同时检测硫酸化及未硫酸化胃泌素G17的方法及其检测试剂盒

摘要

本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及同时检测硫酸化及未硫酸化胃泌素G17的方法及其检测试剂盒。本发明的方法将待测血液样品进行前处理，采用弱阴离子固相萃取的方式进行样本提取后，上机检测，两个成分经过液相分离后，分别进入质谱仪中经电喷雾电离产生特异的质荷比，采用同位素内标法实现对血液样品中Unsulfated‑G17和Sulfated‑G17的定量检测。本发明方法用样量少，检测速度快，且具有较高的准确度和精密度，可显著提高胃泌素Unsulfated‑G17和Sulfated‑G17检测的准确性和有效性，临床应用前景良好。

说明书

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及同时检测硫酸化及未硫酸化胃泌素G17的方法及其检测试剂盒。

背景技术

胃泌素是一种主要由胃窦G细胞分泌的多肽类胃肠激素，主要活性成分包括G34和G17两种亚型，分别有磺酸化和非磺酸化两种形式。其中G17具有刺激胃酸分泌，促进胃粘膜细胞增殖与分化等多种生理功能，是反映胃窦内分泌功能的敏感指标之一，可以提示胃窦黏膜萎缩状况或者是否存在异常增高。当血清G17水平升高，提示存在胃癌风险，因此被新增为早期胃癌筛查指南的项目。有研究指出在不同疾病状态下非磺酸化胃泌素和磺酸化胃泌素的比值存在差异，提示其比值具有评估胃癌风险以及与其他疾病进行鉴别诊断的潜力。Unsulfat ed-G17和Sulfated-G17的序列见图1。

目前已有的检测血样中胃泌素的方法，大部分基于免疫学方法(放免法、化学发光、免疫法等)，目前临床最为常用的免疫方法虽然检测方便、快速、通量较高，但是仅能检测总胃泌素，不能区分各种亚型。基于液相色谱串联质谱方法具有特异性强，灵敏度高，可区分并同时检测多个结构类似物的优势，在临床检测中发挥越来越重要的作用。例如现有技术Yu S,et al.Analytical and Clinical Performance of a LiquidChromatography-Tandem Mass Spectrometry Method for Measuring Gastrin SubtypesG34 and G17 in Serum.Clin Chem.2021Sep 1；67(9):1220-1229.doi:10.1093/clinchem/hvab097.PMID:34383899.但该方法不能同时测定Unsulfated-G17和Sulfated-G17。鉴于Unsulfated-G17和Sulfated-G17在同一检测样本中的定量比值在不同疾病状态下存在实际临床意义，尤其在胃癌的风险评估和其他疾病的鉴别诊断方面都具有辅助诊断的潜在能力，因此有必要研发一种能够同时定量检测待测样品中Unsulfated-G17和Sulfated-G17的方法，并转化为试剂盒应用于临床检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种同时检测胃泌素Unsulfated-G17和Sulfated-G17的方法及其检测试剂盒。

本发明的检测方法基于液相色谱串联质谱检测技术建立，根据Unsulfated-G17和Sulfated-G17的pKa值判断两者均为酸性化合物，采用弱阴离子固相萃取的方式进行样本提取后，再在液相色谱仪器上经过有效分离，分别进入质谱仪中经电喷雾电离产生特异的质量/电荷比(质荷比)，采用同位素内标法实现对Unsulfated-G17和Sulfated-G17的定量。Unsulfated-G17和Sulfated-G17的测定分别以各自质量浓度的标准品制备校准曲线，以标准溶液质量浓度为X轴，标准品和内标峰面积的比值为Y轴，进行线性回归分析，经“1/X”权重得回归方程。将样品中待测成分与其内标峰面积比代入标准曲线方程，计算血清样品中各待测成分的浓度。样本检测信号强度与同位素内标的比值与样本中待测成分的浓度呈正比。

具体地，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种同时检测胃泌素Unsulfated-G17和Sulfated-G17的检测方法，包括以下方法：

(1)待测样品中加入样本制备液1，离心取上清，加入样本制备液2；所述样本制备液1为乙腈；所述样本制备液2为水；

(2)将步骤(1)制得的溶液经固相萃取，正压洗脱，依次加入水和固相萃取液1清洗，再加入固相萃取液2清洗，正压洗脱，收集洗脱液；或

将步骤(1)制得的溶液经免疫磁珠法富集；

(3)洗脱液干燥，用样本复溶液对其复溶，采用液相色谱串联质谱法进行检测。

本发明所述方法中，所述固相萃取液1为10％-80％甲醇，所述固相萃取液2为1％-10％氨水甲醇溶液。

所述样本复溶液为0.1％-1％氨水5％-50％乙腈水溶液。

本发明的上述方法步骤(1)中待测样品为全血、血浆或血清；步骤(3)中采用液相色谱串联质谱法进行检测的进样量为1-10μL；色谱分离采用ACQUITY UPLC Peptide BEHC18色谱柱。

