与冯维勒布兰德因子和补体C1Q的复合物相关的治疗方法

摘要

本文提供了用于治疗动脉粥样硬化的方法，其包括向受试者施用冯维勒布兰德因子(VWF)，使得所述VWF结合补体C1q以形成C1q‑VWF复合物。还提供了用于通过使巨噬细胞与包含VWF、补体C1q和胆固醇晶体(CC)的复合物接触来筛选调节巨噬细胞活性和功能的候选剂的体外方法。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年9月11日提交的美国临时申请序列号62/899,036的优先权，出于所有目的，所述申请的公开内容以引用的方式整体并入本文。

发明背景

被认为是动脉的病理性重塑的动脉粥样硬化是发达国家发病率和死亡率的主要原因，并且是心肌梗塞、中风和外周动脉疾病的潜在基础。其可被认为是动脉壁内发生的一种不寻常形式的慢性炎症。动脉粥样硬化的特征为侵占中型和大型动脉管腔的斑片状的内膜斑块(粥样斑块)；所述斑块含有脂质、炎性细胞、平滑肌细胞和结缔组织。其可影响大型和中型动脉，包括冠状动脉、颈动脉和脑动脉，主动脉及其分支，以及四肢的主要动脉。

当斑块的生长或破裂减少或阻碍血流时，就会发展出症状；并且所述症状可能因受影响的动脉而异。动脉粥样硬化斑块可以是稳定的或不稳定的。稳定的斑块会消退、保持静止或缓慢生长，有时长达数十年，直到它们可能导致狭窄或闭塞。

不稳定的斑块很容易发生自发性糜烂、裂缝或破裂，在它们引起血流动力学显著狭窄很早之前就会引起急性血栓形成、闭塞和梗塞。大多数临床事件是由不稳定的斑块引起的，这些斑块在血管造影中看起来并不严重。不稳定斑块的破裂导致血小板聚集并形成附接至血管壁的动脉血块(血栓)。血栓物质从壁上脱落并可能被运送到远处(栓塞)，在那里它可能导致较小的动脉阻塞。动脉血栓形成的临床后果是心脏病发作、中风和肾病。事实上，大多数(约60％)动脉血栓形成与破裂的动脉粥样硬化斑块相关联。

动脉粥样硬化最早可见的病变是脂纹，其是动脉内膜层中富含脂质的泡沫细胞的积聚。动脉粥样硬化的标志是动脉粥样硬化斑块，其是脂纹的演变，并且具有三个主要组分：脂质(例如，胆固醇和甘油三酯)；炎性细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞及其衍生物)和平滑肌细胞；以及结缔组织基质。

巨噬细胞本质上与动脉粥样硬化的进展有关。巨噬细胞和巨噬细胞衍生的泡沫细胞是动脉粥样硬化斑块的主要组分，较高比率的巨噬细胞与不稳定斑块相关联。关于炎症和巨噬细胞在动脉粥样硬化中的作用的其他描述可例如在Moore和Tabas，Cell，2011，145，341-355和Libby，Nature，2002，420(6217)，868-74中找到。

在动脉粥样硬化发作时，巨噬细胞衍生的泡沫细胞在血管(动脉)的内皮下空间积聚，并且是具有纤维帽的动脉粥样硬化病变(斑块)进展的关键。泡沫细胞增加关键的致动脉粥样硬化和炎性细胞因子和趋化因子的表达，从而诱导炎性响应。随着动脉粥样硬化病变进展为易损斑块，会形成包含凋亡泡沫细胞、细胞碎片和胆固醇晶体的坏死核心，并且纤维帽变薄和变弱。坏死核心导致纤维帽上的炎症、血栓形成、蛋白水解分解和物理压力。最终，坏死核心中凋亡细胞的积聚和吞噬清除(胞葬作用)缺乏以及变薄的纤维帽的不稳定性导致动脉粥样硬化斑块破裂和血块形成(血栓)。在一些情况下，血栓会导致心肌梗塞(心脏病发作)、不稳定型心绞痛、心源性猝死或中风(Virmani等人，J.Interv.Cardiol，2002，15，439-446)。

补体C1q是经典补体途径的起始分子，可独立于补体激活发挥多种免疫调节功能。C1q的非经典功能包括清除凋亡细胞和胆固醇晶体(CC)以及调节由免疫细胞(诸如巨噬细胞)进行的细胞因子分泌。

在动脉粥样硬化的晚期阶段，补体激活-特别是在涉及终末途径时-似乎会导致炎性响应，从而导致疾病病理。相比之下，在其他补体组分不表达或表达之前的早期动脉粥样硬化病变中，观察和实验研究表明，C1q和经典途径的早期下游组分发挥保护性作用(Patzelt等人，Front Physiol，2015，6，49)。许多人已经综述了血小板的早期致动脉粥样硬化作用以及冯维勒布兰德因子(von Willebrand factor，VWF)作为血小板-内皮相互作用的介体(Wu，等人Blood，129(2017)1415-1419)。

冯维勒布兰德因子已经证明可在体外结合至表面结合的C1q(

VWF是在血浆中以大小在约500至20,000kD范围内的一系列多聚体形式循环的糖蛋白。VWF全长eDNA已被克隆；多肽原对应于全长前原-VWF的氨基酸残基23至764(Eikenboom等人，Haemophilia，1(1995)，77-90)。VWF的多聚体形式由250kD多肽亚基通过二硫键连接在一起构成。VWF介导初始血小板粘附至损伤的血管壁的内皮下膜，其中较大的多聚体表现出增强的止血活性。多聚化的VWF通过VWF的A1结构域中的相互作用结合至血小板表面糖蛋白Gp1bα，促进血小板粘附。VWF上的其他位点介导与血管壁的结合。因此，VWF在血小板与血管壁之间形成桥，所述桥对高剪切应力条件下血小板粘附和初期止血是至关重要的。

正常情况下，内皮细胞分泌VWF的较大聚合形式而VWF的具有较低分子量的那些形式由蛋白水解裂解产生。具有特大分子质量的多聚体储存于内皮细胞的Weibel-Pallade小体中并且在受激动剂诸如凝血酶和组胺刺激后被释放。

高的VWF水平与缺血性心血管事件的风险增加密切相关(Spiel等人Circulation，2008，117(11)，1449-1459)。还表明VWF缺乏或阻塞对动脉粥样硬化具有保护作用(Methia等人，Blood，98(2001)1424-1428)。

本领域仍然需要对动脉粥样硬化和相关疾患的新型治疗。

发明内容

本文提供了治疗受试者动脉粥样硬化的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的包含冯维勒布兰德因子(VWF)的组合物，使得VWF结合补体C1q以形成C1q VWF复合物并且所述C1q-VWF复合物结合胆固醇晶体(CC)，从而形成CC-C1q-VWF复合物并抑制动脉粥样硬化斑块的进展。

此外，本发明提供了治疗受试者动脉粥样硬化的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的包含冯维勒布兰德因子(VWF)的组合物，使得VWF结合补体C1q以形成C1q-VWF复合物，从而抑制动脉粥样硬化斑块进展。

在一个方面，提供了减少受试者动脉粥样硬化斑块的炎症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的包含冯维勒布兰德因子(VWF)的组合物，使得vWF结合补体C1q以形成C1q-VWF复合物并且所述C1q-VWF复合物结合胆固醇晶体(CC)，从而形成CC-C1q-VWF复合物并减少动脉粥样硬化斑块的炎症。

在另一个方面，本文提供了减少受试者动脉粥样硬化斑块炎症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的包含冯维勒布兰德因子(VWF)的组合物，使得vWF结合补体C1q以形成C1q-VWF复合物。

在另一个方面，本文提供了调节受试者血管中巨噬细胞免疫响应的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的包含冯维勒布兰德因子(VWF)的组合物，使得VWF结合补体C1q以形成C1q-VWF复合物，从而降低巨噬细胞形成，提高巨噬细胞表面上一种或多种吞噬作用介导受体和/或共刺激受体的表达水平，减少巨噬细胞的吞噬作用，和/或减少由巨噬细胞分泌的促炎性细胞因子。

在一些实施方案中，所述方法中的任一种的受试者患有动脉粥样硬化。

在一些实施方案中，VWF是重组vWF(rVWF)。在一些实施方案中，rVWF包含选自由以下组成的组的多肽：(a)SEQ ID NO：3的氨基酸序列；(b)(a)的生物活性类似物、片段或变体；(c)由SEQ ID NO：1的多核苷酸序列编码的多肽；和(d)(c)的生物活性类似物、片段或变体。

在一些实施方案中，rVWF的组合物包含高分子量vWF多聚体，所述多聚体包含至少20％的VWF十聚体或高阶多聚体。在某些实施方案中，rVWF的组合物包含高分子量vWF多聚体，所述多聚体包含至少40％的VWF十聚体或高阶多聚体。在一些实施方案中，rVWF的组合物包含高分子量vWF多聚体，所述多聚体包含至少60％的VWF十聚体或高阶多聚体。

在一些实施方案中，rVWF通过用弗林蛋白酶(Furin)处理在体外成熟。

在一些实施方案中，rVWF与血浆衍生的VWF相比具有更高的比活性。

在一些实施方案中，本文方法中的任一种的C1q-VWF复合物结合胆固醇晶体(CC)，从而形成CC-C1q-VWF复合物。

在一些实施方案中，一种或多种吞噬作用介导受体和/或共刺激受体选自由以下组成的组：CD14、CD86、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、脂蛋白受体相关蛋白1(LRP-1)、酪氨酸蛋白激酶Mer(MerTk)、MHC II、程序性死亡配体1(PD-L1)、清道夫受体A1(SR-A1)和它们的组合。

在一些实施方案中，促炎性细胞因子选自由以下组成的组：IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-18、IL-1R、TNF1α和它们的组合。

在一些实施方案中，本文方法中的任一种还包括在施用包含VWF的组合物之后测定取自受试者的样品中的C1q-VWF复合物的水平。在某些情况下，测定C1q-VWF复合物水平的步骤包括检测样品中细胞表面上的C1q-VWF复合物。

本发明提供了鉴定用于调节巨噬细胞吞噬作用的候选剂的体外方法，其包括：(a)孵育rVWF、补体C1q和胆固醇晶体以形成包含rVWF、补体C1q和胆固醇晶体的复合物(CC-C1q-VWF复合物)；(b)用CC-C1q-VWF复合物治疗巨噬细胞群；(c)用候选剂治疗巨噬细胞群；(d)测量巨噬细胞群的吞噬水平；以及(e)将吞噬作用水平与未用候选剂处理的巨噬细胞群的吞噬作用水平进行比较。

在一些实施方案中，测量吞噬作用水平的步骤包括检测巨噬细胞群中CD11c阳性细胞的百分比。

在一个方面，本文提供了鉴定用于调节巨噬细胞吞噬作用介导受体和共刺激受体表达的候选剂的体外方法，其包括：(a)孵育rVWF、补体C1q和胆固醇晶体以形成包含rVWF、补体C1q和胆固醇晶体的复合物(CC-C1q-VWF复合物)；(b)用CC-C1q-VWF复合物治疗巨噬细胞群；(c)用候选剂治疗巨噬细胞群；(d)测量巨噬细胞群中吞噬作用介导受体和共刺激受体的表达水平；以及(e)将表达水平与未用候选剂治疗的巨噬细胞群中吞噬作用介导受体和共刺激受体的表达水平进行比较。

在一些实施方案中，吞噬作用介导受体和共刺激受体选自由以下组成的组：CD14、CD86、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、脂蛋白受体相关蛋白1(LRP-1)、酪氨酸蛋白激酶Mer(MerTk)、MHC II、程序性死亡配体1(PD-L1)、清道夫受体A1(SR-A1)和它们的组合。

在一个方面，本文提供了鉴定用于调节巨噬细胞促炎性细胞因子分泌的候选剂的体外方法，其包括：(a)孵育rVWF、补体C1q和胆固醇晶体以形成包含rVWF、补体C1q和胆固醇晶体的复合物(CC-C1q-VWF复合物)；(b)用CC-C1q-VWF复合物治处理巨噬细胞群；(c)用候选剂处理巨噬细胞群；(d)测量巨噬细胞群中促炎性细胞因子分泌的水平；以及(e)将未用候选剂治疗的巨噬细胞群中促炎性细胞因子分泌水平与促炎性细胞因子分泌水平进行比较。

在一些实施方案中，促炎性细胞因子选自由以下组成的组：IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-18、IL-1R、TNF1α和它们的组合。

在一些实施方案中，rVWF包含选自由以下组成的组的多肽：(a)SEQ ID NO：3的氨基酸序列；(b)(a)的生物活性类似物、片段或变体；(c)由SEQ ID NO：1的多核苷酸序列编码的多肽；和(d)(c)的生物活性类似物、片段或变体。

在一些实施方案中，rVWF的组合物包含高分子量vWF多聚体，所述多聚体包含至少20％的VWF十聚体或高阶多聚体。在某些实施方案中，rVWF的组合物包含高分子量vWF多聚体，所述多聚体包含至少40％的VWF十聚体或高阶多聚体。在一些实施方案中，rVWF的组合物包含高分子量vWF多聚体，所述多聚体包含至少60％的VWF十聚体或高阶多聚体。

在一些实施方案中，rVWF通过用弗林蛋白酶(Furin)处理在体外成熟。

在一些实施方案中，rVWF与血浆衍生的VWF相比具有更高的比活性。

在一些实施方案中，体外方法的巨噬细胞是人单核细胞衍生的巨噬细胞。

本发明的其他目的、优点和实施方案将从以下详细描述中显而易见。

附图说明

图1A和图1B：在(图1A)静态和(图1B)动态条件下vWF与C1q的时间依赖性结合。将重组(r)vWF添加到包被C1q的表面，并分别与胶原I(Coll I)和BSA作为阳性和阴性对照进行比较。与开始时(0秒)与BSA的结合相比，rvWF的结合表示为倍数增加。

图2A至图2E：VWF-C1q对凋亡Jurkat细胞衍生微粒(MP)的相互作用。代表性FACS图示出了(图2A)未处理的MP、(图2B)单独与C1q孵育的MP、(图2C)单独与rvWF孵育的MP和(图2D)与C1q和vWF两者孵育的MP。(图2E)汇集的FACS数据示出为具有标准偏差的平均荧光强度(n＝3，单因素ANOVA检验，ns不显著，**p＜0.01)。

图3A和图3B：暴露于单独的C1q(形成树突的细长表型(图3A))或C1q-vWF复合物(形成聚集体(图3B))的人单核细胞衍生巨噬细胞之间的形态学差异。

图4A至图4E：vWF以C1q依赖性方式结合至CC。通过流式细胞术(图4A、图4B、图4C)、共焦显微术(图4D)和ImageStreamX(图4E)测定C1q和vWF与CC表面上固定的C1q的结合。代表性流式细胞术图示出了CC表面上C1q的结合(图4A)或vWF的C1q依赖性结合(图4B)。对照(ctrl)仅代表二抗的存在。流式细胞术数据示出为平均gMFI±SD(n＝5，RM单因素ANOVA检验和Tukey后检验，**p＜0.005)(图4C)。共焦显微术在明场中描绘了代表性的CC，其中在C1q存在的情况下，C1q(红色)或vWF(蓝色)与其表面结合。合并的染色模式使C1q-vWF相互作用可视化(图4D)。示出了三个独立实验之一。比例尺＝50μm。ImageStreamX捕获的C1q(黄色)或C1q-vWF(红色)的CC荧光染色(图4E)。示出了两个独立实验之一。比例尺＝10μm。

