酸盐缓冲液(流动相一部分)：取磷酸钾三水合物5.3g，加水1000ml超声溶解并混合均匀，用氢氧化钾溶液或磷酸试液调节pH值至12.0±0.1)。

-稀释剂-1：磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠一水合物6.10g与磷酸氢二钠二水合物1.03g，加水1000ml溶解，用磷酸或氢氧化钠试液调节pH值至6.0±0.1)-乙腈(84:16)。

-稀释剂-2(空白溶液)：酒石酸阿福特罗吸入溶液的空白辅料溶液(枸橼酸及其盐的混合溶液，经超声溶解，混匀，过滤配制)。

-灵敏度溶液：精密量取对照品溶液5.0ml于50ml容量瓶中，加稀释剂-2稀释至刻度，摇匀，即得0.0075μg/ml的灵敏度溶液。

-分离度溶液：取酒石酸阿福特罗对照品贮备液及杂质I贮备液各适量，置于同一容量瓶中，用稀释剂-2稀释，配制成分别含阿福特罗为7.5μg/ml，杂质I为0.075μg/ml的混合溶液。

-对照品溶液：精密量取适量对照品贮备液于容量瓶中，加稀释剂-2，配制成约含阿福特罗为0.075μg/ml的对照品溶液。

-杂质I定位溶液：取杂质I贮备液适量于容量瓶中，加稀释剂-2定容，配制成0.075μg/ml的定位溶液。

-待检测溶液(酒石酸阿福特罗吸入溶液)：市售包装酒石酸阿福特罗吸入溶液(SUNOVION)，5支/袋，取出内容物混合均匀，配制为待测试的溶液。

-对照品贮备溶液：取酒石酸阿福特罗对照品(Standardpharm Co.,Ltd.)适量，精密称定，于容量瓶中，加稀释剂-1溶解，配制成阿福特罗浓度为75μg/ml的贮备溶液。

-杂质I贮备液：称取杂质I对照品(Standardpharm Co.,Ltd.)适量于容量瓶中，加水：乙腈＝90:10溶解并稀释至刻度，配制成37.5μg/ml的杂质I贮备溶液。

实施例1-通过药典检测类似药物的方法检测酒石酸阿福特罗吸入溶液中的非对映异构体

在对市售包装的酒石酸阿福特罗吸入溶液产品的稳定性考察过程中，发现在一段时间内(加速条件-25℃/60％RH)产品中的非对映异构体(杂质I)有增长趋势(零点-未检出杂质；1个月-杂质I含量为0.21％；2个月为0.39％；3个月为0.48％)。为了对酒石酸阿福特罗吸入溶液产品的生产工艺，尤其是终产品中的杂质含量进行质量检测，尤其是规格为2ml：15μg的酒石酸阿福特罗吸入溶液产品的检测需求(至少要达到0.1％浓度(0.0075μg/ml)的灵敏度要求)，首先采用药典中检测类似药物的方法对酒石酸阿福特罗吸入溶液中的非对映异构体进行了测定。酒石酸阿福特罗原料药厂家(MSN)所公开的非对映异构体(杂质I)的检测方法与美国和欧洲药典中类似物记载的检测方法基本一致，因此对原料药厂家的检测方法不再重复测试。

因此，本实验目的是为了测试已在中国、美国和欧洲药典中记载的类似药物检测方法是否可用于酒石酸阿福特罗吸入溶液中的非对映异构体(杂质I)的检测。

测试方法、条件和试剂如下：

中国药典类似物的检测方法：

-HPLC方法，十八烷基键合聚乙烯醇色谱柱(Shodex Asahipak ODP-50 4E，4.6*250mm，5μm)；

-流动相pH12.0±0.1磷酸盐溶液：乙腈＝88:12(v/v)等度洗脱；

-流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：225nm；进样量：100μl；运行时间：35min。