本发明发现结合本发明的方法，进行色谱分离时，HSS T3、HSS PFP、BEH C18、BEHC8、BEH Phenyl等常用的色谱柱均无法实现有效的分离，只有ACQUITY UPLC Peptide BEHC18色谱柱结合本发明方法中的其他步骤、试剂和参数的分离效果最好。

进一步地，本发明方法的步骤(1)中，待测样品与样本制备液1的体积比为1:1-5；样本样本制备液1与样本制备液2的体积比为1:2-10；

优选地，步骤(1)中，待测样品与样本制备液1的体积比为1:2；样本样本制备液1与样本制备液2的体积比为1:4.25；

步骤(2)中，加入水的量是步骤(1)中待测样品体积的1-5倍，固相萃取液1的加入量与所述水的量相当，固相萃取液1与固相萃取液2的体积比为1:0.1-0.8；

优选地，步骤(2)中，加入水的量是步骤(1)中待测样品体积的2倍，固相萃取液1的加入量与所述水的量相当，固相萃取液1与固相萃取液2的体积比为1:0.4；

步骤(3)中，样本复溶液的量与步骤(1)中待测样品体积相当。

所述液相色谱串联质谱法中，液相色谱的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为0.3％氨水溶液，所述流动相B为纯乙腈。

本发明方法中，液相色谱的流动相按照以下梯度进行梯度洗脱：0-1.0min，流动相A 95％，1.0-3.5min，流动相A 95-50％，3.5-4.0min，流动相A 50％，4.0-4.01min，流动相A50-2％，4.01-4.5min，流动相A 2％，4.5-6.0min，流动相A 95％；

本发明发现，采用上述流动相体系和洗脱程序能够得到最佳分离度和最优峰形，有利于提高Unsulfated-G17和Sulfated-G17检测的准确度和精密度。

优选地，所述流动相的流速为0.3mL/min。

本发明方法中，质谱检测条件如下：多离子监测反应模式，负离子模式，电喷雾电离，离子源温度400～600℃，同时监测Unsulfated-G17和Sulfated-G17及其内标的离子对：Unsulfated-G17-定量：m/z523.5→610.9；Unsulfated-G17-定性418.6→457.9；Sulfated-G17-定量：m/z 434.6→477.9；Sulfated-G17-定性m/z 543.3→477.9；Unsulfated-G17同位素内标：m/z 525.5→610.8。

本发明的检测方法可用于血液样品中Unsulfated-G17和Sulfated-G17的定性检测或定量检测。在进行定量检测时，利用不同浓度的标准品制作标准曲线，以标准溶液浓度为X轴，标准品和内标峰面积的比值为Y轴，进行线性回归分析，经“1/X”权重得回归方程。将样品中待测成分与其内标峰面积比代入标准曲线方程，计算样品中Unsulfated-G17和Sulfated-G17的浓度。样本检测信号强度与同位素内标的比值与样本中待测成分的浓度呈正比。本发明发现，采用本发明的检测方法进行检测，标准曲线的相关系数>0.995，能够满足定量检测的要求。

第二方面，本发明提供一种胃泌素Unsulfated-G17和Sulfated-G17的检测试剂盒，包括：

试剂I：纯乙腈用于样本制备液；

试剂II：纯水，用于样本制备液；

试剂III：10％-80％甲醇，用于固相萃取；

试剂IV：1％-10％氨水甲醇溶液，用于固相萃取；

试剂V：0.1％-1％氨水10％乙腈水溶液，用于样本复溶；

试剂VI：0.3％氨水溶液，作为液相色谱分离的流动相A；

试剂VII：纯乙腈，作为液相色谱分离的流动相B；

优选地，所述试剂盒还包括：

试剂VIII：G17同位素内标，浓度为10-50ng/mL；

试剂IX：Unsulfated-G17标准品和/或Sulfated-G17标准品。

第三方面，本发明提供了上述试剂盒在胃泌素Unsulfated-G17和Sulfated-G17的定性或定量检测中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明基于液相色谱串联质谱技术建立了不受非特异性交叉干扰的LC-MS/MS同时测定Unsulfated-G17和Sulfated-G17的方法，该方法对待测样品的用量要求少，检测速度快，且具有较高的准确度和精密度，可准确高效灵敏地实现对Unsulfated-G17和Sulfated-G17的定量检测，在胃癌的风险评估和其他疾病的鉴别诊断方面应用前景良好。

附图说明

图1为本发明述及的Unsulfated-G17(A)和Sulfated-G17(B)的氨基酸序列。

图2为本发明实施例1中血清样本中检测Unsulfated-G17和Sulfated-G17的MRM色谱图。

图3为LC-MS/MS方法测定Unsulfated-G17和Sulfated-G17的线性范围。

图4为不同样本制备液2的检测结果对照图。

图5为不同样本复溶液的检测结果对照图。

图6为不同色谱柱进行液相色谱分离的结果对照图。

图7A为不同流动相梯度对检测结果的比较图。

图7B为不同流动相梯度对检测结果的比较图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未说明，本发明实施例所用试剂、耗材、仪器均为市售可得。