图5A至图5H：CC-C1q-vWF复合物上调HMDM的表面受体表达。LPS刺激的HMDM用CC、CC-C1q或CC-C1q-vWF复合物处理18小时，并通过流式细胞术分析CD14(图5A)、CD86(图5B)、LAIR1(图5C)、LRP-1(图5D)、MerTK(图5E)、MHC II(图5F)、PD-L1(图5G)和SR-A1(图5H)的表面标志物表达。汇集的流式细胞术数据示出为gMFI，其中水平线表示中位数。数据点代表分析用于获得HMDM的六种不同健康供体的独立实验(Wilcoxon配对符号秩检验，*p＜0.05；ns＝不显著)。

图6A至图6D：HMDM对CC-C1q-vWF复合物的吞噬作用受到阻碍。HMDM保持未经处理或用CC、CC-C1q或CC-C1q-vWF复合物处理18小时，并通过流式细胞术分析CC复合物的吞噬作用程度(图6A、图6B)。吞噬作用由转移至SSC高门的CDllc+细胞的百分比测定。FACS点图示出了六个独立实验中的一个(图6A)。汇集的数据的吞噬作用的量化显示在(图6B)中。HMDM用CC、CC-C1q或CC-C1q-vWF pHrodo染色复合物处理30min，并通过流式细胞术分析CC复合物的吞噬程度(图6C、图6D)。吞噬作用由转移至pHrodo Red Ester+门的CD11c+细胞的百分比测定。FACS点图示出了六个独立实验中的一个(图6C)。汇集的数据的吞噬作用的量化显示在(图6D)中。

水平线表示中位数，而误差线表示四分位距。数据点代表分析用于获得HMDM的六种不同健康供体的独立实验(Wilcoxon配对符号秩检验，*p＜0.05)。

图7A至图7I：CC-C1q-vWF复合物减弱LPS诱导的HMDM的IL-1分泌。LPS诱导的HMDM保持未经处理或用CC、CC-C1q或CC-C1q-vWF复合物处理18小时。通过ELISA分析上清液的IL-1a(图7A)、IL-1β(图7B)、IL-1RA(图7C)、IL-18(图7F)、IL-6(图7G)、IL-10(图7H)和TNFa(图7I)水平。数据示出了汇集的细胞因子水平的中值浓度或中值比率。数据点代表分析用于获得HMDM的八种不同健康供体的独立实验(Wilcoxon配对符号秩检验，*p＜0.05；**p＜0.005；ns＝不显著)。

图8A和图8B：CC-C1q-vWF复合物在HMDM中表现出降低的胱天蛋白酶1活性。HMDM保持未经处理或用CC、CC-C1q或CC-C1q-vWF复合物处理18小时，并通过流式细胞术分析胱天蛋白酶1活性。胱天蛋白酶1的活性由FLICA+门中CD11c+细胞的百分比测定。FACS点图示出了六个独立实验中的一个(图8A)。汇集的数据的胱天蛋白酶1活性量化显示在(图8B)中。水平线表示中位数，而误差线表示四分位距。数据点代表分析用于获得HMDM的六种不同健康供体的独立实验(Wilcoxon配对符号秩检验，*p＜0.05)。

图9A-1至图9A-3，图9B-1至图9B-10，和图9C-1至图9C-8示出了VWF核酸和氨基酸序列。图9A-1至图9A-3提供了SEQ ID NO：1。图9B-1至图9B-10提供了SEQ ID NO：2。图9C-1至图9C-8提供了SEQ ID NO：3。

图10示出了人补体因子C1q亚基A(SEQ ID NO：4)、亚基B(SEQ ID NO：5)和亚基C(SEQ ID NO：6)的氨基酸序列。

具体实施方式

本发明提供了用于治疗受试者的动脉粥样硬化的方法，其包括施用VWF使得VWF结合补体C1q以形成C1q-VWF复合物。在一些方面，所述方法降低动脉粥样硬化斑块中的炎症。在其他方面，所述方法在动脉粥样硬化进展期间调节巨噬细胞的免疫响应。

还提供了用于鉴定用于调节巨噬细胞吞噬作用的候选剂的体外方法。在一些方面，体外方法用于鉴定调节巨噬细胞吞噬作用介导受体和共刺激受体表达的候选剂。在某些方面，体外方法用于鉴定调节巨噬细胞分泌促炎性细胞因子的候选剂。

在进一步描述本发明之前，应理解本发明不限于所述的具体实施方案，因此，当然也可有所变化。还应理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且无意是限制性的，因为本发明的范围将仅受限于所附权利要求。

如本文所用，“rVWF”是指重组VWF。

如本文所用，“rFVIII”是指重组FVIII。

在参考例如细胞或核酸、蛋白质或载体来一起使用时，术语“重组”指示细胞或核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质来进行修饰，或者指示细胞源自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式中未发现的基因或者表达以其他形式异常表达、表达不充分或完全未表达的天然基因。

如本文所用，“重组VWF”包括经由重组DNA技术获得的VWF。在某些实施方案中，本发明的VWF蛋白可包含构建体，例如，如1986年10月23日公布的WO 1986/06096和以Ginsburg等人之名于1990年7月23日提交的美国专利申请序号07/559,509中制备的构建体，所述专利关于产生重组VWF的方法以引用的方式并入本文。本发明中的VWF可包括所有潜在形式，包括单体和多聚体形式。还应当理解，本发明涵盖待组合使用的不同形式的VWF。例如，本发明的VWF可包括不同的多聚体、不同的衍生物和生物活性衍生物与非生物活性衍生物两者。

在本发明的上下文中，重组VWF涵盖来自例如哺乳动物，诸如灵长类动物、人、猴、兔、猪、啮齿动物、小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、犬、猫的VWF家族的任何成员及其生物活性衍生物。还涵盖具有活性的突变体和变体VWF蛋白以及VWF蛋白的功能片段和融合蛋白。此外，本发明的VWF还可包含促进纯化、检测或二者的标签。本文所述的VWF可进一步用治疗性部分或适于体外或体内成像的部分进行修饰。

如本文所用，“血浆衍生的VWF(pdVWF)”包括在血液中发现的所有形式的蛋白质，包括从哺乳动物获得的具有至少一种FVIII分子的体内稳定例如结合性质的成熟VWF。

术语“高度多聚体VWF”或“高分子量VWF”是指包含至少10个亚基，或12、14或16个亚基至约20、22、24或26个或更多亚基的VWF。术语“亚基”是指VWF的单体。如本领域已知的，通常是VWF二聚体聚合形成更大阶的多聚体(参见Turecek等人，Semin.Thromb.Hemost.2010，36(5)：510-521，所述文献出于所有目的且特别是针对关于VWF的多聚体分析的所有教义，在此以引用的方式整体并入)。

如本文所用，术语“因子VIII”或“FVIII”是指具有凝血因子VIII的典型特征的任何形式的因子VIII分子，无论是对患者而言是内源的、来源于血浆还是通过使用重组DNA技术产生的，并且包括所有修饰形式的因子VIII。因子VIII(FVIII)天然存在于并且存在于治疗制剂中，作为由单一基因产物产生的多肽的异质分布(参见例如，Andersson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：2979-2983(1986))。含有因子VIII的治疗制剂的可商购获得的实例包括以商品名HEMOFIL

术语“分离的”或“纯化的”是指实质上或基本上不含如在天然状态中发现的通常所伴随的组分的材料。纯度和均匀性通常使用分析化学技术诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法确定。作为制剂中存在的主要种类的VWF是基本上纯化的。在一些实施方案中，术语“纯化的”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生基本上一条带。在其他实施方案中，意指核酸或蛋白质是至少50％纯的，更优选至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或以上纯的。在其他实施方案中，“纯化(Purify)”或“纯化(purification)”是指从待纯化的组合物中去除至少一种污染物。在这个意义上，纯化不需要纯化的化合物是均质的，例如100％纯的。

如本文所用，“血浆FVIII活性”和“体内FVIII活性”可互换使用。使用标准测定测量的体内FVIII活性可以是内源性FVIII活性、治疗学上施用的FVIII(重组或血浆衍生的)活性或内源性和施用的FVIII两者的活性。类似地，“血浆FVIII”是指内源性FVIII或施用的重组或血浆衍生的FVIII。

如本文所用，术语“半衰期”是指经历衰变(或从样品或患者清除)的物质的量减少一半所需的时间段。

如本文所用，“血管性血友病”是指由冯维勒布兰德因子缺乏引起的一组疾病。冯维勒布兰德因子有助于血小板凝集在一起并粘着到血管壁上，这是正常血凝所需要的。如本文进一步详细描述，存在若干类型的血管性血友病，包括1、2A、2B、2M和3型。

术语“单核细胞”是在血液中循环的未成熟吞噬细胞，是指作为抗原呈递免疫细胞的细胞，具有通过吞噬作用捕获和分解病原体和外来物质的功能。

术语“巨噬细胞”是指充当巨噬细胞标志物的CD14阳性细胞。此外，巨噬细胞可根据其分化类型分为包括M1(炎症型)巨噬细胞或M2(抗炎型)巨噬细胞在内的活性巨噬细胞和静息巨噬细胞。如本文所用，术语“巨噬细胞”包括巨噬细胞衍生的泡沫细胞。

术语“泡沫细胞”是指定位于血管壁上的脂肪沉积物的含脂质的巨噬细胞。泡沫细胞形成可由低密度脂蛋白(LDL)诸如氧化LDL(OxLDL)或最小修饰LDL(mmLDL)诱导，并与胆固醇流入、酯化和流出的不平衡相关联。泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化进展的关键。

如本文所用，“补体因子C1q”、“补体因子C1q”和“C1q”是指来自具有经典补体激活系统的任何生物体的野生型序列及其天然存在的变体序列，所述生物体包括任何哺乳动物生物体，诸如人、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、牛、马、骆驼、绵羊、山羊或猪。人补体因子C1q是经典补体激活途径的识别组分。

人C1q由18条多肽链构成，包括三种类型的多肽链：A、B和C链。人C1q包括6人C1q，A链多肽，6人C1q，B链多肽，和6人C1q，C链多肽。

人C1q，A链(补体C1q亚组分A亚基)的示例性氨基酸序列可作为UniProtNo.P02745(SEQ ID NO：4)或其任何多态变体，以及其跨越SEQ ID NO：4的位置23-245的223个氨基酸的成熟形式找到。人C1q，A链的氨基酸序列可作为NCBI Ref.序列号NP_057075.1、NP_001334394.1和NP_001334395.1找到，并且对应的核酸序列可分别作为NCBI Ref.序列号NM_015991.4、NM_001347465.2和NM_001347466.1找到。在一些实施方案中，人C1q，A链的氨基酸序列是指本文提供的任何序列的成熟形式。

人C1q，B链(补体C1q亚组分B亚基)的示例性氨基酸序列可作为UniProtNo.P02746(SEQ ID NO：5)或其任何多态变体，以及其跨越SEQ ID NO：5的位置28-253的226个氨基酸的成熟形式找到。人C1q，B链的氨基酸序列可作为NCBI Ref.序列号NP_000482.3和XP_011540361.1找到，并且对应的核酸序列可分别作为NCBI Ref.序列号NM_000491.3和XM_011542059.2找到。在一些实施方案中，人C1q，B链的氨基酸序列是指本文提供的任何序列的成熟形式。

人C1q，C链的示例性氨基酸序列可作为UniProt No.P02747(SEQ ID NO：6)或其任何多态变体，以及其跨越SEQ ID NO：6的位置29-245的217个氨基酸的成熟形式找到。人C1q，C链的氨基酸序列可作为NCBI Ref.序列号NP_001107573.1、NP_001334548.1和NP_758957.2找到，并且对应的核酸序列可分别作为NCBI Ref.序列号NM_001114101.3、NM_001347619.1和NM_172369.4找到。在一些实施方案中，人C1q，C链氨基酸序列是指本文提供的任何序列的成熟形式。

C1q最著名的配体是免疫复合物中聚集的免疫球蛋白IgG和IgM分子的Fc区。此类结合触发经典途径的激活，这是补体系统激活的三种机制之一。补体系统激活的结果是产生C3和C5转化酶，所述转化酶产生促炎性C3a和C5a过敏毒素并催化形成孔状膜攻击复合物，所述复合物插入细胞膜中并通过溶解或亚溶解机制造成损害。

C1q参与抗原呈递细胞(诸如表达或分泌这种分子的单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞)的生物学(Lu等人，Cell Mol Immunol 5(2008)9-21)。C1q对单核细胞的体外处理调控细胞分化并赋予单核细胞衍生的树突状细胞致耐受性表型(Castellano等人，Eur.J.Immunol.，2007，37，2803-2811；Fraser等人，.J.Immunol.2009，183，6175-6185。相反，C1q缺乏会损害凋亡细胞的识别和清除，从而导致自身免疫的发展(例如系统性红斑狼疮(SLE)、肾小球肾炎)(Botto，等人，Nat.Genet.，1998，19，56-59；Nauta，等人，2002，Eur.Immunol.，32，1726-1736)。

术语“胆固醇晶体”或“CC”是指未酯化的胆固醇晶体。巨噬细胞锁定胞外聚集的LDL并消化与巨噬细胞相邻或附近的聚集的LDL的区域，导致大量未酯化胆固醇的释放。这种未酯化的胆固醇是形成胞外胆固醇晶体的来源。参见例如，Guarino等人，Biochemistry.2004，43：1685-93；Haka，等人，J CellSci.2016，129：1072-82；Duewell，等人，Nature.2010，464：1357-61；和Rajamaki，等人，PLoS One.2010，5：e11765。

巨噬细胞泡沫细胞产生游离胆固醇晶体，其从具有各种形态的细胞膜位点延伸，诸如但不限于板状、针状和螺旋状。特征为

如本文所用，向受试者“施用”(和所有语法等效物)包括静脉内施用、肌肉内施用、皮下施用、经口施用、作为栓剂施用、局部接触、腹膜内、病灶内或鼻内施用，或植入缓释剂装置，例如微型渗透泵。通过任何途径进行施用，包括胃肠外和透粘膜(例如，经口、经鼻、经阴道、经直肠或透皮)。胃肠外施用包括例如，静脉内、肌肉内、小动脉内、真皮内、皮下、腹腔内、脑室内和颅内施用。其他递送模式包括但不限于脂质体制剂、静脉内输注、透皮贴剂等的使用。

术语“治疗有效量或剂量”或“治疗足够量或剂量”或“有效或足够的量或剂量”是指针对所述剂量施用产生治疗效果的剂量。例如，用于治疗动脉粥样硬化的药物的治疗有效量可以是能够预防或减轻与动脉粥样硬化相关的一种或多种症状的量。确切的剂量将取决于治疗的目的，并且由本领域技术人员使用已知的技术来确定(参见例如，Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷，1992)；Lloyd，The Art，Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar，Dosage Calculations(1999)；和Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，2003，Gennaro编著，Lippincott，Williams&Wilkins)。

如本文所用，术语“预防”包括针对个体中特定疾病、病症或疾患的发生或复发提供预防。个体可易患、易患特定疾病、病症或疾患，或处于发展出此类疾病、病症或疾患的风险中，但尚未被诊断出患有所述疾病、病症或疾患。

如本文所用，术语“治疗”包括提供设计来在临床病理学过程期间改变所治疗的个体的自然过程的临床干预。合乎需要的治疗作用包括降低进展速率、改善或减轻病理学状态，以及缓解或提高特定疾病、病症或疾患的预后。例如如果与特定疾病、病症或疾患相关的一种或多种症状得到减轻或消除，则个体得到成功“治疗”。