美国和欧洲药典类似物的检测方法：

-HPLC方法，十八烷基键合聚乙烯醇色谱柱(Shodex Asahipak ODP-50 4D，4.6*150mm，5μm)；

-流动相pH12.0±0.1磷酸盐溶液：乙腈＝88:12(v/v)等度洗脱；

-流速：0.5ml/min；柱温：30℃；检测波长：225nm；进样量：100μl；运行时间：35min。

检测溶液：

-分离度溶液，即取阿福特罗浓度为7.5μg/ml，杂质I浓度为0.075μg/ml的混合溶液，进样分析。

检测结果如下表1所示

表1

基于上述实验可知，当前中国以及美国和欧洲药典中类似药物的测试方法均显示出阿福特罗主峰与其非对映异构体杂质峰达不到基线分离，无法实现对于酒石酸阿福特罗吸入溶液中的非对映异构体的检测，更达不到对于小剂量酒石酸阿福特罗吸入溶液(如最大日摄入量(30μg)的吸入溶液)产品的检测需求。

实施例2-基于十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒为固定相的HPLC方法对酒石酸阿福特罗吸入溶液中的非对映异构体的检测

为了开发出一种具有高灵敏度、高分离度，能够满足最大日摄入量(30μg)的酒石酸阿福特罗吸入溶液产品的检测方法，本实验测试了采用十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒作为色谱柱固定相填充料的HPLC方法是否可用于酒石酸阿福特罗吸入溶液中的非对映异构体(杂质I)的检测的效果。

测试方法、条件和试剂如下：

-HPLC方法，十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒色谱柱(Waters XBridge PeptideBEH 300A C18，4.6*150mm，3.5μm)，安捷伦1260Ⅱ(VWD检测器)高效液相色谱仪；

-流动相pH12.0±0.1磷酸盐溶液：乙腈＝85∶15(v/v)等度洗脱；

-流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：225nm；进样量：100μl；运行时间为20min。

-待检测溶液，酒石酸阿福特罗吸入溶液(SUNOVION)加速条件3个月样品，共三个批次(批号：S20C005、S20G005和S20G008)，取出内容物混合均匀配制为待测试的溶液。

分别取空白溶液、灵敏度溶液、分离度溶液、对照品溶液及各待检测溶液，进样分析，记录色谱图。进样的过程如下：(1)空白溶液(进样次数≥1针)、(2)灵敏度溶液(进样次数为1针)、(3)分离度溶液(进样次数为1针)、(4)对照品溶液(进样次数为6针)、(5)供试品溶液(即待测试的酒石酸阿福特罗溶液；进样次数≥1针；供试品溶液进6针需进一针随行对照品溶液)、和(6)随行对照品溶液(进样次数≥1针)。

随后，按外标法(外标一点法，参见2020版中国药典通则0512)以峰面积计算供试品溶液中杂质I的含量。

图3示出了采用本发明的方法检测待测溶液(酒石酸阿福特罗吸入溶液)的非对映异构体的色谱图。

三批待检测溶液中杂质I检测结果见表2。

表2酒石酸阿福特罗吸入溶液中非对映异构体含量

从图3可以看出，采用十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒作为色谱柱固定相填充料的HPLC方法，即使阿福特罗与杂质I之间有新的未知峰出现，因阿福特罗与杂质I的分离度优异，也不会干扰杂质I的定量检测；从表2结果可知，该方法能够准确用于酒石酸阿福特罗吸入溶液中的非对映异构体(杂质I)的检测。

实施例3-酒石酸阿福特罗吸入溶液中的非对映异构体检测方法系统适用性试验

本实验的一个目的是测定本发明采用的十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒作为固定相的色谱柱(Waters XBridge Peptide BEH 300A C18，4.6*150mm，3.5μm)对于酒石酸阿福特罗吸入溶液中的非对映异构体检测方法系统适用性。

本实验的另一个目的是考察本发明采用的十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒作为固定相的色谱柱(Waters XBridge Peptide BEH 300A C18，4.6*150mm，3.5μm)与采用其他色谱柱(即采用十八烷基硅烷键合相色谱柱和十八烷基键合聚乙烯醇色谱柱)在分离度和灵敏度上是否存在差异。在此实验中，分别采用灵敏度溶液及分离度溶液用于上述考察三种方法。