样本制备液1：乙腈；

样本制备液2：水；

固相萃取液1：50％甲醇水溶液；

固相萃取液2：5％氨水甲醇溶液；

样本复溶液：1％氨水10％乙腈水溶液；

流动相A：含有0.3％氨水溶液。流动相B:乙腈(为纯的乙腈)。

校准溶液和内标溶液：准确称量Unsulfated-G17和Sulfated-G17与其各自的内标至定容瓶，使用1％氨水10％乙腈水溶液配制成母液，之后使用1％氨水10％乙腈水溶液进行一系列稀释制备成浓度分别为5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000pg/mL的工作校准液；准确称量Unsulfated-G17的同位素内标至定容瓶，使用1％氨水10％乙腈水溶液配制成母液，之后使用1％氨水10％乙腈水溶液稀释为内标工作液(10ng/mL)。

实施例1

本实施例提供一种能够同时检测胃泌素Unsulfated-G17和Sulfated-G17的方法，该方法采用液相色谱串联质谱法进行检测，具体如下：

1、样品前处理

取100μL血样或校准溶液分别加入1.5ml塑料管，各加入200μL样本制备液1，混合震荡，离心后取上清至新管中，分别加入850μL样品制备液2；之后将样本加入活化后的WAX固相萃取板，正压洗脱，依次加入200μL水和200μL固相萃取液1清洗，最后加入80μL固相萃取液2，正压洗脱，收集此步洗脱液，氮气吹干，用80μL样本复溶液进行复溶，等待上机测试，进样体积：10μL。

2、液相色谱检测

色谱分离采用ACQUITY UPLC Peptide BEH C18色谱柱，液相色谱流动相A和流动相B按如下表1的梯度进行设置：

表1

3、质谱检测

质谱选择多离子监测反应模式，负离子模式，电喷雾电离，离子源温度400～600℃，同时监测Unsulfated-G17和Sulfated-G17及其内标的离子对：Unsulfated-G17(定量)：523.5→610.9；Unsulfated-G17(定性)418.6→457.9；Sulfated-G17(定量)：434.6→477.9；Sulfated-G17(定性)543.3→477.9；Unsulfated-G17同位素内标：525.5→610.8

利用上述方法进行血清样本中Unsulfated-G17和Sulfated-G17检测的代表性色谱图如图2所示。

4、线性相关性分析

Unsulfated-G17线性在10-10000pg/mL范围内相关性>0.995,Sulfated-G17线性在20-10000pg/mL范围内相关性>0.99，见图3。

5、精密度评价

三个水平血清样本，分三批次测定，每次测定5个平行样，得到批内及总不精密度如表2：

表2 LC-MS/MS方法测定Unsulfated-G17和Sulfated-G17不精密度

6、回收率和准确性评价：

用Unsulfated-G17和Sulfated-G17标准品做添加回收试验，结果如表3。

表3 LC-MS/MS方法测定Unsulfated-G17和Sulfated-G17的回收率

对比例1

与实施例1其他条件相同的情况下，仅样本制备液2不同，本对比例采用850μL 2％甲酸(FA)溶液替换实施例1中的样本制备液2，结果见图4。

与实施例1的结果比较，采用850μL 2％甲酸(FA)溶液替换实施例1中的样本制备液2，会使得Unsulfated-G17的提取效率降低，说明采用实施例1中的样本制备液2的提取效果优于采用850μL 2％甲酸(FA)溶液的提取效果。

对比例2

与实施例1其他条件相同的情况下，仅样本复溶液不同，本对比例采用1％氨水20％乙腈水溶液替换实施例1中的样本复溶液，结果见图5。

与实施例1的结果比较，采用1％氨水20％乙腈水溶剂具有溶剂效应，会使得Unsulfated-G17的色谱峰裂分。说明实施例1中的样本复溶液具有最佳的比例可避免溶剂效应。

对比例3

本对比例在实施例1的基础，选择三种不同的色谱柱进行液相色谱检测，其他条件方法参数均与实施例相同，三种色谱柱分别是：

A.HSS C18,2.1mm*100mm,1.8μm,

B.BEH C18,2.1mm*100mm,1.7μm,

C.Peptide BEH C18,2.1*100mm,1.7μm,

其中C即为实施例1采用的色谱柱。最终结果见图6，图中A图B图和C图均对应上述三种色谱柱。结果说明本发明实施例1中采用的色谱柱C具有最佳的保留和分离度。

对比例4

本对比例探讨在进行液相色谱检测时，不同流动相梯度(表4、表5)对检测结果的影响，其他方法步骤参数均参见实施例1。A、B两种梯度的检测结果见图7A和图7B。结果说明实施例1中的优化的梯度能够保证Unsulfated-G17和sulfated-G17具有最佳的色谱分离度。

表4 A梯度:

表5 B梯度:

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。