如本文所用，术语“患者”、“个体”和“受试者”可互换使用，并且是指患有疾病或有可能患上疾病的哺乳动物(优选人)。

如本文所用，术语“约”表示指定值加10％或减10％的近似范围。例如，语言“约20％”包涵18％至22％的范围。

如本文所用，术语“半衰期”是指经历衰变(或从样品或患者清除)的物质的量减少一半所需的时间段。

I.含有补体C1q和VWF的复合物

本发明部分基于发现包含VWF和补体C1q的复合物，其降低胆固醇晶体(CC)的吞噬作用。C1q和VWF的结合还调节巨噬细胞的免疫响应，包括巨噬细胞衍生的泡沫细胞。在一些实施方案中，C1q和VWF结合上调巨噬细胞包括巨噬细胞衍生的泡沫细胞的吞噬作用介导受体和共刺激受体的表达。在一些实施方案中，C1q和VWF结合增加了对巨噬细胞(包括巨噬细胞衍生的泡沫细胞)促炎性细胞因子分泌的抑制。

本文提供了治疗方法，其包括施用治疗有效量的包含VWF的组合物，使得VWF结合受试者体内的补体C1q，诸如内源性补体C1q。在一些实施方案中，将重组VWF施用于受试者并与有益于治疗动脉粥样硬化的内源性C1q形成复合物。在一些实施方案中，包含C1q和VWF的复合物减少动脉粥样硬化斑块的炎症。在某些实施方案中，包含C1q和VWF的复合物调节受试者血管中巨噬细胞的免疫响应。在一些情况下，受试者患有动脉粥样硬化或处于患有动脉粥样硬化的风险中。在一些实施方案中，复合物包含C1q、CC和VWF。

在一些实施方案中，包含C1q和VWF的复合物在患有动脉粥样硬化的受试者中介导巨噬细胞对CC的吞噬作用。在一些实施方案中，复合物包含C1q、CC和VWF，其中C1q与VWF和胆固醇晶体的表面两者结合。

用于检测包含C1q和VWF的复合物的方法包括但不限于ELISA、捕获ELISA、蛋白质印迹、免疫测定等。

在捕获ELISA的一些实施方案中，将包含此类复合物的样品添加到96孔微孔板中，所述微孔板在封闭之前已用抗VWF抗体或抗C1q抗体包被。孵育期后，洗涤板并检测VWF和/或C1q的结合。在一些情况下，使用抗人C1q抗体(诸如单克隆小鼠抗人C1q抗体)检测复合物的C1q。在孵育期和洗涤步骤之后，加入可检测部分缀合的山羊抗小鼠二抗，并检测和测量来自可检测部分的信号。在某些情况下，使用抗人VWF抗体诸如多克隆兔抗人VWF抗体检测复合物的VWF。在孵育期和洗涤步骤之后，加入可检测部分缀合的山羊抗兔二抗，并检测和测量来自可检测部分的信号。

在一些实施方案中，包含C1q和VWF的复合物可用于减少、延缓、阻抑、抑制或预防泡沫细胞形成。在一些实施方案中，包含C1q和VWF的复合物有利于减少、延缓、阻抑、抑制或预防与动脉粥样硬化相关的炎症。在某些实施方案中，包含C1q和VWF的复合物具有动脉粥样硬化保护性质。在一些实施方案中，复合物包含C1q、CC和VWF。

在一些实施方案中，包含C1q和VWF的复合物抑制动脉粥样硬化斑块(也称为“动脉粥样硬化病变”)进展。在一些情况下，此类复合物抑制受试者的血管中的包含内膜的脂纹的形成。在某些情况下，此类复合物抑制纤维帽损伤的形成。在一些情况下，此类复合物抑制已建立的动脉粥样硬化病变的形成。在一些实施方案中，包含C1q和VWF的复合物减少包含树突状细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞和T细胞的一种或多种细胞向病变中的募集或浸润。在某些情况下，此类复合物抑制或延缓泡沫细胞的形成。在一些实施方案中，此类复合物抑制易损动脉粥样硬化斑块的形成。在特定实施方案中，此类复合物抑制破裂的动脉粥样硬化斑块的形成。

在一些实施方案中，包含C1q和VWF的复合物降低动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞对炎性响应的激活。在一些实施方案中，包含C1q和VWF的复合物介导动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞上的受体诸如但不限于胞葬作用受体、清道夫受体和共刺激受体的表面表达。

在一些情况下，复合物提高一和或多种选自由以下组成的组的吞噬作用介导受体和共刺激受体的表达水平：CD14、CD86、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、脂蛋白受体相关蛋白1(LRP-1)、酪氨酸蛋白激酶Mer(MerTk)、MHC II、程序性死亡配体1(PD-L1)、清道夫受体A1(SR-A1)和它们的组合。在其他实施方案中，复合物提高一种或多种选自由以下组成的组的吞噬作用介导受体和共刺激受体的表达水平：CD14、CD86、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1；也称为CD305)、脂蛋白受体相关蛋白1(LRP-1；也称为CD91)、酪氨酸蛋白激酶Mer(MerTK)、MHC II、程序性死亡配体1(PD-L1；也称为CD274)、清道夫受体A1(SR-A1；也称为CD204)和它们的组合。

在一些实施方案中，复合物提高胞葬作用受体MerTK的表达水平。

在一些实施方案中，复合物提高一种或多种选自由LRP-1和SR-A1组成的组的清道夫受体的表达水平。在一些情况下，LRP-1的表面表达水平提高。在一些情况下，SR-A1的表面表达水平提高。在某些实施方案中，复合物提高两种选自由LRP-1和SR-A1组成的组的清道夫受体的表达水平。在某些情况下，LRP-1和SR-A1的表面表达水平提高。

在一些实施方案中，复合物提高一种或多种选自由CD14、LAIR1和PD-L1组成的组的共刺激受体的表达水平。在其他实施方案中，复合物提高两种或更多种选自由CD14、LAIR1和PD-L1组成的组的共刺激受体的表达水平。在一些情况下，CD14的表面表达水平提高。在一些情况下，LAIR1的表面表达水平提高。在一些情况下，PD-L1的表面表达水平提高。在某些实施方案中，复合物提高共刺激受体CD14和PD-L1的表达水平。在一些实施方案中，复合物提高共刺激受体CD14和LAIR1的表达水平。在一些实施方案中，复合物提高共刺激受体LAIR1和PD-L1的表达水平。

在一些实施方案中，包含C1q和VWF的复合物提高两种或更多种选自由MerTK、LRP-1、SR-A1、CD14、LAIR1和PD-L1组成的组的受体的表达水平。在一些实施方案中，包含C1q和VWF的复合物提高三种或更多种选自由MerTK、LRP-1、SR-A1、CD14、LAIR1和PD-L1组成的组的受体的表达水平。在一些实施方案中，包含C1q和VWF的复合物提高四种或更多种选自由MerTK、LRP-1、SR-A1、CD14、LAIR1和PD-L1组成的组的受体的表达水平。在一些实施方案中，包含C1q和VWF的复合物提高五种或更多种选自由MerTK、LRP-1、SR-A1、CD14、LAIR1和PD-L1组成的组的受体的表达水平。在一些实施方案中，包含C1q和VWF的复合物提高MerTK、LRP-1、SR-A1、CD14、LAIR1和PD-L1的表达水平。

用于测定巨噬细胞的吞噬作用介导受体的表达水平和共刺激受体的表达水平的方法是本领域技术人员已知的并且测定试剂盒是可商购获得的。检测测定的非限制性实例包括免疫染色、ELISA、FACS分析、蛋白质印迹等。例如，有用的抗体可从R&D Systems、Biolegend、Thermo Fisher Scientific等商购获得。

在一些实施方案中，包含C1q和VWF的复合物减少(降低)由巨噬细胞分泌的促炎性细胞因子。在一些实施方案中，复合物介导一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7或8种)选自由IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-18、IL-1RA、TNF1α和它们的组合组成的组的促炎性细胞因子的分泌。在一些情况下，IL-1α动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的分泌减少。在一些情况下，IL-1β动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的分泌减少。

在一些情况下，IL-6动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的分泌减少。在其他情况下，IL-6动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的分泌增加。在一些情况下，IL-10动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的分泌减少。在其他情况下，IL-10动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的分泌增加。在一些情况下，IL-18动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的分泌减少。在其他情况下，IL-18动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的分泌增加。在一些情况下，IL-1RA动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的分泌减少。在其他情况下，IL-1RA动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的分泌增加。在一些情况下，TNF1α动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的分泌减少。在其他情况下，TNF1α动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的分泌增加。

在一些实施方案中，包含C1q和VWF的复合物减少IL-1β/IL-1RA的比率。在一些实施方案中，包含C1q和VWF的复合物减少IL-1α/IL-1RA的比。

用于测定巨噬细胞分泌促炎性细胞因子的方法是本领域技术人员已知的并且测定试剂盒是可商购获得的。检测测定的非限制性实例包括免疫染色、ELISA、FACS分析、蛋白质印迹等。例如，人IL-1β ELISA试剂盒可从Abcam(目录号ab46052)、Thermo FisherScientific(目录号KHC0011)和Cisbio(目录号62HIL1BPET)获得。示例性人IL-1α ELISA试剂盒可从Abcam(目录号ab178008)、Thermo Fisher Scientific(目录号BMS243-2)和Cisbio(目录号62HIL1APEG)获得。

在一些实施方案中，包含C1q和VWF的复合物降低巨噬细胞中的胱天蛋白酶1激活。在一些实施方案中，复合物介导巨噬细胞中的NLRP3炎性体组装。用于测定半胱天冬酶活性的方法是本领域技术人员已知的并且测定试剂盒是可商购获得的。例如，半胱天冬酶1测定试剂盒可从Abcam(目录号ab39412)、Promega(目录号G9951)和R&D Systems(目录号K111-100)获得。

本文提供了鉴定用于调节巨噬细胞吞噬水平的候选剂的方法。提供了用于筛选候选剂调节巨噬细胞吞噬作用的能力的方法。在一些实施方案中，所述方法还可用于筛选候选剂调节巨噬细胞介导的炎性响应的能力。

在一些实施方案中，所述方法包括用包含重组VWF、重组补体C1q和胆固醇晶体(CC-C1q-VWF)的复合物处理巨噬细胞群；用候选剂治疗产生的巨噬细胞群；以及在一些情况下，测量巨噬细胞群中的吞噬作用的水平，并将吞噬作用水平与未用候选剂处理的对照巨噬细胞群中的吞噬作用水平进行比较。

在一些情况下，所述方法包括测量巨噬细胞群中一种或多种吞噬作用介导受体和/或一种或多种共刺激受体的表达水平，并且将一种或多种吞噬作用介导受体和/或一种或多种共刺激受体的表达水平与未用候选剂处理的对照巨噬细胞群中的一种或多种吞噬作用介导受体和/或一种或多种共刺激受体的表达水平进行比较。在其他情况下，所述方法包括测量巨噬细胞群中一种或多种吞噬作用介导受体的表达水平，并且将一种或多种吞噬作用介导受体的表达水平与未用候选剂处理的对照巨噬细胞群中一种或多种吞噬作用介导受体的表达水平进行比较。在某些情况下，所述方法包括测量巨噬细胞群中一种或多种共刺激受体的表达水平，并且将一种或多种共刺激受体的表达水平与未用候选剂处理的对照巨噬细胞群中一种或多种共刺激受体的表达水平进行比较。在一些实施方案中，一种或多种吞噬作用介导受体和/或一种或多种共刺激受体选自由以下组成的组：CD14、CD86、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、脂蛋白受体相关蛋白1(LRP-1)、酪氨酸蛋白激酶Mer(MerTK)、MHC II、程序性死亡配体1(PD-L1)、清道夫受体A1(SR-A1)和它们的组合。

用于测定吞噬作用的方法是本领域技术人员已知的并且是可商购获得的。用于检测和监测吞噬作用的示例性试剂盒可从Abcam(目录号ab211156)、Thermo FisherScientific(目录号V6694)和Cayman Chemical(目录号500290)获得。

在一些情况下，所述方法包括测量巨噬细胞群中促炎性细胞因子分泌的表达水平，并且将促炎性细胞因子分泌的表达水平与未经候选剂处理的对照巨噬细胞群中促炎性细胞因子分泌的表达水平进行比较。在一些情况下，促炎性细胞因子选自由以下组成的组：IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-18、IL-1R、TNF1α和它们的组合。

在一些实施方案中，本文中的方法中的任一种还包括孵育重组VWF、重组补体C1q和胆固醇晶体以形成CC-C1q-VWF复合物。

II.重组冯维勒布兰德因子

本发明利用包含重组冯维勒布兰德因子(rVWF)的组合物来治疗患有动脉粥样硬化或处于患有动脉粥样硬化风险中的受试者。

在某些实施方案中，本发明的VWF蛋白可包含构建体，例如，如1986年10月23日公布的WO 1986/06096和以Ginsburg等人之名于1990年7月23日提交的美国专利申请序号07/559,509中制备的构建体，所述专利关于产生重组VWF的方法以引用的方式并入本文。对本发明有用的VWF包括所有潜在形式，包括单体和多聚体形式。VWF的一种特别有用的形式是至少两个VWF的同源多聚体(即，至少两个VWF多肽或至少两个VWF单体)。VWF蛋白可以是生物活性衍生物，或当仅用作FVIII的稳定剂时，VWF可以是非生物活性形式。还应当理解，本发明涵盖待组合使用的不同形式的VWF。例如，对本发明有用的VWF可包括不同的多聚体、不同的衍生物和生物活性衍生物与非生物活性衍生物两者。

在初期止血中，VWF充当血小板与胞外基质的特定组分(诸如胶原)之间的桥。在这个过程中VWF的生物活性可通过在不同的体外测定中进行测量(Turecek等人，Semin.Thromb.Hemost.28：149-160，2002)。瑞斯托霉素(ristocetin)辅因子测定基于在VWF的存在下由抗生素瑞斯托霉素诱导的新鲜或福尔马林固定血小板的凝集。

血小板凝集的程度取决于VWF浓度并且可通过比浊法例如通过使用凝集计进行测量(Weiss等人，J.Clin.Invest.52：2708-2716，1973；Macfarlane等人，Thromb.Diath.Haemorrh.34：306-308，1975)。第二种方法是胶原结合测定，其基于ELISA技术(Brown等人，Thromb.Res.43：303-311，1986；Favaloro，Thromb.Haemost.83：127-135，2000)。微孔板上涂覆有I型或III型胶原。然后VWF结合至胶原表面并且随后用酶标多克隆抗体检测。最后一步是底物反应，其可使用ELISA阅读器进行光度监测。如本文所提供，本发明的VWF的瑞斯托霉素辅因子的比活性(VWF：RCo)通常以VWF的mU/μg来描述，如使用体外测定所测量。

本发明的rVWF组合物相对于pdVWF的优点是rVWF表现出比pdVWF更高的比活性。在一些实施方案中，本发明的rVWF具有至少约20、22.5、25、27.5、30、32.5、35、37.5、40、42.5、45、47.5、50、52.5、55、57.5、60、62.5、65、67.5、70、72.5、75、77.5、80、82.5、85、87.5、90、92.5、95、97.5、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150mU/μg或更高的比活性。

本发明的rVWF是包含约10至约40个亚基的高度多聚体。在其他实施方案中，使用本发明的方法产生的多聚体rVWF包含约10-30、12-28、14-26、16-24、18-22或20-21个亚基。在其他实施方案中，rVWF以大小从二聚体至超过40个亚基的多聚体(＞1000万道尔顿)不等的多聚体存在。最大的多聚体提供可与血小板受体和损伤的内皮下基质位点两者相互作用的多结合位点，并且是VWF最具止血活性的形式。ADAMTS13的应用随时间推移将裂解超大rVWF多聚体，但在产生期间(通常通过在细胞培养物中表达)，本发明的rVWF组合物通常不会暴露于ADAMTS13并保留其高度多聚体结构。

在一个实施方案中，本文所述的方法中使用的rVWF组合物具有特征如下的rVWF寡聚体分布：95％的寡聚体具有6个亚基至20个亚基。在其他实施方案中，rVWF组合物具有特征如下的rVWF寡聚体分布：95％的寡聚体具有一系列选自在WO 2012/171031的表2(其出于所有目的以引用的方式并入本文)中发现的变动458至641的亚基。