本发明方法的测定条件：

-HPLC方法，十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒色谱柱(Waters XBridge PeptideBEH 300A C18，4.6*150mm，3.5μm)，Waters e2695(PDA检测器)高效液相色谱仪；

-流动相pH12.0±0.1磷酸盐溶液：乙腈＝85∶15(v/v)等度洗脱；

-流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：225nm；进样量：100μl；运行时间为20min。

对比方法1的测定条件：

-HPLC方法，十八烷基硅烷键合相色谱柱(Waters Xbridge C18(4.6*250mm，5μm)，Waters e2695(PDA检测器)高效液相色谱仪；

-流动相：A液为用磷酸调节pH为8.5的四丁基氢氧化胺水溶液(0.6％，v/v)，B液为乙腈，A液:B液＝80:20(v/v)等度洗脱；

-流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：225nm；进样量：50μl；运行时间为30min。

对比方法2的测定条件：

-HPLC方法，十八烷基键合聚乙烯醇为填充剂的色谱柱(SUPELCO apHera C18Polymer(4.6*150mm，5μm)，Waters e2695(PDA检测器)高效液相色谱仪；

-流动相A：pH12.0±0.1磷酸盐溶液：乙腈＝85:15(v/v)；流动相B：水：乙腈＝15:85(v/v)梯度洗脱

-流速：1.0ml/min；柱温：40℃；检测波长：225nm；进样量：20μl；运行时间为55.1min。

-梯度洗脱程序：

分别取空白溶液、灵敏度溶液、分离度溶液各进样一针，对照品溶液平行进样6针，考察系统适用性。

以上各方法灵敏度及分离度效果对比结果如表3所示：

检测结果如下表3所示

系统适用性要求：空白溶液应无干扰，灵敏度溶液中阿福特罗信噪比应不小于10；分离度溶液中阿福特罗与杂质I的分离度应不小于3.0；重复进样6针对照品溶液中阿福特罗峰面积的RSD应不大于2.0％，采用本发明方法进样重复结果如下表4所示。

表4对照品溶液峰面积系统适用性结果

根据结果显示，在20μl-100μl的进样量范围内，采用的十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒作为固定相的色谱柱均可以实现对阿福特罗与杂质I的有效分离。相对地，对于采用十八烷基硅烷键合相色谱柱和十八烷基键合聚乙烯醇色谱柱的检测方法，在同样20μl或50μl的进样量范围下则无法实现对阿福特罗与杂质I的有效分离；而且，当增加进样量(100μl)后，依旧无法实现阿福特罗和杂质I的分离，无法满足检测对于分离度和灵敏度的要求。此结果显示，相同进样量条件下本发明的方法(采用的十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒作为固定相的色谱柱(Waters XBridge Peptide BEH 300A C18，4.6*150mm，3.5μm))具有灵敏度高，分离度好的优点。相对地，对于采用十八烷基硅烷键合相色谱柱和十八烷基键合聚乙烯醇色谱柱的检测方法，在基本相同的测定条件下，无法实现酒石酸阿福特罗吸入溶液(2ml：15μg)中非对映异构体的检测。

实施例4-基于十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒为固定相的HPLC方法的专属性试验

本实验目的是为了考察在其他成分(如空白稀释剂、辅料、杂质等)可能存在下，采用的十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒作为色谱柱固定相(Waters XBridge Peptide BEH300AC18，4.6*150mm，3.5μm)的HPLC方法能正确测定出被测物(杂质I)的能力。

本实验的色谱条件同实施例2。

取空白溶液/空白辅料溶液、对照品溶液、杂质I定位溶液、分离度溶液及供试品溶液，按上述色谱条件进样分析，记录色谱图。图6示出了采用本发明的方法检测空白溶液/空白辅料得到的典型色谱图。如图6所示，空白溶液/空白辅料在阿福特罗或杂质I出峰位置无干扰。图7示出了采用本发明的方法检测分离度溶液得到的典型色谱图。如图7所示，分离度溶液中阿福特罗与杂质I的分离度为5.3，结果表明专属性优异。

实施例5：定量限与检测限试验

本实验目的是通过采用十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒作为固定相色谱柱(Waters XBridge Peptide BEH 300A C18，4.6*150mm，3.5μm)的HPLC分析方法能准确测定出供试品中杂质I能被定量测定的最低量(定量限)和能被检测出的最低量(检测限)。

色谱条件同实施例2。

杂质I贮备液：取杂质I对照品约7.5mg，精密称定，于100ml容量瓶中，加稀释剂(水：乙腈＝90:10)溶解并稀释至刻度，配制成75μg/ml的贮备溶液。

对照品贮备液：取酒石酸阿福特罗对照品约10.8mg(约相当于含阿福特罗为7.5mg)，于100ml容量瓶中，加稀释剂-1溶解，配制成75μg/ml的贮备溶液。

LOQ(定量限)溶液(相当于产品浓度的0.1％)：分别精密移取1.0mL杂质I贮备液及1.0mL阿福特罗对照品贮备液于100mL容量瓶中，用稀释剂-2定容，摇匀，再精密移取上述溶液1.0ml于100ml容量瓶中，用稀释剂-2定容，摇匀。

LOD(检测限)溶液(相当于产品浓度的0.0333％)：将定量限溶液稀释3倍作为检测限溶液

取上述溶液分别进样，定量限溶液平行进样6针信噪比(S/N)均应大于10，峰面积的RSD应不大于5.0％；检测限溶液的信噪比(S/N)均应不小于3。图8和图9分别示出了采用本发明方法对定量限溶液检测得到的色谱图和采用本发明方法对检测限溶液检测得到的色谱图。结果如下表：

表5定量限考察结果

表6检测限考察结果

结果显示：在供试品浓度0.1％(酒石酸阿福特罗吸入溶液2ml：15μg产品的报告限为0.1％)的定量限浓度水平下信噪比均远大于10；在供试品浓度的0.0333％的检测限下信噪比均大于3，表明该方法能够准确定量检测酒石酸阿福特罗吸入溶液中杂质I的含量。此结果是十分令人满意地，如果以可接受的信噪比10为基础，可以推算出最低定量限可以达到0.01％，相应地可以推算出最低检测限可以达到0.00333％。

实施例6：线性和范围试验

本实验目的是为了考察采用十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒作为固定相色谱柱(Waters XBridge Peptide BEH 300A C18，4.6*150mm，3.5μm)的HPLC方法在设计的范围内(LOQ-3.0％)，被测物峰面积与浓度呈比例关系的能力，以及通过外标法计算杂质I含量的准确性。

色谱条件同实施例2。

线性贮备液：分别精密移取1.0mL杂质I贮备液(75μg/ml)及1.0mL对照品贮备液(75μg/ml)于100mL容量瓶中，用稀释剂-2定容，摇匀，即得0.75μg/ml的混合溶液。

线性溶液：按下表分别移取适量体积线性贮备液于10ml容量瓶中，稀释剂-2定容，摇匀。

表7线性溶液的配制方法

取上述溶液分别进样并记录色谱图，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作线性回收，要求相关系数应不小于0.990；y轴截距应目标浓度的25％以内；残差应不大于10％。结果如下表：

表8酒石酸阿福特罗吸入溶液线性考察结果

图10示出了采用本发明的方法检测酒石酸阿福特罗吸入溶液的线性关系图，结果显示阿福特罗在0.0075μg/ml(LOQ)～0.225μg/ml浓度范围内，线性关系良好。

图11示出了采用本发明的方法检测酒石酸阿福特罗吸入溶液的非对映异构体(杂质I)的线性关系图，结果显示杂质I在0.0075μg/ml(LOQ)～0.225μg/ml浓度范围内，线性关系良好。