在一个实施方案中，rVWF组合物可根据以特定更高阶的rVWF多聚体或更大的多聚体存在的rVWF分子的百分比表征。例如，在一个实施方案中，本文所述的方法中使用的rVWF组合物的至少20％的rVWF分子以至少10个亚基的寡聚复合物存在。在另一个实施方案中，本文所述的方法中使用的rVWF组合物的至少20％的rVWF分子以至少12个亚基的寡聚复合物存在。在其他实施方案中，本文提供的方法中使用的rVWF组合物具有最小百分比(例如，具有至少X％)的根据表3至表5(其出于所有目的以引用的方式整体并入本文)中发现的变化形式134至457中的任一者的以特定更高阶的rVWF多聚体或更大的多聚体(例如，至少Y个亚基的多聚体)存在的rVWF分子。

根据上文，施用于受试者(有或没有FVIII)的rVWF组合物通常包含显著百分比的高分子量(HMW)rVWF多聚体。在其他实施方案中，HMW rVWF多聚体组合物包含至少10％-80％rVWF十聚体或更高阶的多聚体。在其他实施方案中，组合物包含约10％-95％、20％-90％、30％-85％、40％-80％、50％-75％或60％-70％十聚体或更高阶的多聚体。在其他实施方案中，HMW rVWF多聚体组合物包含约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％十聚体或更高阶的多聚体。

rVWF多聚体的数量和百分比的评估可使用本领域已知的方法进行，包括但不限于使用电泳和尺寸排阻色谱法按大小分离VWF多聚体的方法，例如如Cumming等人所讨论的，(J Clin Pathol.1993年五月；46(5)：470-473，所述文献出于所有目的且特别是针对涉及VWF多聚体评估的所有教义，在此以引用的方式整体并入)。此类技术还可包括免疫印迹技术(诸如蛋白质印迹)，其中凝胶用放射性标记的抗VWF抗体进行免疫印迹，随后进行化学发光检测(参见例如Wen，等人，(1993)，J.Clin.Lab.Anal.，7：317-323，所述文献出于所有目的且特别是针对涉及VWF多聚体评估的所有教义，在此以引用的方式整体并入)。VWF的其他测定包括VWF：抗原(VWF:Ag)、VWF：瑞斯托霉素辅因子(VWF:RCof)和VWF：胶原结合活性测定(VWF:CBA)，其通常用于血管性血友病的诊断和分类(参见例如Favaloro，等人，Pathology，1997，29(4)：341-456，所述文献出于所有目的且特别是针对涉及VWF的测定的所有教义，在此以引用的方式整体并入)。

在其他实施方案中，本发明的更阶的rVWF多聚体在施用后约1小时至约90小时是稳定的。在再其他实施方案中，更高阶的rVWF多聚体在施用后约5-80、10-70、15-60、20-50、25-40或30-35小时是稳定的。在其他实施方案中，更高阶的rVWF多聚体在施用后至少3、6、12、18、24、36、48或72小时是稳定的。在某些实施方案中，rVWF多聚体的稳定性在体外评估。

在一个实施方案中，本文提供的组合物和方法中使用的更高阶的rVWF多聚体在施用后具有至少12小时的半衰期。在另一个实施方案中，更高阶的rVWF多聚体在施用后具有至少24小时的半衰期。在其他实施方案中，更高阶的rVWF多聚体具有选自在WO 2012/171031的表6(其出于所有目的以引用的方式整体并入本文)中发现的变化形式642至1045的半衰期。

在特定方面，根据本发明使用的rVWF(无血浆或重组形式，包括根据本发明纯化的原rVWF和/或纯化的rVWF)未用任何缀合、翻译后或共价修饰进行修饰。在特定的实施方案中，本发明的rVWF未用水溶性聚合物进行修饰，所述水溶性聚合物包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、聚唾液酸、羟乙基淀粉、碳水化合物部分等。在一些实施方案中，根据本发明使用的无血浆VWF未用任何缀合、翻译后或共价修饰进行修饰。

在其他方面，根据本发明使用的rVWF(无血浆或重组形式，包括根据本发明纯化的原rVWF和/或纯化的rVWF)通过缀合、翻译后修饰或共价修饰(包括N或C末端残基的修饰以及所选侧链的修饰，例如在游离巯基、伯胺和羟基处的修饰)进行修饰。在一个实施方案中，水溶性聚合物通过赖氨酸基团或其他伯胺连接至蛋白质(直接或经由接头)。在一个实施方案中，本发明的rVWF蛋白可通过水溶性聚合物的缀合进行修饰，所述水溶性聚合物包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、聚唾液酸、羟乙基淀粉、碳水化合物部分等。

可用来修饰rVWF和/或FVIII的水溶性聚合物包括直链和支链结构。缀合的聚合物可直接附接至本发明的凝血蛋白，或者可选地可通过连接部分附接。蛋白质与水溶性聚合物缀合的非限制性实例可在美国专利号4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192和4,179,337以及Abuchowski和Davis“Enzymes as Drugs，”；Holcenberg和Roberts编著，第367 383页；John Wiley和Sons，New York(1981)；和Hermanson G.，Bioconjugate Techniques第2版，Academic Press，Inc.2008中发现。

蛋白质缀合可通过本领域中许多众所周知的技术来进行，例如，参见HermansonG.，Bioconjugate Techniques第2版，Academic Press，Inc.2008。实例包括通过凝血蛋白或水溶性聚合物部分中的一个上的羧基与另一个的胺基团之间的肽键的键联，或其中一个的羧基与另一个的羟基之间的酯键联。本发明的凝血蛋白可与水溶性聚合物化合物缀合的另一种键联是经由席夫碱(Schiffbase)，例如，由聚合物部分上的游离氨基与通过高碘酸盐氧化在蛋白质的非还原端形成的醛基反应形成的席夫碱(Jennings和Lugowski，J.Immunol.1981；127：1011-8；Femandes和Gregonradis，Biochim Biophys Acta.1997；1341；26-34)。所产生的席夫碱可通过用NaCNBH

在一些方面，本发明的方法中使用的rVWF已在体外用弗林蛋白酶成熟。在其他实施方案中，弗林蛋白酶是重组弗林蛋白酶。在一些实施方案中，rVWF使用弗林蛋白酶和色谱法成熟。

在其他方面，本发明方法中使用的rVWF通过使用本领域已知的方法在哺乳动物细胞培养物中表达产生。在特定实施方案中，哺乳动物培养物包含CHO细胞。在示例性实施方案中，本发明的rVWF包含从CHO细胞表达系统分离而来的rVWF蛋白。在其他实施方案中，前肽去除通过将原VWF暴露于弗林蛋白酶而在体外介导；在又一个实施方案中，用于前肽去除的弗林蛋白酶是重组弗林蛋白酶。在又一个实施方案中，不存在完全糖基化/ABO血型聚糖。

在又其他实施方案中，在本发明的方法和组合物中使用的rVWF通过在合适的真核宿主系统中表达而产生。真核细胞的实例包括但不限于哺乳动物细胞，诸如CHO、COS、HEK293、BHK、SK-Hep以及HepG2；昆虫细胞，例如SF9细胞、SF21细胞、S2细胞以及High Five细胞；以及酵母细胞，例如酵母属(Saccharomyces)细胞或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)细胞。在一个实施方案中，VWF可在酵母细胞、昆虫细胞、禽类细胞、哺乳动物细胞等中表达。例如，在人细胞系、仓鼠细胞系或鼠类细胞系中。在一个特定实施方案中，所述细胞系是CHO、BHK或HEK细胞系。典型地，哺乳动物细胞，例如来自连续细胞系的CHO细胞，可用于表达本发明的VWF。

在某些实施方案中，包含编码VWF的序列的核酸序列可以是载体。载体可由病毒递送或可以是质粒。编码所述蛋白质的核酸序列可以是特定基因或其生物学功能部分。在一个实施方案中，蛋白质至少是VWF的生物学活性部分。多种载体可用于VWF的表达并且可选自真核和原核表达载体。真核表达载体的实例包括：(i)对于在酵母中表达，如pAO、pPIC、pYES、pMET的载体，使用诸如AOX1、GAP、GAL1、AUG1等的启动子；(ii)对于在昆虫细胞中表达，诸如pMT、pAc5、pIB、pMIB、pBAC等的载体，使用如PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64、polh等的启动子，并且(iii)对于在哺乳动物细胞中表达，诸如pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、pBPV等的载体和来源于病毒系统(诸如牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、反转录病毒等)的载体，使用诸如CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV以及β-肌动蛋白的启动子。

在本发明的一些实施方案中，核酸序列进一步包含适用于受控蛋白质表达的其他序列，诸如启动子序列、增强子、TATA盒、转录起始位点、多接头、限制性位点、聚A序列、蛋白质加工序列、选择标志物等，其通常时本领域的普通技术人员已知的。

在某些实施方案中，本发明的细胞培方法可包含使用微载剂。在一些实施方案中，实施方案的细胞培养可在适于提供高体积-比培养表面积的条件下于大型生物反应器中进行以获得高细胞密度和蛋白质表达。一种提供所述生长条件的手段是在搅拌槽生物反应器中使用微载剂进行细胞培养。细胞在微载剂上生长的概念首先由van Wezel(van Wezel，A.L.，Nature 216：64-5(1967))描述并且允许细胞附着在悬浮于生长培养基中的小固体颗粒表面上。这些方法提供高表面与体积比并且因此允许有效的营养物利用。此外，对于在真核细胞系中表达分泌蛋白，表面与体积比增大允许较高程度的分泌并且因此在培养物上清液中的蛋白质产率较高。最后，这些方法允许真核表达培养容易地按比例扩大。

表达rVWF的细胞可在细胞培养生长期间结合至球形或多孔微载剂。微载剂可以是选自基于葡聚糖、胶原、塑料、明胶和纤维素以及其他如Butler(In：Spier&Griffiths，Animal Cell Biotechnology 3：283-303(1988))中所描述的微载剂组的微载剂。还可能使细胞在球形微载体上生长至某一生物量并且当它们已达到最终发酵罐生物量时且在多孔微载剂上产生表达蛋白之前继代培养细胞，或反之亦然。合适的球形微载剂可包括光滑表面微载剂，诸如Cytodex

在某些实施方案中，rVWF在产生高分子量rVWF的细胞培养基中培养的细胞中表达。术语“细胞培养液”、“细胞培养基”和“细胞培养上清液”是指本领域通常众所周知的细胞培养过程的各个方面。在本发明的上下文中，细胞培养液可包括细胞培养基和细胞培养上清液。从外部向细胞培养液添加细胞培养基，任选地与补充剂一起，以提供用于培养表达VWF的细胞的营养物和其他组分。细胞培养上清液是指包含来自细胞培养基的营养物和其他组分以及在培养期间从细胞释放的、代谢的和/或分泌的产物的细胞培养液。在其他实施方案中，培养基可是不含动物蛋白的并且是化学定义的。制备不含动物蛋白且化学限定的培养基的方法是本领域中已知的，例如US 2008/0009040和US 2007/0212770中的方法，所述专利均出于所有目的且特别是针对涉及细胞培养基的所有教义并入本文。“不含蛋白质”和相关术语是指来自由培养物中的细胞外源性或除培养物中的细胞以外的来源的蛋白质，其中所述细胞在生长期间天然排出蛋白质。在另一个实施方案中，培养基不含多肽。在另一个实施方案中，培养基不含血清。在另一个实施方案中，培养基不含动物蛋白。在另一个实施方案中，培养基不含动物组分。在另一个实施方案中，培养基含有蛋白质，例如来自血清(诸如胎牛血清)的动物蛋白。在另一个实施方案中，培养物具有外源添加的重组蛋白。在另一个实施方案中，蛋白质来自经证明的无病原体动物。如本文所使用的术语“化学定义的”应表示培养基不包含任何未定义的补充剂，诸如动物组分、器官、腺体、植物或酵母的提取物。因此，化学定义的培养基的每个组分都是精确确定的。在一个优选的实施方案中，培养基不含动物组分且不含蛋白质。

在其他实施方案中，在从哺乳动物细胞培养物中纯化之后，在施用之前复原rFVIII。在再其他实施方案中，在复原之前或之后用弗林蛋白酶处理rVWF。在其他实施方案中，弗林蛋白酶是重组弗林蛋白酶。在再其他实施方案中，本发明的rVWF不暴露于ADAMTS13，因此本发明的rVWF组合物中存在超大多聚体(即，包含10个或更多个亚基)。

在特定方面，本发明的方法中使用的rVWF包含在含有缓冲液、糖和/或糖醇(包括但不限于海藻糖和甘露糖醇)、稳定剂(诸如甘氨酸)和表面活性剂(诸如聚山梨醇酯80)的制剂中。在其他实施方案中，对于含有rFVIII的制剂，所述制剂还可包含钠、组氨酸、钙和谷胱甘肽。

在一个方面，包含rVWF的制剂在施用之前冻干。冻干是使用本领域常见的技术进行的，并且应该针对正在开发的组合物进行优化(Tang等人，Pharm Res.21：191-200.(2004)和Chang等人，Pharm Res.13：243-9(1996))。

本方法还提供了用于本文所提供的治疗方法的rVWF的制剂。在一些实施方案中，rVWF组合物用于药物组合物的生产。在一些实施方案中，rVWF可配制为冻干制剂。

在一些实施方案中，包含本发明的VWF多肽的制剂在纯化之后且在施用于受试者之前冻干。冻干是使用本领域常见的技术进行的，并且应该针对正在开发的组合物进行优化(Tang等人，Pharm Res.21：191-200.(2004)和Chang等人，Pharm Res.13：243-9(1996))。

在一个方面，冻干周期由三个步骤构成：冷冻、初次干燥和二次干燥(A.P.Mackenzie，Phil Trans R Soc London，Ser B，Biol 278：167(1977))。在冷冻步骤中，将溶液冷却以开始结冰。此外，这个步骤诱导增量剂的结晶。冰在初次干燥阶段升华，其通过将腔室压力降低至冰的蒸汽压以下进行，使用真空并引入热量以促进升华。最后，在二次干燥阶段于降低的腔室压力和升高的搁板温度下去除吸附或结合水。所述过程产生称为冻干饼的材料。此后，可用无菌水或合适的注射用稀释剂将饼复原。

冻干周期不仅确定赋形剂的最终物理状态，而且影响其他参数，诸如复原时间、外观、稳定性和最终含水量。冻结状态下的组合物结构通过在特定温度下发生的几次转变(例如，玻璃化转变、润湿和结晶)进行，并且所述结构可用于理解和优化冻干过程。玻璃化转变温度(Tg和/或Tg′)可提供关于溶质物理状态的信息，并可通过差示扫描量热法(DSC)测定。Tg和Tg′是设计冻干周期时必须考虑的重要参数。例如，Tg′对于初次干燥很重要。此外，在干燥状态下，玻璃化转变温度提供有关最终产品的储存温度的信息。

制备药物制剂的方法可包括以下步骤中的一个或多个：在冻干之前将本文所述的稳定剂添加至所述混合物中；在冻干之前将选自增量剂、同渗浓摩调节剂和表面活性剂的至少一种剂(其各自如本文所述)添加至所述混合物中。在一个方面，冻干制剂至少由缓冲剂、增量剂和稳定剂中的一种或多种构成。在这个方面中，在冻干步骤期间或在复原期间聚集成为问题的情况下评价并选择表面活性剂的实用性。包含适当缓冲剂以使制剂在冻干期间保持在稳定pH范围内。