实施例7：准确度试验

本实验目的是为了考察采用十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒作为色谱柱(WatersXBridge Peptide BEH 300A C18，4.6*150mm，3.5μm)的HPLC方法在测定含有辅料的样品溶液中添加不同已知浓度的杂质I溶液，已考察添加的杂质I能否完全提取，并考察测定结果与真实值接近程度，一般用回收率表示。

色谱条件同实施例2。

杂质I贮备液：精密移取1.0ml杂质I贮备液(75μg/ml)于100mL容量瓶中，稀释剂-2定容，摇匀，即得0.75μg/ml的贮备液。

R0供试品溶液：取足够量的样品内容物溶液于同一试剂瓶中混合均匀，即得。

R1准确度溶液(LOQ-0.1％)：精密移取0.1ml上述杂质I贮备液于10mL容量瓶中，用R0样品溶液定容，摇匀，平行制备三份。

R2准确度溶液(1.0％)：精密移取1.0ml上述杂质I贮备液于10mL容量瓶中，用R0样品溶液定容，摇匀，平行制备三份。

R3准确度溶液(2.0％)：精密移取2.0ml上述杂质I贮备液于10mL容量瓶中，用R0样品溶液定容，摇匀，平行制备三份。

分别取上述各溶液进样分析并记录色谱图，按外标法以峰面积计算杂质I回收率，结果如下表：

表9酒石酸阿福特罗吸入溶液中杂质I准确度结果

结果表明：杂质I在各浓度水平下各样品回收率及平均回收率均在90％～110％之间，9份回收率的RSD小于10％，说明本法的准确度良好，样品溶液中的杂质I能被完全提取，且准确定量。

实施例8：精密度试验

本实验目的是为了测试采用十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒作为固定相的色谱柱(Waters XBridge Peptide BEH 300A C18，4.6*150mm，3.5μm)，在一定条件下进行多次取样测定所得结果之间的接近程度。

1.1重复性试验

色谱条件同实施例2。

由同一分析员，精密移取1.0mL杂质I贮备液(0.75μg/mL)于10mL容量瓶中，用样品溶液(酒石酸阿福特罗吸入溶液)定容，摇匀，作为供试品溶液，平行配制6份；分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各100μl，进样分析，记录色谱图，按外标法以峰面积计算杂质I的含量，结果见下表。

表10重复性结果

结果显示：由同一分析员，平行配制的6份样品溶液中检测出杂质I含量％的RSD小于10％，说明本法重复性良好。

1.2中间精密度试验

除HPLC外其他色谱条件同实施例2。

由另一名分析人员独立建立系统，取与重复性样品同一批号的样品溶液，同法配制6份相同浓度的供试品溶液，使用不同的仪器于不同天进行测定，结果见下表。

表11酒石酸阿福特罗吸入溶液精密度结果

结果显示：中间精密度与重复性共12份样品溶液中检测出杂质I含量％的RSD小于15％，这表明说明不同人员、不同仪器设备对本法测定结果影响较小，本法精密度良好。

实施例9：供试品及对照品溶液稳定性试验

本实验目的是为考察待测溶液及对照品溶液配制完成后，在室温及2-8度条件的稳定性，以支持在测试过程中数据的准确可靠性。

色谱条件同实施例2。

取酒石酸阿福特罗吸入溶液样品溶液置于室温及2-8度条件下分别于零天、1天、2天进行测样，考察供试品溶液稳定性；取0.075μg/ml阿福特罗对照品溶液于相同条件和时间点考察对照品溶液稳定性，结果如下表。

表12酒石酸阿福特罗吸入溶液考察溶液稳定性结果

结果表明：对照品溶液及供试品溶液在2-8度或室温条件下放置2天内稳定。

实施例10：耐用性试验

本实验的目的是通过考察色谱条件的流速、流动相的pH、流动相的比例、相同品牌不同批号色谱柱、相同填料不同品牌色谱柱等条件变动，找到最优的色谱参数及确定目标参数微小变动后对结果不受影响的承受程度。具体考察项目如下表所示。

表13.耐用性考察项目

其他色谱条件同实施例2。测定结果参见下表

表14耐用性考察结果

结果表明：流速、流动相pH及流动相比例在上述测试范围内变动时，杂质I测定结果基本一致，说明本法耐用性良好。同时，十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒色谱柱是本发明的方法是否可以实现所期望的检测要求的关键，不同品牌、但均属于十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒作为色谱柱固定相的填充料的色谱柱均具有类似的检测效果。此外，相同填料不同品牌色谱柱也具有较好的耐用性。

实施例11：色谱条件参考筛选试验

本实验的目的是通过考察关键色谱参数，如流动相的pH、流动相的比例，找到最优的色谱参数后对灵敏度和分离度不受影响的承受程度。具体考察项目如下表所示。

表15.最优参数筛选结果

结果表明：本发明的方法可以适应不同的色谱条件。结果证明在pH11-12及流动相比例80/20-88/12条件下，本发明的方法均可以达到灵敏度和分离度的要求。

技术方案集合

技术方案组A：

1.一种检测酒石酸阿福特罗吸入溶液中是否存在杂质方法，其特征在于，所述方法包括采用高效液相色谱法对所述酒石酸阿福特罗吸入溶液中是否存在杂质进行测定的步骤，

其中所述杂质包括选自以下至少一种的酒石酸阿福特罗吸入溶液中的非对映异构体：

其中所述高效液相色谱法采用十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒作为固定相填充料的色谱柱；优选地，所述高效液相色谱法采用的色谱柱为Waters XBridge Peptide BEH300A C18，规格为4.6×150mm，3.5μm；且

选择适合的高效液相色谱法检测条件使得所述高效液相色谱法具有低至0.01％的检测灵敏度(最低定量限)和低至0.00333％的最低检测限，以及大于5.0的分离度。

2.根据技术方案1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法检测条件包括：

-流动相：磷酸盐溶液与乙腈的混合溶液，所述磷酸盐溶液的pH值为10.0～12.5，且所述磷酸盐溶液与所述乙腈的体积比(V/V)为90/10～75/25；

-流动相流速：0.5～1.5ml/min；

-色谱柱柱温：25℃～60℃；

-检测波长：214～230nm；和

-进样量：10μl～100μl。

3.根据技术方案1或2所述的检测方法，其特征在于，所述磷酸盐溶液的pH值为11.0～12.0；优选地，所述磷酸盐溶液的pH值为11.0～12.0；和/或

所述磷酸盐溶液选自由以下一种或多种制备：磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钾、以及它们的水合物；优选地，所述磷酸盐溶液选自由以下一种或多种制备：磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钾、以及它们的水合物；更优选地，所述磷酸盐溶液选自由磷酸钾三水合物制备；和/或

所述磷酸盐溶液与所述乙腈的体积比(V/V)为88/12～80/20；优选地，所述磷酸盐溶液与所述乙腈的体积比(V/V)为85/15；和/或

所述流动相流速：0.8～1.2ml/min；优选地，所述流动相流速：0.9～1.1ml/min；更优选地，所述流动相流速：1.0ml/min；和/或

所述色谱柱柱温：25℃～40℃；优选地，所述色谱柱柱温：25℃～35℃；更优选地，所述色谱柱柱温：30℃；和/或

所述检测波长：220～230nm；优选地，所述检测波长：225nm；和/或

所述进样量：20μl～110μl；优选地，所述进样量：50μl～100μl；更优选地，所述进样量：100μl。

4.根据技术方案1-3中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述采用十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒作为固定相填充料的色谱柱选自以下的一种：Waters XBridgePeptide BEH 300A C18、YMC Triart C18、YMC Triart ExRs C18和Phenomenex TitankC18；

优选地，所述采用十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒作为固定相填充料的色谱柱具有的规格为4.6×150mm，3.5μm，且所述色谱柱选自以下的一种：Waters XBridge PeptideBEH 300A C18、YMC Triart C18、YMC Triart ExRs C18和Phenomenex Titank C18；