冻干材料的标准复原实践是添加回一定体积的纯水或无菌注射用水(WFI)(通常等于在冻干期间所移除的体积)，但是在用于胃肠外施用的药物的产生中有时使用抗细菌剂的稀溶液(Chen，Drug Development and Industrial Pharmacy，18：1311-1354(1992))。因此，提供了用于制备复原的重组VWF组合物的方法，其包括将稀释剂添加至本发明的冻干重组VWF组合物中的步骤。

冻干材料可复原为水溶液。多种水性载剂，例如无菌注射用水、供多剂量使用的含防腐剂的水、或含适当量的表面活性剂的水(例如，含有与适于制备水性混悬液的赋形剂混合的活性化合物的水性混悬液)。在各种方面中，所述赋形剂使助悬剂，例如但不限于羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、褐藻酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮、黄蓍胶以及阿拉伯胶；分散或润湿剂是天然存在的磷脂，例如但不限于卵磷脂；或环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如但不限于聚氧乙烯硬脂酸酯；或环氧乙烷与长链脂肪族醇的缩合产物，例如但不限于十七亚乙基氧基十六醇；或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，诸如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯；或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如但不限于聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。在多个方面中，水性悬浮液还含有一种或多种防腐剂，例如但不限于对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯。

在某些实施方案中，本发明的组合物是使用注射器或其他储存器皿施用的液体制剂。在其他实施方案中，这些液体制剂由复原为水溶液的本文所述的冻干材料制备。

在另一方面，本发明的组合物还包含一种或多种药学上可接受的载剂。短语“药学上”或“药理学上”可接受的是指分子实体和组合物是稳定的，可抑制蛋白质降解诸如聚集并裂解产物，并且另外如下所述在使用本领域中众所周知的途径施用时不产生过敏，或其他不良反应。“药学上可接受的载剂”包括任何和所有临床上有用的溶剂、分散介质、涂料、抗细菌及抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等，包括以上公开的那些剂。

III.重组VWF的产生

本发明的游离成熟重组冯维勒布兰德因子(rVWF)可重组产生。本领域技术人员能认识到在宿主细胞中表达重组蛋白的有用的方法。在一些情况下，所述方法包括在宿主细胞诸如CHO细胞中表达编码rVWF的核酸序列以及在某些条件下培养所得宿主细胞以产生rVWF、前原VWF、原VWF等。

在某些实施方案中，表达rVWF的细胞培养物可保持至少约7天，或至少约14天、21天、28天，或至少约5周、6周、7周，或至少约2个月，或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个月或更长时间。为产生重组VWF蛋白而保持细胞培养物的细胞密度将取决于用于蛋白质表达的培养条件和培养基。本领域技术人员将能够容易地测定产生rVWF的细胞培养物的最佳细胞密度。在一个实施方案中，将培养物长时间段保持在约0.5x10

在特定的实施方案中，将用于产生rVWF的连续细胞培养物的细胞密度长时间段保持在不超过2.5x10

在上述细胞培养物的一个实施方案中，细胞培养液包含有包含铜的培养基补充剂。此类细胞培养液描述于例如美国专利号8,852,888和美国专利号9,409,971中，所述专利出于所有目的且特别是针对涉及用于产生重组VWF的细胞培养方法和组合物的所有教义，在此以引用的方式整体并入。

前原VWF的多核苷酸和氨基酸序列分别在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中列出，并且可分别在GenBank登录号NM_000552(智人冯维勒布兰德因子(VWF)mRNA)和NP_000543处获得。对应于成熟VWF蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO：3中列出(对应于全长前原VWF氨基酸序列的氨基酸764-2813)。在一些实施方案中，VWF表现出至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％与SEQ ID NO：3的序列同一性。在一些实施方案中，本发明的rVWF表现出至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％与SEQ ID NO：3的序列同一性。参见例如美国专利号8,597,910、美国专利公布号2016/0129090以及图6。

有用rVWF的一种形式至少具有使至少一种因子VIII(FVIII)分子在体内稳定(例如，结合)并任选地具有药理学上可接受的糖基化谱的性质。其具体实例包括无A2结构域因此抗蛋白水解的VWF(Lankhof等人，Thromb.Haemost.77：1008-1013，1997)，和从Val 449至Asn 730的VWF片段(包括糖蛋白lb结合域和胶原与肝素的结合位点)(Pietu等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.164：1339-1347，1989)。在一个方面，VWF稳定至少一种FVIII分子的能力的测定根据本领域中现有状态下已知的方法在VWF缺乏哺乳动物中进行。

本发明的rVWF可通过本领域已知的任何方法产生。一个特定的实例在1986年10月23日公布的WO86/06096和1990年7月23日提交的美国专利申请号07/559,509中公开，所述专利关于生产重组VWF的方法以引用的方式并入本文。因此，本领域已知用于以下的方法：(i)通过基因工程例如经由RNA的逆转录和/或DNA的扩增产生重组DNA，(ii)通过转染例如经由电穿孔或显微注射将重组DNA引入原核或真核细胞，(iii)例如以连续或分批方式培养转化的细胞，(iv)例如组成性或诱导后表达VWF，以及(v)例如从培养基中或通过收获转化的细胞分离VWF，以便(vi)例如经由阴离子交换色谱或亲和色谱获得纯化的rVWF。在一个方面，使用本领域众所周知的重组DNA技术在转化的宿主细胞中制备重组VWF。例如，可使用合适的限制性酶从DNA中切除编码多肽的序列。可选地，在另一个方面，所述DNA分子可使用化学合成技术诸如氨基磷酸酯方法合成。另外，在再一方面，使用这些技术的组合。

本发明还提供了在适当的宿主中编码本发明多肽的载体。载体包含编码可操作地连接至适当的表达控制序列的多肽的多核苷酸。在将多核苷酸插入所述载体之前或之后实行这种操作性连接的方法是众所周知的。表达控制序列包括启动子、活化子、增强子、操纵子、核糖体结合位点、起始信号、停止信号、cap信号、多腺苷酸化信号和其他涉及转录或翻译控制的信号。其中具有所述多核苷酸的所得载体用来转化适当的宿主。这种转化可使用本领域众所周知的方法进行。

在本发明的实践中使用大量可用的和众所周知的宿主细胞中的任一种。特定宿主的选择取决于本领域认识到的多种因素，包括例如与所选表达载体的相容性、DNA分子所编码的肽的毒性、转化率、肽的易回收性、表达特征、生物安全性和成本。必须在了解并非所有宿主细胞都同样有效地表达特定DNA序列的前提下，对这些因素权衡利弊。在这些一般指导内，有用的微生物宿主细胞包括但不限于培养中的细菌、酵母和其他真菌、昆虫、植物、哺乳动物(包括人)细胞或本领域已知的其他宿主。

在常规发酵条件下培养转化的宿主细胞，以便表达所期望的化合物。此类发酵条件是本领域众所周知的。最后，通过本领域众所周知的方法从培养基或宿主细胞本身纯化多肽。

根据用于表达本发明化合物的宿主细胞，将碳水化合物(寡糖)基团任选地附接至已知是蛋白质中糖基化位点的位点。通常地，当O-连接寡糖和N-连接寡糖是序列Asn-X-Ser/Thr的部分时(其中X可以是除了脯氨酸以外的任何氨基酸)，O-连接寡糖附接至丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基，而N-连接寡糖附接至天冬酰胺(Asn)残基。X优选是除脯氨酸以外的19个天然氨基酸之一。N-连接和O-连接寡糖以及在各类型中存在的糖残基的结构是不同的。一种常在N-连接和O-连接寡糖两者中发现的类型的糖是N-乙酰神经氨酸(称为唾液酸)。唾液酸通常是N-连接和O-连接寡糖两者的末端残基，并且在一个方面可凭借其负电荷对糖基化化合物赋予酸性性质。此类位点可掺入本发明的化合物的接头中并且优选在多肽化合物的重组制造期间通过细胞来糖基化(例如，在诸如CHO、BHK、COS的哺乳动物细胞中)。在其他方面，通过本领域已知的合成或半合成程序使此类位点糖基化。

在一些实施方案中，可作为本文所述的纯化程序(包括阴离子交换、阳离子交换、尺寸排阻和/或免疫亲和方法)的一部分在柱上进行唾液酸化(sialysation)(也称为唾液酸化(sialylation))。在一些实施方案中，相比于未经历唾液酸化的rVWF，唾液酸化使rVWF的稳定性增加。在一些实施方案中，相比于未经历唾液酸化的rVWF，唾液酸化使血液循环中rVWF(例如，在向受试者施用之后)的稳定性增加。在一些实施方案中，相比于未进行唾液酸化的rVWF，唾液酸化的rVWF的稳定性增加导致增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施方案中，相比于未经历唾液酸化的rVWF，唾液酸化使rVWF的半衰期增加。在一些实施方案中，相比于未经历唾液酸化的rVWF，唾液酸化使血液循环中rVWF(例如，向受试者施用之后)的半衰期增加。在一些实施方案中，相比于未进行唾液酸化的rVWF，唾液酸化的rVWF半衰期增加导致增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施方案中，相比于未经历唾液酸化的rVWF，唾液酸化的rVWF的半衰期增加使血液循环中rVWF(例如，在向受试者施用之后)稳定1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、12小时、24小时或更久。

在一些实施方案中，唾液酸化增加了2，3唾液酸化和/或2，6唾液酸化的数目。在一些实施方案中，作为另外的缓冲步骤，通过添加2，3唾液酸转移酶和/或2，6唾液酸转移酶和CMP-NANA(胞苷-5′-单磷酸-N-乙酰神经氨酸钠盐)来增加唾液酸化。在一些实施方案中，作为另外的缓冲步骤，通过添加2，3唾液酸转移酶和CMP-NANA(胞苷-5′-单磷酸-N-乙酰神经氨酸钠盐)来增加唾液酸化。在一些实施方案中，作为另外的缓冲步骤，通过添加2，6唾液酸转移酶和CMP-NANA(胞苷-5′-单磷酸-N-乙酰神经氨酸钠盐)来增加2，6唾液酸化。

在一些实施方案中，CMP-NANA被化学或酶促修饰以将修饰的唾液酸转移到潜在的游离位置。在一些实施方案中，唾液酸化通过以下步骤进行：将rVWF加载到树脂上，用本文所述的一种或多种缓冲液洗涤以去除不需要的杂质，在允许额外唾液酸化的条件下应用一种或多种含有唾液酸转移酶和CMP-NANA的缓冲液，并用一种或多种缓冲液洗涤以耗竭过量的唾液酸化试剂，并用一种或多种缓冲液洗脱增强的rVWF(例如，唾液酸化增加的rVWF)。在一些实施方案中，如本文所述，唾液酸化过程作为阳离子交换方法、阴离子交换方法、尺寸排阻方法或免疫亲和纯化方法的一部分进行。

可选地，通过使用例如固相合成技术的合成方法制备化合物。合适的技术在本领域是众所周知的，并且包括Merrifield(1973)，Chem.Polypeptides，第335-61页(Katsoyannis和Panayotis编著)；Merrifield(1963)，J.Am.Chem.Soc.85：2149；Davis等人(1985)，Biochem.Intl.10：394-414；Stewart和Young(1969)，Solid Phase PeptideSynthesis；美国专利号3,941,763；Finn等人(1976)，The Proteins(第3版)2：105-253；以及Erickson等人(1976)，The Proteins(3rd ed.)2：257-527′。固相合成是制备单个肽的优选技术，因为其是制备小肽的最具成本效益的方法。

VWF的片段、变体和类似物可根据本领域众所周知的方法产生。可使用但不限于酶法分析产物(例如，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)以及还使用重组手段以产生具有特定氨基酸序列的多肽片段来制备多肽片段。可产生包含具有特定活性的蛋白质区域，诸如多聚化结构域或本领域已知的任何其他可鉴定的VWF结构域的多肽片段。

制备多肽类似物的方法也是众所周知的。多肽的氨基酸序列类似物可以是取代、插入、添加或缺失类似物。缺失类似物(包括多肽的片段)缺乏天然蛋白的一个或多个残基，所述残基对功能或免疫原性活性不是必需的。插入类似物涉及在多肽的非末端点添加例如一个或多个氨基酸。这种似物可包括，例如但不限于免疫反应性表位或仅单个残基的插入。添加类似物(包括多肽的片段)包括在蛋白质的一个或两个末端添加一个或多个氨基酸，并且包括例如融合蛋白。还设想了上述类似物的组合。

取代类似物通常在蛋白质内的一个或多个位点将野生型的一个氨基酸与另一个氨基酸交换，并且可被设计来调节多肽的一种或多种性质而不完全丧失其他功能或性质。在一个方面，取代是保守取代。“保守氨基酸取代”是氨基酸被具有侧链或类似化学特征的氨基酸取代。用于进行保守取代的类似氨基酸包括具有酸性侧链(谷氨酸、天冬氨酸)；碱性侧链(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)；极性酰胺侧链(谷氨酰胺、天冬酰胺)；疏水性脂肪族侧链(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸)；芳香族侧链(苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)；小侧链(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸)；或脂族羟基侧链(丝氨酸、苏氨酸)的那些氨基酸。

在一个方面，类似物与衍生它们的重组VWF基本上同源或基本上相同。类似物包括至少保留野生型多肽的一些生物活性，例如血凝活性的那些类似物。

设想的多肽变体包括但不限于通过诸如泛素化、糖基化(包括聚唾液酸化(polysialation)(或聚唾液酸化(polysialylation)))、与治疗剂或诊断剂缀合、标记、共价聚合物附接诸如聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生化)、引入不可水解键以及通过氨基酸(诸如鸟氨酸)的化学合成的插入或取代的技术进行化学修饰的多肽，所述多肽通常不会出现在人蛋白质中。变体保留了与本发明的未修饰分子相同或基本上相同的结合性质。此类化学修饰可包括剂与VWF多肽直接或间接(例如，经由接头)的附接。在间接附接的情况下，设想接头可以是可水解的或不可水解的。

在一个方面，制备聚乙二醇化的多肽类似物包括以下步骤：(a)使多肽与聚乙二醇(诸如PEG的反应性酯或醛衍生物)在使得结合构建体多肽附接至一个或多个PEG基团的条件下反应，以及(b)获得一种或多种反应产物。一般来讲，用于酰化反应的最佳反应条件基于已知参数和所期望的结果确定。例如，PEG：蛋白质的比越大，聚聚乙二醇化(poly-pegylated)产物的百分比就越大。在一些实施方案中，结合构建体在N-末端具有单个PEG部分。聚乙二醇(PEG)可附接至血凝因子以例如提供更长的体内半衰期。PEG基团可具有任何适当的分子量并且是直链或支链的。PEG的平均分子量范围为约2千道尔顿(“kD”)至约100kDa、约5kDa至约50kDa，或约5kDa至约10kDa。在某些方面，PEG基团经由通过PEG部分上的天然或工程化反应性基团(例如醛、氨基、硫醇或酯基团)至血凝因子上的反应性基团(例如醛、氨基或酯基团)的酰化或还原烷基化或通过本领域已知的任何其他技术来附接至血凝因子。

用于制备聚唾液酸化多肽的方法描述于美国专利公布20060160948，Fernandes等人，Gregoriadis；Biochim.Biophys.Acta 1341：26-34，1997和Saenko等人，Haemophilia12：42-51，2006。简而言之，将含有0.1M NaIO

在另一个方面，还设想了前原VWF和原VWF多肽将在本发明的制剂中提供治疗益处。例如，美国专利号7,005,502描述了一种包含大量的在体外诱导凝血酶产生的原VWF的药物制剂。除了天然存在的成熟VWF的重组生物活性片段、变体或其他类似物之外，本发明还设想在本文所述的制剂中使用前原VWF(在SEQ ID NO：2中列出)或原VWF多肽(SEQ IDNO：2的氨基酸残基23至764)的重组生物活性片段、变体或类似物。

编码片段、变体和类似物的多核苷酸可容易地由技术人员产生，以编码具有与天然存在的分子相同或类似生物活性的天然存在的分子的生物活性片段、变体或类似物。在多个方面，使用PCR技术、DNA编码分子的消化/连接等制备这些多核苷酸。因此，本领域技术人员将能够使用本领域已知的任何方法(包括但不限于定点诱变)在DNA链中产生单个碱基变化，以产生密码子改变和错义突变。如本文所用，短语“适度严格的杂交条件”意指例如在42℃下于50％甲酰胺中杂交并在60℃下于0.1×SSC、0.1％SDS中洗涤。本领域技术人员应理解，这些条件的变动基于待杂交的序列的长度和GC核苷酸碱基含量而发生。本领域中的公式标准适合于确定精确的杂交条件。参见Sambrook等人，9.47-9.51 in MolecularCloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)。

A.

rVWF多聚体的数目和百分比的评估可使用本领域已知的方法进行，包括但不限于使用电泳和尺寸排阻色谱法按大小分离VWF多聚体的方法，例如如Cumming等人所讨论的，(J Clin Pathol.，1993年五月；46(5)：470-473，所述文献出于所有目的且特别是针对涉及VWF多聚体评估的所有教义，在此以引用的方式整体并入)。此类技术还可包括免疫印迹技术(诸如蛋白质印迹)，其中凝胶用放射性标记的抗VWF抗体进行免疫印迹，随后进行化学发光检测(参见例如Wen，等人，J.Clin.Lab.Anal.，1993，7：317-323，所述文献出于所有目的且特别是针对涉及VWF多聚体评估的所有教义，在此以引用的方式整体并入)。VWF的其他测定包括VWF：抗原(VWF:Ag)、VWF：瑞斯托霉素辅因子(VWF:RCof)和VWF：胶原结合活性测定(VWF:CBA)，其通常用于血管性血友病的诊断和分类(参见例如Favaloro，等人，Pathology，1997，29(4)：341-456；Sadler，JE，Annu Rev Biochem，1998，67：395-424；和Turecek，等人，Semin Thromb Hemost，2010，36：510-521，所述文献出于所有目的且特别是针对涉及VWF的测定的所有教义，在此以引用的方式整体并入)。在一些实施方案中，使用本发明方法获得的rVWF包括存在于rVWF加载样品中的任何多聚体模式。在一些实施方案中，使用本发明方法获得的rVWF包括生理上存在的多聚体模式以及超大VWF多聚体模式。

b.

在初期止血中，VWF充当血小板与胞外基质的特定组分(诸如胶原)之间的桥。V WF在这个过程中的生物活性可通过不同的体外测定测量(Turecek等人，Semin ThrombHemost，2010，36：510-521)。

VWF：瑞斯托霉素辅因子(VWF:RCof)测定基于在VWF的存在下由抗生素瑞斯托霉素诱导的新鲜或福尔马林固定血小板的凝集。血小板凝集的程度取决于VWF浓度并且可通过比浊法例如通过使用凝集计进行测量(Weiss等人，J.Clin.Invest.，1973，52：2708-2716；Macfarlane等人，Thromb.Diath.Haemorrh.，1975，34：306-308)。如本文所提供，本发明的VWF的瑞斯托霉素辅因子的比活性(VWF:RCo)通常以VWF的mU/μg来描述，如使用体外测定所测量。

在一些实施方案中，根据本发明的方法纯化的rVWF具有至少约20、22.5、25、27.5、30、32.5、35、37.5、40、42.5、45、47.5、50、52.5、55、57.5、60、62.5、65、67.5、70、72.5、75、77.5、80、82.5、85、87.5、90、92.5、95、97.5、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150mU/μg或更高的比活性。在一些实施方案中，本文所述的方法中使用的rVWF具有20mU/μg至150mU/μg的比活性。在一些实施方案中，rVWF具有30mU/μg至120mU/μg的比活性。在一些实施方案中，rVWF具有40mU/μg至90mU/μg的比活性。在一些实施方案中，rVWF具有选自下表3中发现的变化形式1至133的比活性。

表3.本文提供的组合物中发现的和本文提供的方法中使用的rVWF比活性的示例性实施方案。

Var.＝变化形式

本发明的rVWF是包含约10至约40个亚基的高度多聚体。在其他实施方案中，使用本发明的方法产生的多聚体rVWF包含约10-30、12-28、14-26、16-24、18-22或20-21个亚基。在一些实施方案中，rVWF以大小从二聚体至超过40个亚基的多聚体(＞1000万道尔顿)不等的多聚体存在。最大的多聚体提供可与血小板受体和损伤的内皮下基质位点两者相互作用的多结合位点，并且是VWF最具止血活性的形式。在一些实施方案中，本发明的rVWF包含超大多聚体(ULM)。一般来讲，高多聚体和超大多聚体被认为是止血最有效的(参见例如Turecek，P.，

在一些实施方案中，通过本文所述的纯化方法制备的rVWF组合物具有特征如下的rVWF寡聚体的分布：95％的寡聚体具有6个亚基至20个亚基。在一些实施方案中，rVWF组合物具有特征如下的rVWF寡聚体的分布：95％的寡聚体具有选自表4中发现的变化形式458至641的亚基范围。

表4.本文提供的组合物中发现的和本文提供的方法中使用的rVWF寡聚体的分布的示例性实施方案。

Var.＝变化形式

在一些实施方案中，由本文提供的方法制备的rVWF组合物可根据以特定更高阶的rVWF多聚体或更大的多聚体存在的rVWF分子的百分比表征。例如，在一个实施方案中，本文所述的方法中使用的rVWF组合物的至少20％的rVWF分子以至少10个亚基的寡聚复合物存在。在另一个实施方案中，本文所述的方法中使用的rVWF组合物的至少20％的rVWF分子以至少12个亚基的寡聚复合物存在。在其他实施方案中，本文提供的方法中使用的rVWF组合物具有最小百分比(例如，具有至少X％)的根据表5至表7中发现的变化形式134至457中的任一者的以特定更高阶的rVWF多聚体或更大的多聚体(例如，至少Y个亚基的多聚体)存在的rVWF分子。

表5.本文提供的组合物中发现的和本文提供的方法中使用的以特定更高阶的rVWF多聚体或更大的多聚体存在的rVWF分子的百分比的示例性实施方案。

Var.＝变化形式

表6.本文提供的组合物中发现的和本文提供的方法中使用的以特定更高阶的rVWF多聚体或更大的多聚体存在的rVWF分子的百分比的示例性实施方案。

Var.＝变化形式

表7.本文提供的组合物中发现的和本文提供的方法中使用的以特定更高阶的rVWF多聚体或更大的多聚体存在的rVWF分子的百分比的示例性实施方案。

Var.＝变化形式

根据上文，rVWF包含显著百分比的高分子量(HMW)rVWF多聚体。在其他实施方案中，HMW rVWF多聚体组合物包含至少10％-80％rVWF十聚体或更高阶的多聚体。在其他实施方案中，组合物包含约10％-95％、20％-90％、30％-85％、40％-80％、50％-75％或60％-70％十聚体或更高阶的多聚体。在其他实施方案中，HMW rVWF多聚体组合物包含约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％十聚体或更高阶的多聚体。

rVWF多聚体的数量和百分比的评估可使用本领域已知的方法进行，包括但不限于使用电泳和尺寸排阻色谱法按大小分离rVWF多聚体的方法，例如如Cumming等人所讨论的，(J Clin Pathol.1993年五月；46(5)：470-473，所述文献出于所有目的且特别是针对涉及rVWF多聚体评估的所有教义，在此以引用的方式整体并入)。此类技术还可包括免疫印迹技术(诸如蛋白质印迹)，其中凝胶用放射性标记的抗VWF抗体进行免疫印迹，随后进行化学发光检测(参见例如Wen等人，(1993)，J.Clin.Lab.Anal.，7：317-323，所述文献出于所有目的且特别是针对涉及rVWF多聚体评估的所有教义，在此以引用的方式整体并入)。VWF的其他测定包括VWF：抗原(VWF:Ag)、VWF：瑞斯托霉素辅因子(VWF:RCof)和VWF：胶原结合活性测定(VWF:CBA)，其通常用于血管性血友病的诊断和分类(参见例如Favaloro，等人，Pathology，1997，29(4)：341-456，所述文献出于所有目的且特别是针对涉及VWF的测定的所有教义，在此以引用的方式整体并入)。

在一些实施方案中，对于根据本发明的方法制备的rVWF，rFVIII促凝活性(IUrFVIII:C)与rVWF瑞斯托霉素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率介于3∶1与1∶5之间。在其他实施方案中，比率介于2∶1与1∶4之间。在再其他实施方案中，比率介于5∶2与1∶4之间。在其他实施方案中，比率介于3∶2与1∶3之间。在再其他实施方案中，比率为约1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、2∶1、2∶3、2∶4、2∶5、3∶1、3∶2、3∶4或3∶5。在其他实施方案中，比率介于1∶1与1∶2之间。在又其他实施方案中，比率为1.1∶1、1.2∶1、1.3∶1、1.4∶1、1.5∶1、1.6∶1、1.7∶1、1.8∶1、1.9∶1或2∶1。在某些实施方案中，可用于本文所述的方法的组合物中的rFVIII促凝活性(IUrFVIII:C)与rVWF瑞斯托霉素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率选自表8中发现的变化形式1988至2140。

表8.本文提供的组合物中和本文提供的方法中使用的rFVIII促凝活性(IUrFVIII:C)与rVWF瑞斯托霉素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率的示例性实施方案。

Var.＝变化形式

在其他实施方案中，本发明的更阶的rVWF多聚体在施用后约1小时至约90小时是稳定的。在再其他实施方案中，更高阶的rVWF多聚体在施用后约5-80、10-70、15-60、20-50、25-40或30-35小时是稳定的。在其他实施方案中，更高阶的rVWF多聚体在施用后至少3、6、12、18、24、36、48或72小时是稳定的。在某些实施方案中，rVWF多聚体的稳定性在体外评估。

在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法包含施用后半衰期为至少12小时或至少24小时的更高阶的rVWF多聚体。在其他实施方案中，更高阶的rVWF多聚体具有选自表9中发现的变化形式642至1045的半衰期。

表9.在通过本文提供的方法制备的组合物中发现的更高阶的rVWF多聚体的半衰期的示例性实施方案。

Var.＝变化形式

另一种用于测量VWF生物活性的方法是胶原结合测定，其基于ELISA技术(Brown和Bosak，Thromb.Res.，1986，43：303-311；Favaloro，Thromb.Haemost.，2000，83127-135)。微孔板上涂覆有I型或III型胶原。然后VWF结合至胶原表面并且随后用酶标多克隆抗体检测。最后一步是底物反应，其可使用ELISA阅读器进行光度监测。

冯维勒布兰德因子(VWF:Ag)的免疫学测定是测量血浆中VWF蛋白浓度的免疫测定。它们没有关于VWF功能的指示。存在多种用于测量VWF:Ag的方法，并且这些方法包括酶联免疫吸附测定(ELISA)或自动乳胶免疫测定(LIA)。目前许多实验室使用全自动乳胶免疫测定。历史上，实验室使用了多种技术，包括Laurell电免疫测定“Laurell Rockets”，但如今大多数实验室很少使用这些技术。

IV.试剂盒

作为另一方面，本发明包括试剂盒，其包含一种或多种冻干组合物，所述冻干组合物以有助于其用于向受试者施用的方式加以包装。在一个实施方案中，此类试剂盒包括本文所述的药物制剂(例如，包含治疗性蛋白或肽的组合物)，所述药物制剂被包装在容器诸如密封瓶或器皿中，其中描述化合物或组合物在实践所述方法中的用途的标签贴在容器上或包括在包装中。在一个实施方案中，药物制剂包装在容器中，以使得容器的顶部空间的量(例如，在液体制剂与容器顶部之间的空气的量)非常小。优选地，顶部空间的量是可忽视的(即，几乎不存在)。在一个实施方案中，试剂盒含有具有治疗性蛋白或肽组合物的第一容器和具有用于是啥组合物的生理学上可接受的复原溶液的第二容器。在一个方面，药物制剂以单位剂量形式进行包装。试剂盒还包括适用于根据特定施用途径来施用药物制剂的设备。优选地，试剂盒含有描述药物制剂的用途的标签。

V.治疗与形成含有VWF和补体C1q的复合物相关的患者的方法

向受试者施用rVWF的优点之一是rVWF比pdVWF更高的比活性允许在施用的rVWF的量和受试者重新给药的次数方面具有灵活性。如将理解的和如本文中进一步详细讨论的，共同施用的FVIII可以是重组的或血浆来源的。

使用由治疗医师选择的剂量水平和模式进行rVWF的单次施用或多次施用。为了预防或治疗疾病，适当的剂量取决于待治疗的疾病(例如，血管性血友病)的类型、所述疾病的严重程度和病程、施用药物是出于预防还是治疗目的、先前疗法、患者的临床史以及对于药物的响应，以及主治医师的判断。

如本文所述，rVWF的组合物可包含在药物制剂中。此类制剂可口服、局部、透皮、胃肠外、通过吸入喷雾、阴道、直肠或通过颅内注射施用。如本文所使用的术语胃肠外包括皮下注射、静脉内、肌肉内、脑池内注射，或输注技术。还设想通过静脉内、真皮内、肌肉内、乳房内、腹膜内、鞘内、眼球后、肺内注射和或手术植入于特定位点来施用。通常，组合物基本上无热原，以及可能对接受者有害的其他杂质。

在一个方面，本发明的制剂通过初始大丸药，接着进行连续输注以保持药物产品的治疗性循环水平来施用。作为另一个实例，本发明的化合物以一次剂量施用。本领域一般技术人员将容易地优化如良好的医学规范和个别患者的临床状况所确定的有效剂量和施用方案。施用途径可以是但不限于通过静脉内、腹腔内、皮下或肌肉内施用。给药频率取决于剂的药物代谢动力学参数和施用途径。最佳药物制剂由本领域技术人员根据施用途径和所需剂量而确定。参见例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，1990，MackPublishing Co.，Easton，Pa.18042第1435-1712页，所述文献的公开内容出于所有目的且特别是针对涉及药物产品的制剂、施用途径和剂量的所有教义，在此以引用的方式整体并入。此类制剂影响所施用剂的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。取决于施用途径，根据体重、体表面积或器官大小计算合适剂量。可通过使用已建立的测定血液水平剂量的测定结合适当的剂量响应数据来确定适当的剂量。最终剂量方案由主治医师考虑修改药物作用的各种因素来确定，所述因素例如药物比活性、患者的损伤严重程度和响应性、患者年龄、状况、体重、性别和饮食、任何感染的严重程度、施用时间以及其他临床因素。例如，本发明的重组VWF的典型剂量为大约50IU/kg，等于500μg/kg。在进行研究时，将出现关于适于各种疾病和疾患的剂量和治疗持续时间的其他信息。

除非另外指定，否则本发明的实践可采用本领域的技术范围内的有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术和描述。此类常规技术包括聚合物阵列合成、杂交、连接和使用标记的杂交检测。合适的技术的具体说明可参考本文以下实施例。然而，当然还可使用其他等效常规程序。此类常规技术和描述可在标准实验手册中找到，诸如Genome Analysis：A Laboratory Manual Series(第I卷至第IV卷)；Using Antibodies：A Laboratory Manual；Cells：A Laboratory Manual；PCRPrimer：A Laboratory Manual；以及Molecular Cloning：A Laboratory Manual(均来自Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Stryer，L.(1995)Biochemistry(第四版)Freeman，Highly stabilized York；Gait，“Oligonucleotide Synthesis：A PracticalApproach”1984，IRL Press，London；Nelson和Cox(2000)，Lehninger，Principles ofBiochemistry第三版，W.H.Freeman Pub.，Highly stabilized York，N.Y.；以及Berg等人(2002)Biochemistry，第五版，W.H.Freeman Pub.，Highly stabilized York，N.Y.，出于所有目的，所述文献均以引用的方式整体并入本文。