更优选地，所述采用十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒作为固定相填充料的色谱柱为Waters XBridge Peptide BEH 300A C18，规格为4.6×150mm，3.5μm。

5.根据技术方案1-4中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的洗脱方式为等度洗脱。

6.根据技术方案1-5中任一项所述的检测方法，其特征在于，

所述高效液相色谱法采用的高效液相色谱仪选自以下的一种：安捷伦1260Ⅱ、Waters e2695、戴安Ulitimate 3000、岛津LC-2050C/2060C或其他任何同类型的色谱仪；和/或

所述高效液相色谱法采用的检测器选自以下的一种：VWD检测器、DAD检测器、PDA检测器或其他任何同类型的检测器。

7.根据技术方案1-6中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述方法进一步包括以下步骤中的一种或多种：

(a)配制空白溶液、灵敏度溶液、分离度溶液、对照品溶液和酒石酸阿福特罗溶液的步骤，其中：

-所述空白溶液为枸橼酸及其盐的混合溶液；

-所述对照品溶液通过磷酸盐溶液与乙腈的混合溶液溶解酒石酸阿福特罗对照品，并用所述空白溶液稀释至一定浓度制备；

-所述灵敏度溶液通过所述对照品溶液稀释至一定浓度制备；和

-所述分离度溶液由一定浓度的阿福特罗与非对映异构体的混合溶液制备；

(b)将所述空白溶液、所述灵敏度溶液、所述分离度溶液、所述对照品溶液和所述酒石酸阿福特罗溶液连续顺序进样到色谱仪，采用高效液相色谱法对所述空白溶液、所述灵敏度溶液、所述分离度溶液、所述对照品溶液和所述酒石酸阿福特罗溶液依次进行分析，记录色谱图；

(c)如果酒石酸阿福特罗吸入溶液的色谱图中有非对映异构体的色谱峰，则确定酒石酸阿福特罗吸入溶液中包含作为杂质的非对映异构体。

8.根据技术方案1-7中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述方法进一步包括测定所述酒石酸阿福特罗吸入溶液中杂质含量的步骤，包括确定所述酒石酸阿福特罗吸入溶液的色谱图中有非对映异构体的色谱峰，根据色谱图的峰面积计算所述酒石酸阿福特罗溶液中非对映异构体的含量的步骤；优选地，包括当确定所述酒石酸阿福特罗吸入溶液的色谱图中有非对映异构体的色谱峰，通过外标法(标准曲线法或外标一点法)根据色谱图的峰面积计算所述酒石酸阿福特罗吸入溶液中非对映异构体的含量的步骤。

技术方案组B：

1.一种酒石酸阿福特罗溶液中非对映异构体的检测方法，其特征在于，所述方法包括采用高效液相色谱法对酒石酸阿福特罗溶液进行分析，根据色谱图的峰面积计算所述酒石酸阿福特罗溶液中非对映异构体的含量的步骤，其中所述高效液相色谱法检测条件包括：

-色谱柱固定相的填充料：十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒；

-流动相：磷酸盐溶液与乙腈的混合溶液，所述磷酸盐溶液的pH值为10.0～12.5，且所述磷酸盐溶液与所述乙腈的体积比(V/V)为90/10～75/25；

-流动相流速：0.5～1.5ml/min；

-色谱柱柱温：25℃～60℃；

-检测波长：214～230nm；和

-进样量：10μl～100μl。

2.根据技术方案1所述的检测方法，其特征在于，所述磷酸盐溶液的pH值为11.0～12.0；优选地，所述磷酸盐溶液的pH值为11.0～12.0；和/或

所述磷酸盐溶液选自由以下一种或多种制备：磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钾、以及它们的水合物；优选地，所述磷酸盐溶液选自由以下一种或多种制备：磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钾、以及它们的水合物；更优选地，所述磷酸盐溶液选自由磷酸钾三水合物制备；和/或

所述磷酸盐溶液与所述乙腈的体积比(V/V)为88/12～80/20；优选地，所述磷酸盐溶液与所述乙腈的体积比(V/V)为85/15；和/或

所述流动相流速：0.8～1.2ml/min；优选地，所述流动相流速：0.9～1.1ml/min；更优选地，所述流动相流速：1.0ml/min；和/或

所述色谱柱柱温：25℃～40℃；优选地，所述色谱柱柱温：25℃～35℃；更优选地，所述色谱柱柱温：30℃；和/或

所述检测波长：220～230nm；优选地，所述检测波长：225nm；和/或

所述进样量：20μl～110μl；优选地，所述进样量：50μl～100μl；更优选地，所述进样量：100μl。

3.根据技术方案1或2所述的检测方法，其特征在于，所述采用十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒作为固定相填充料的色谱柱选自以下的一种：Waters XBridge Peptide BEH300A C18、YMC Triart C18、YMC Triart ExRs C18和Phenomenex Titank C18；

优选地，所述采用十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒作为固定相填充料的色谱柱具有的规格为4.6×150mm，3.5μm，且所述色谱柱选自以下的一种：Waters XBridge PeptideBEH 300AC18、YMC Triart C18、YMC Triart ExRs C18和Phenomenex Titank C18；

更优选地，所述采用十八烷基键合亚乙基桥杂化颗粒作为固定相填充料的色谱柱为Waters XBridge Peptide BEH 300A C18，规格为4.6×150mm，3.5μm。

4.根据技术方案1-3中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的洗脱方式为等度洗脱。

5.根据技术方案1-4中任一项所述的检测方法，其特征在于，

所述高效液相色谱法采用的高效液相色谱仪选自以下的一种：安捷伦1260Ⅱ、Waters e2695、戴安Ulitimate 3000、岛津LC-2050C/2060C或其他任何同类型的色谱仪；和/或

所述高效液相色谱法采用的检测器是UV检测器；优选地，所述高效液相色谱法采用的检测器是选自以下的一种：VWD检测器、DAD检测器、PDA检测器或其他任何同类型的检测器。

6.根据技术方案1-5中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述方法进一步包括以下步骤中的一种或多种：

(a)配制空白溶液、灵敏度溶液、分离度溶液、对照品溶液和酒石酸阿福特罗溶液的步骤，其中：

-所述空白溶液为枸橼酸及其盐的混合溶液；

-所述对照品溶液通过磷酸盐溶液与乙腈的混合溶液溶解酒石酸阿福特罗对照品，并用所述空白溶液稀释至一定浓度制备；

-所述灵敏度溶液通过所述对照品溶液稀释至一定浓度制备；和

-所述分离度溶液由一定浓度的阿福特罗与非对映异构体的混合溶液制备；

(b)将所述空白溶液、所述灵敏度溶液、所述分离度溶液、所述对照品溶液和所述酒石酸阿福特罗溶液连续顺序进样到色谱仪，采用高效液相色谱法对所述空白溶液、所述灵敏度溶液、所述分离度溶液、所述对照品溶液和所述酒石酸阿福特罗溶液依次进行分析，记录色谱图；

(c)通过外标法(标准曲线法或外标一点法)根据色谱图的峰面积计算所述酒石酸阿福特罗溶液中非对映异构体的含量。

7.根据技术方案1-6中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述酒石酸阿福特罗溶液选自至少以下一种：酒石酸阿福特罗吸入溶液、由酒石酸阿福特罗原料药配制成的酒石酸阿福特罗溶液、由酒石酸阿福特罗气雾剂配制成的酒石酸阿福特罗溶液、由酒石酸阿福特罗片配制成的酒石酸阿福特罗溶液、由酒石酸阿福特罗干糖浆配制成的酒石酸阿福特罗溶液、由酒石酸阿福特罗吸入粉雾剂配制成的酒石酸阿福特罗溶液、和由阿福特罗与其他药物制成的复方制剂产品配制成的含有阿福特罗的溶液；优选地，所述酒石酸阿福特罗溶液为酒石酸阿福特罗吸入溶液。

8.根据技术方案1-7中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述酒石酸阿福特罗溶液中的非对映异构体选自以下至少一种：