应注意，除非上下文明确地另外规定，否则在本文和附加的权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物。因此，例如，对“一种聚合酶”的引用是指一种剂或此类剂的混合物，并且对“所述方法”的引用包括对本领域技术人员已知的等价步骤和方法的引用等。因此，例如，提及“一种抗体”包括复数种此类抗体并且提及“一种宿主细胞”包括提及一种或多种宿主细胞及其为本领域技术人员所知的等效物等。还应注意，权利要求可拟订成排除任何任选的要素。因此，这种陈述意图充当结合权利要求要素的叙述来使用诸如“仅仅”、“仅”等排他性术语或使用“否定”限制的前提基础。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同的含义。出于描述和公开描述于公布中并且可能与目前所描述的发明结合使用的装置、组合物、制剂以及方法学的目的，本文所提及的所有公布均以引用的方式并入本文。

如果提供一定范围的值，那么应理解除非上下文另外清楚地规定，否则本发明内包涵所述范围的上限与下限之间的各插入值(至下限单位的十分之一)和在所陈述的范围中的任何其他陈述值或插入值。本发明内还涵盖可独立地包括于这些较小范围中的所述较小范围的上限和下限，从属于所陈述的范围中的任何具体排除的限值。当所述范围包括一个或两个限值时，排除那些所包括的限值之一或两者的范围也包括在本发明中。

在以上描述中，阐述大量具体细节以便提供本发明的更详尽的理解。然而，对于本领域技术人员将是明显的：可在没有这些具体细节中的一个或多个的情况下实施本发明。在其他情况下，并未描述本领域技术人员众所周知的众所周知的特性和程序，以便避免混淆本发明。

虽然主要参照具体实施方案描述本发明，但还预想在阅读本公开后其他实施方案对于本领域技术人员将是清楚的，并且意图此类实施方案包含于本发明的方法内。

本文提供了治疗受试者(例如，患有动脉粥样硬化的受试者)动脉粥样硬化的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的包含rVWF的组合物，使得rVWF结合补体C1q以形成C1q-rVWF复合物并且所述C1q-rVWF复合物结合胆固醇晶体(CC)，从而形成CC-C1q-rVWF复合物并抑制动脉粥样硬化斑块的进展。

在一些实施方案中，本文所述的rVWF包含选自由以下组成的组的多肽：(a)SEQ IDNO：3的氨基酸序列；(b)(a)的生物活性类似物、片段或变体；(c)由SEQ ID NO：1的多核苷酸序列编码的多肽；和(d)(c)的生物活性类似物、片段或变体。在一些实施方案中，rVWF包含由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的多肽。在一些实施方案中，rVWF包含由SEQ ID NO：3的氨基酸序列的生物活性类似物、片段或变体组成的多肽。在一些实施方案中，rVWF包含由SEQ ID NO：1的多核苷酸序列编码的多肽组成的多肽。在一些实施方案中，rVWF包含由SEQID NO：1的多核苷酸序列编码的多肽组成的多肽；以及由SEQ ID NO：1的多核苷酸序列编码的多肽的生物活性类似物、片段或变体。

本文还提供了减少受试者(例如，患有动脉粥样硬化的受试者)动脉粥样硬化斑块炎症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的包含rVWF的组合物，使得vWF结合补体C1q以形成C1q-rVWF复合物并且所述C1q-rVWF复合物结合胆固醇晶体(CC)，从而形成CC-C1q-rVWF复合物并减少动脉粥样硬化斑块的炎症。

在一些实施方案中，本文所述的任何rVWF组合物包含高分子量vWF多聚体，所述多聚体包含至少20％、至少40％、至少60％、至少80％、或至少90％或更多的VWF十聚体或高阶多聚体。在一些实施方案中，rVWF的组合物包含高分子量vWF多聚体，所述多聚体包含至少20％的VWF十聚体或高阶多聚体。在一些实施方案中，rVWF的组合物包含高分子量vWF多聚体，所述多聚体包含至少40％的VWF十聚体或高阶多聚体。在一些实施方案中，rVWF的组合物包含高分子量vWF多聚体，所述多聚体包含至少60％的VWF十聚体或高阶多聚体。在一些实施方案中，rVWF的组合物包含高分子量vWF多聚体，所述多聚体包含至少80％的VWF十聚体或高阶多聚体。

本文还提供了调节受试者(例如，患有动脉粥样硬化的受试者)血管中巨噬细胞免疫响应的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的包含rVWF的组合物，使得rVWF结合补体C1q以形成C1q-rVWF复合物，从而降低巨噬细胞形成，提高巨噬细胞表面上一种或多种吞噬作用介导受体和/或共刺激受体的表达水平，减少巨噬细胞的吞噬作用，和/或减少由巨噬细胞进行的促炎性细胞因子分泌。

向患有动脉粥样硬化的受试者受试者施用rVWF的优点之一是rVWF比pdVWF更高的比活性允许在施用的rVWF的量和受试者重新给药的次数方面具有灵活性。如将理解的和如本文中进一步详细讨论的，共同施用的FVIII可以是重组的或血浆来源的。

在一些实施方案中，施用于受试者的rVWF以C1q依赖性方式结合至胆固醇晶体。在一些实施方案中，包含rVWF、CC和C1q的复合物导致细胞诸如巨噬细胞的吞噬作用介导的受体的表面表达提高或升高。在一些情况下，吞噬作用介导的受体包括但不限于MerTK、LRP-1和SR-A1。在一些实施方案中，一种或多种选自MerTK、LRP-1、SR-A1、CD14、LAIR1和PD-L1的蛋白质被包含rVWF、CC和C1q的此类复合物上调。

在一些实施方案中，包含rVWF、CC和C1q的复合物导致胱天蛋白酶1激活减少或降低。在一些实施方案中，复合物减降低IL-1分泌(例如，IL-1β分泌)。在一些实施方案中，复合物降低IL-1β/IL-1RA比。在一些实施方案中，复合物降低IL-1α/IL-1RA比。

在一些实施方案中，rVWF结合至C1q并调节C1q对巨噬细胞诸如受试者中的巨噬细胞的作用或活性。在某些实施方案中，包含rVWF和C1q的复合物影响吞噬细胞(包括巨噬细胞)的吞噬作用。在一些情况下，受试者中的巨噬细胞表现出对包含rVWF和C1q的复合物(包括包含rVWF、C1q和胆固醇晶体的复合物)的吞噬作用降低。在一些实施方案中，rVWF降低或减少由于动脉粥样硬化引起的炎症(例如，动脉粥样硬化炎症)。包含rVWF、C1q和CC的复合物可调控动脉粥样硬化斑块或病变中或周围巨噬细胞的免疫响应。在一些实施方案中，与未施用rVWF的受试者相比，施用于受试者的rVWF表现出减少的泡沫细胞形成。在一些实施方案中，施用于受试者的rVWF降低或减缓患有动脉粥样硬化的受试者的斑块进展。

除非另外指定，否则本发明的实践可采用本领域的技术范围内的有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术和描述。此类常规技术包括聚合物阵列合成、杂交、连接和使用标记的杂交检测。合适的技术的具体说明可参考本文以下实施例。然而，当然还可使用其他等效常规程序。此类常规技术和描述可在标准实验手册中找到，诸如Genome Analysis：A Laboratory Manual Series(第I卷至第IV卷)；Using Antibodies：A Laboratory Manual；Cells：A Laboratory Manual；PCRPrimer：A Laboratory Manual；以及Molecular Cloning：A Laboratory Manual(均来自Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Stryer，L.(1995)Biochemistry(第四版)Freeman，Highly stabilized York；Gait，“Oligonucleotide Synthesis：A PracticalApproach”1984，IRL Press，London；Nelson和Cox(2000)，Lehninger，Principles ofBiochemistry第三版，W.H.Freeman Pub.，Highly stabilized York，N.Y.；以及Berg等人(2002)Biochemistry，第五版，W.H.Freeman Pub.，Highly stabilized York，N.Y.，出于所有目的，所述文献均以引用的方式整体并入本文。

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同的含义。出于描述和公开描述于公布中并且可能与目前所描述的发明结合使用的装置、组合物、制剂以及方法学的目的，本文所提及的所有公布均以引用的方式并入本文。

如果提供一定范围的值，那么应理解除非上下文另外清楚地规定，否则本发明内包涵所述范围的上限与下限之间的各插入值(至下限单位的十分之一)和在所陈述的范围中的任何其他陈述值或插入值。本发明内还涵盖可独立地包括于这些较小范围中的所述较小范围的上限和下限，从属于所陈述的范围中的任何具体排除的限值。当所述范围包括一个或两个限值时，排除那些所包括的限值之一或两者的范围也包括在本发明中。

在以上描述中，阐述大量具体细节以便提供本发明的更详尽的理解。然而，对于本领域技术人员将是明显的：可在没有这些具体细节中的一个或多个的情况下实施本发明。在其他情况下，并未描述本领域技术人员众所周知的众所周知的特性和程序，以便避免混淆本发明。

虽然主要参照具体实施方案描述本发明，但还预想在阅读本公开后其他实施方案对于本领域技术人员将是清楚的，并且意图此类实施方案包含于本发明的方法内。

赋形剂是赋予或增强药物产品(例如，蛋白质)的稳定性和递送的添加剂。不论其纳入的原因，赋形剂是制剂的整体组分，并且因此需要是安全的和患者耐受良好的。对于蛋白质药物，赋形剂的选择特别重要，因为它们会影响药物的功效和免疫原性。因此，开发蛋白质制剂时需要选择适当的赋形剂，以提供适当的稳定性、安全性和适销性。

在一个方面，冻干制剂至少由缓冲剂、增量剂和稳定剂中的一种或多种构成。在这个方面中，在冻干步骤期间或在复原期间聚集成为问题的情况下评价并选择表面活性剂的实用性。包含适当缓冲剂以使制剂在冻干期间保持在稳定pH范围内。表10中提供了液体和冻干蛋白制剂所设想的赋形剂组分的比较。

表10：冻干蛋白制剂的赋形剂组分

开发蛋白质制剂的主要挑战是稳定产品以对抗制造、运输和储存的应力。制剂赋形剂的作用是提供对抗这些应力的稳定作用。还采用赋形剂来降低高浓度蛋白质制剂的粘度，以使其能够递送并提高患者的便利性。一般来讲，赋形剂可基于其稳定蛋白质以对抗各种化学和物理应力的机制进行分类。一些赋形剂用于减轻具体应力的影响或调控具体蛋白质的特定易感性。其他赋形剂对蛋白质的物理和共价稳定性具有更普遍的作用。本文所述的赋形剂按它们的化学类型或它们在制剂中的功能作用来整理。在讨论每种赋形剂类型时提供了对稳定作用的模式的简要描述。

考虑到本文提供的教义和指导，本领域技术人员将知道多少量或范围的赋形剂可包含在任何特定制剂中以实现促进生物药物(例如，蛋白质)稳定性保持的本发明的生物药物制剂。例如，待包含在本发明的生物药物制剂中的盐的量和类型基于最终溶液的所需同渗重摩(例如，等渗的、低渗的或高渗的)以及要包含在制剂中的其他组分的量和同渗重摩进行选择。

例如，包含约5％山梨糖醇可实现等渗，而需要约9％的蔗糖赋形剂才能实现等渗。可包含在本发明的生物药物制剂中的一种或多种赋形剂的量或浓度范围的选择已在上文通过对盐、多元醇和糖的提及进行举例说明。然而，本领域技术人员将理解，本文所述的和通过提及具体赋形剂进一步举例说明的考虑同样适用于所有类型和组合的赋形剂，包括例如盐、氨基酸、其他张度剂、表面活性剂、稳定剂、增量剂、冷冻保护剂、冻干保护剂、抗氧化剂、金属离子、螯合剂和/或防腐剂。

此外，当特定赋形剂以摩尔浓度报告时，本领域技术人员将认识到还设想溶液的当量百分比(％)w/v(例如，(溶液样品中物质的克数/mL溶液)X 100％)。

当然，本领域普通技术人员将认识到，本文所述的赋形剂的浓度在特定制剂中具有互依性(interdependency)。例如，在例如存在高蛋白质浓度或例如存在高稳定剂浓度的情况下增量剂的浓度可降低。另外，本领域普通技术人员将认识到，为了保持其中不存在增量剂的特定制剂的等渗性，将相应地调节稳定剂的浓度(例如，将使用“张度调节(tonicifying)”量的稳定剂)。常见赋形剂是本领域已知的并且可在Powell等人，Compendium of Excipients for Parenteral Formulations(1998)，PDAJ.Pharm.Sci.Technology，52：238-311中找到。

通常观察到药理学活性蛋白质制剂的稳定性在较窄的pH范围内最大。最佳稳定性的这个pH范围需要在预制剂研究早期进行鉴定。几种方法，诸如加速稳定性研究和量热筛选研究，可用于这项工作中(Remmele R.L.Jr.，等人，Biochemistry，38(16)：5241-7(1999))。一旦制剂最终确定，蛋白质必须在其整个保存期内制造和保持。因此，几乎总是采用缓冲剂来控制制剂中的pH值。

缓冲物质的缓冲容量在pH等于pKa时最大，并随着pH远离这个值增大或减小而减小。百分之九十的缓冲容量存在于其pKa的一个pH单位内。缓冲容量也随着缓冲液浓度的增加而成比例地增加。

选择缓冲液时需要考虑几种因素。首先最重要的是，缓冲物质及其浓度需要基于其pKa和所期望的制剂pH来限定。同样重要的是确保缓冲液与蛋白质和其他制剂赋形剂是相容的，并且不会催化任何降解反应。要考虑的第三个重要方面是在施用后缓冲液可能诱导的刺痛和刺激。例如，已知柠檬酸盐会在注射后引起刺痛(Laursen T，等人，Basic ClinPharmacol Toxicol.，98(2)：218-21(2006))。经由皮下(SC)或肌肉内(IM)途径施用的药物(在这种情况下药物溶液在部位保持相对较长的时间段)与通过IV途径施用(在这种情况下制剂在施用后快速稀释到血液中)时相比，刺痛和刺激的可能性更大。对于通过直接IV输注施用的制剂，需要监测缓冲液(和任何其他制剂组分)的总量。人们必须特别小心以磷酸钾缓冲液的形式施用的钾离子，其会诱导患者的心血管作用(Hollander-Rodriguez JC，等人，Am.Fam.Physician.，73(2)：283-90(2006))。

用于冻干制剂的缓冲液需要另外的考虑。一些缓冲液(如磷酸钠)会在冷冻期间从蛋白质非晶相中结晶出来，导致pH变化。其他常见的缓冲液，诸如醋酸盐和咪唑，可能会在冻干过程中升华或蒸发，从而在冻干期间或复原后使制剂的pH转变。

选择存在于组合物中的缓冲系统以在生理上相容并保持药物制剂的所期望的pH。在一个实施方案中，溶液的pH介于pH2.0与pH12.0之间。例如，溶液的pH可为2.0、2.3、2.5、2.7、3.0、3.3、3.5、3.7、4.0、4.3、4.5、4.7、5.0、5.3、5.5、5.7、6.0、6.3、6.5、6.7、7.0、7.3、7.5、7.7、8.0、8.3、8.5、8.7、9.0、9.3、9.5、9.7、10.0、10.3、10.5、10.7、11.0、11.3、11.5、11.7或12.0。

pH缓冲化合物可以适于将制剂的pH保持在预定水平的任何量存在。在一个实施方案中，pH缓冲浓度在0.1mM与500mM之间。例如，设想pH缓冲剂为至少0.1、0.5、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、1.7、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200或500mM。

用于缓冲如本文所列出的制剂的示例性pH缓冲剂包括但不限于有机酸、甘氨酸、组氨酸、谷氨酸盐、琥珀酸盐、磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、Tris、HEPES和氨基酸或氨基酸混合物(包括但不限于天冬氨酸盐、组氨酸和甘氨酸)。在本发明的一个实施方案中，缓冲剂是柠檬酸盐。

在本药物制剂的一个方面，添加稳定剂(或稳定剂的组合)以防止或减少储存诱导的聚集和化学降解。复原后浑浊或混浊的溶液表明蛋白质已沉淀或至少已聚集。术语“稳定剂”意指在水性状态下能够防止聚集或物理降解，包括化学降解(例如，自溶、脱酰胺、氧化等)的赋形剂。设想的稳定剂包括但不限于蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、纤维二糖、龙胆二糖、异麦芽糖、阿拉伯糖、葡糖胺、果糖、甘露糖醇、山梨糖醇、甘氨酸、精氨酸盐酸盐、多羟基化合物(包括多糖诸如葡聚糖、淀粉、羟乙基淀粉、环糊精)、N-甲基吡咯烷酮(N-methyl pyrollidene)、纤维素和透明质酸、氯化钠(Carpenter等人，Develop.Biol.Standard 74：225，(1991))。在本制剂中，稳定剂以约0.1、0.5、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、1.7、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、700、900或1000mM的浓度掺入。在本发明的一个实施方案中，甘露糖醇和海藻糖用作稳定剂。

如需要，制剂还包含适当量的增量剂和同渗重摩调节剂。增量剂包括例如但不限于甘露糖醇、甘氨酸、蔗糖、聚合物(诸如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮)、羧甲基纤维素、乳糖、山梨糖醇、海藻糖或木糖醇。在一个实施方案中，增量剂是甘露糖醇。增量剂以约0.1、0.5、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、1.7、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、700、900或1000mM的浓度掺入。

蛋白质具有与表面相互作用的高度倾向，使得它们易于在气-液、小瓶-液和液-液(硅油)界面处吸附和变性。已观察到这种降解途径与蛋白质浓度成反向关系，并且导致可溶性和不溶性蛋白质聚集体的形成或经由吸附至表面使蛋白质从溶液中流失。除了容器表面吸附之外，物理搅拌会加剧表面诱导的降解，正如产品运输和处理期间会经历的那样。

表面活性剂通常用于蛋白质制剂中以防止表面诱导的降解。表面活性剂是具有与蛋白质竞争界面位置的能力的两亲性分子。表面活性剂分子的疏水部分占据界面位置(例如，气/液)，而所述分子的亲水部分保持朝向本体溶剂。在足够的浓度(通常大约为洗涤剂的临界胶束浓度)下，表面活性剂分子的表面层用于防止蛋白质分子吸附于界面处。因此，表面诱导的降解被最小化。本文设想的表面活性剂包括但不限于脱水山梨糖醇聚乙氧基化物的脂肪酸酯，例如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80。两者的差别仅在于对分子赋予疏水特征的脂肪链的长度(分别为C-12和C-18)。因此，与聚山梨醇酯20相比，聚山梨醇酯80的表面活性更高并且具有更低的临界胶束浓度。

洗涤剂也会影响蛋白质的热力学构象稳定性。这里同样，给定的洗涤剂赋形剂的作用将是蛋白质特异性的。例如，已经证明聚山梨醇酯会降低一些蛋白质的稳定性并增加其他蛋白质的稳定性。就可与部分或完全未折叠的蛋白质状态特异性结合的洗涤剂分子的疏水尾部而言，蛋白质的洗涤剂去稳定作用可合理化。这些类型的相互作用可能导致构象平衡向更扩展的蛋白质状态转变(例如，增加蛋白质分子疏水部分的暴露以补充结合聚山梨醇酯)。另选地，如果蛋白质天然状态表现出一些疏水表面，洗涤剂与天然状态的结合可稳定此构象。

聚山梨醇酯的另一方面是它们固有地易于氧化降解。作为原料，它们通常含有会导致蛋白质残基侧链(尤其是蛋氨酸)氧化的足量过氧化物。由添加稳定剂产生的氧化损伤的可能性强调了应在制剂中应使用最低有效浓度的赋形剂这一点。对于表面活性剂，给定蛋白质的有效浓度将取决于稳定作用的机制。

还添加适当量的表面活性剂以防止在冷冻和干燥期间的表面相关的聚集现象(Chang，B，J.Pharm.Sci.85：1325，(1996))。因此，示例性表面活性剂包括但不限于阴离子、阳离子、非离子、两性离子和两性表面活性剂(包括衍生自天然存在的氨基酸的表面活性剂)。阴离子表面活性剂包括但不限于月桂基硫酸钠、磺基琥珀酸二辛酯钠和磺酸二辛酯钠、鹅去氧胆酸、N-月桂酰肌氨酸钠盐、十二烷基硫酸锂、1-辛烷磺酸钠盐、胆酸钠水合物、脱氧胆酸钠和甘氨脱氧胆酸钠盐。阳离子表面活性剂包括但不限于苯扎氯铵或苄索氯铵、十六烷基氯化吡啶一水合物和十六烷基三甲基溴化铵。两性离子表面活性剂包括但不限于CHAPS、CHAPSO、SB3-10和SB3-12。非离子表面活性剂包括但不限于毛地黄皂苷(digitonin)、Triton X-100、Triton X-114、TWEEN-20和TWEEN-80。表面活性剂还包括但不限于聚月桂乙二醇400(lauromacrogol 400)、聚乙二醇40硬脂酸酯(polyoxyl 40stearate)、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、40、50和60、单硬脂酸甘油酯、聚山梨醇酯40、60、65和80、大豆卵磷脂和其他磷脂(诸如二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(DMPG)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)和二油酰基磷脂酰甘油(DOPG))、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。因此还提供了以不同比率包含这些表面活性剂(单独地或作为混合物)的组合物。在本发明的一个实施方案中，表面活性剂是TWEEN-80。在本发明的制剂中，表面活性剂以约0.005至约1.0g/L或约0.01至约0.5g/L的浓度掺入。在所提供的制剂中，表面活性剂浓度为0.005、0.01、0.02、0.03、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0g/L。

通常添加盐以增加制剂的离子强度，其对蛋白质溶解度、物理稳定性和等渗性很重要。盐可通过多种方式影响蛋白质的物理稳定性。离子可通过结合至蛋白质表面上的带电残基来稳定蛋白质的天然状态。可选地，盐可通过结合至沿着蛋白质主链的肽基团(-CONH-)来稳定变性状态。盐还可通过屏蔽蛋白质分子内残基之间的排斥静电相互作用来稳定蛋白质的天然构象。蛋白质制剂中的盐还可屏蔽蛋白质分子之间的可导致蛋白质聚集和不溶的吸引静电相互作用。在所提供的制剂中，所述盐浓度介于0.1、1、10、20、30、40、50、80、100、120、150、200、300与500mM之间。在一些实施方案中，盐浓度为约0.1mM至约500mM或约1mM至约500mM或约1mM至约400mM。

氨基酸被发现在蛋白质制剂中广泛用作缓冲液、增量剂、稳定剂和抗氧化剂。因此，在一个方面，组氨酸和谷氨酸分别用于在5.5-6.5的pH范围和4.0-5.5的pH范围内缓冲蛋白质制剂。组氨酸的咪唑基团的pKa＝6.0并且谷氨酸侧链的羧基具有4.3的pKa，这使得这些氨基酸适于在其相应的pH范围内进行缓冲。谷氨酸在此类情况下特别有用。组氨酸常见于市售蛋白质制剂中，并且这种氨基酸提供了柠檬酸盐(一种已知在注射后会引起刺痛的缓冲液)的替代品。有趣的是，当在液体和冻干呈现形式两者中以高浓度使用时，组氨酸还被报导具有关于聚集的稳定作用(Chen B，等人，Pharm Res.，20(12)：1952-60(2003))。其他人还观察到组氨酸降低了高蛋白质浓度制剂的粘度。然而，在同一项研究中，作者观察到在不锈钢容器中对抗体进行冻融研究期间，含有组氨酸的制剂的聚集和变色增加。组氨酸的另一个注意事项是它在金属离子存在下会经历光氧化(Tomita M，等人，Biochemistry，8(12)：5149-60(1969))。在制剂中将蛋氨酸作为抗氧化剂使用似乎很有前景；已观察到它对许多氧化应激有效(Lam XM，等人，J Pharm ScL，86(11)：1250-5(1997))。

在多个方面，提供了包含甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、精氨酸和丙氨酸中的一种或多种氨基酸的制剂，已经证明其通过优先排除的机制稳定蛋白质。甘氨酸也是冻干制剂中常用的增量剂。已经证明精氨酸是一种有效抑制聚集的剂，并已用于液体和冻干制剂两者。在所提供的制剂中，所述氨基酸浓度介于0.1、1、10、20、30、40、50、80、100、120、150、200、300与500mM之间。在一些实施方案中，氨基酸浓度为约0.1mM至约500mM、约1mM至约500mM、约0.1mM至约400mM、0.4mM至约400mM，或约0.4mM至约300mM。在本发明的一个实施方案中，氨基酸是甘氨酸。

蛋白质残基的氧化由许多不同的来源产生。除了添加特定抗氧化剂之外，防止氧化蛋白质损伤还涉及在产品的整个制造过程和储存中小心控制许多因素，诸如大气氧气、温度、光照和化学污染。因此，本发明设想了使用药物抗氧化剂，包括但不限于还原剂、氧/自由基清除剂或螯合剂。在一个方面，治疗性蛋白质制剂中的抗氧化剂是水溶性的并且在整个产品保存期限内保持活性。还原剂和氧/自由基清除剂通过消除溶液中的活性氧物质起作用。螯合剂诸如EDTA通过结合促进自由基形成的痕量金属污染物而是有效的。例如，在酸性成纤维细胞生长因子的液体制剂中利用EDTA来抑制金属离子催化的半胱氨酸残基的氧化。

除了各种赋形剂防止蛋白质氧化的有效性之外，抗氧化剂本身诱导蛋白质发生其他共价或物理变化的可能性也值得关注。例如，还原剂会引起分子内二硫键的破坏，从而导致二硫键改组。在过渡金属离子的存在下，已经证明抗坏血酸和EDTA可促进许多蛋白质和肽中的蛋氨酸氧化(Akers MJ和Defelippis MR.Peptides and Proteins as ParenteralSolutions.In：Pharmaceutical Formulation Development of Peptides andProteins.Sven Frokjaer，Lars Hovgaard编著.Pharmaceutical Science.Taylor和Francis，UK(1999))；Fransson J.R.，等人，Pharm.Sci.86(9)：4046-1050(1997)；Yin J，等人，Pharm Res.，21(12)：2377-83(2004))。已报道硫代硫酸钠可降低在rhuMab HER2中光和温度诱导的蛋氨酸氧化的水平；然而，本研究还报道了硫代硫酸盐-蛋白质加合物的形成(Lam XM，Yang JY，等人，J Pharm Sci.86(11)：1250-5(1997))。根据蛋白质的特定应力和敏感性选择适当的抗氧化剂。在某些方面所设想的抗氧化剂包括但不限于还原剂和氧/自由基清除剂、EDTA和硫代硫酸钠。

一般来讲，蛋白质制剂中不需要过渡金属离子，因为它们会催化蛋白质中的物理和化学降解反应。然而，当特定金属离子是蛋白质的辅因子时，将其包含在制剂中；并且在特定金属离子形成配位复合物的情况下，将其包含在蛋白质的悬浮制剂中(例如，胰岛素的锌悬浮液)。最近，已提出使用镁离子(10mM-120mM)来抑制天冬氨酸异构化为异天冬氨酸(WO 2004039337)。

金属离子赋予蛋白质稳定性或增加的活性的两个实例是人脱氧核糖核酸酶(rhDNA酶，

当开发涉及从同一容器提取多余一次的多用途胃肠外制剂时，防腐剂是必需的。它们的主要功能是抑制微生物生长并确保在药物产品的整个保存期限或使用期限内产品无菌。常用的防腐剂包括但不限于苯甲醇、苯酚和间甲酚。尽管防腐剂的使用历史悠久，但开发包括防腐剂的蛋白质制剂可具有挑战性。防腐剂对蛋白质几乎始终具有去稳定作用(聚集)，并且这已成为限制它们在多剂量蛋白质制剂中使用的主要因素(Roy S，等人，JPharm ScL，94(2)：382-96(2005))。

迄今为止，大多数蛋白质药物已配制仅供单次使用。然而，当多剂量制剂是可能的时，它们具有使得患者能够得到方便和使得适销性能够增加的累加优势。一个良好的实例是人类生长激素(hGH)，其中开发防腐制剂已导致更方便的多用途注射笔呈现物商业化。至少四种含有hGH防腐制剂的此类笔装置当前可在市场上获得。

在防腐剂型的制剂开发过程中需要考虑几个方面。必须优化药物产品中的有效防腐剂浓度。这需要以赋予抗微生物有效性而不损害蛋白质稳定性的一定浓度范围测试剂型中的给定防腐剂。例如，在开发白细胞介素-1受体(I型)的液体制剂时，使用差示扫描量热法(DSC)成功筛选了三种防腐剂。防腐剂基于它们在市售产品中常用浓度下对稳定性的影响进行排序(Remmele RL Jr.，等人，Pharm Res.，15(2)：200-8(1998))。

含有防腐剂的液体制剂的开发比冻干制剂更具挑战性。冷冻干燥产品可在无防腐剂的情况下冻干，并且在使用时用含有防腐剂的稀释剂复原。这缩短防腐剂与蛋白质接触的时间，从而使相关稳定性风险显著减至最小。就于液体制剂而言，必须在整个产品保存期限(例如，18-24个月)内保持防腐剂的有效性和稳定性。一个需注意的要点是必须在含有活性药物和所有赋形剂组分的最终制剂中证明防腐剂有效性。

一些防腐剂会引起注射部位反应，这是选择防腐剂时需要考虑的另一个因素。在侧重于评价去甲肾上腺素中的防腐剂和缓冲剂的临床试验中，观察到与含有间甲酚的制剂相比，含有苯酚和苯甲醇的制剂的疼痛感较低(Kappelgaard AM，Horm Res.，62 Suppl 3：98-103(2004))。有趣的是，在常用的防腐剂中，苯甲醇具有麻醉性质(Minogue SC和SunDA.，Anesth Analg.，100(3)：683-6(2005))。在多个方面，防腐剂的使用提供了超过任何副作用的益处。

本发明还设想了药物制剂的制备方法。

本方法还包括以下步骤中的一个或多个：在冻干之前将本文所述的稳定剂添加至所述混合物中；在冻干之前将选自增量剂、同渗重摩调节剂和表面活性剂的至少一种剂(其各自如本文所述)添加至所述混合物中。

在一些实施方案中，本方法提供增强的制剂，其允许最终产品具有高效力(高rVWF浓度和增强的长期稳定性)，以减少用于治疗的体积(100IU/ml至10,000IU/ml)。在一些实施方案中，用于施用的制剂中的rVWF浓度为约100IU/ml至10,000IU/ml。在一些实施方案中，用于施用的制剂中的rVWF浓度为约500IU/ml至10,000IU/ml。在一些实施方案中，用于施用的制剂中的rVWF浓度为约1,000IU/ml至10,000IU/ml。在一些实施方案中，用于施用的制剂中的rVWF浓度为约2,000IU/ml至10,000IU/ml。在一些实施方案中，用于施用的制剂中的rVWF浓度为约3,000IU/ml至10,000IU/ml。在一些实施方案中，用于施用的制剂中的rVWF浓度为约4,000IU/ml至10,000IU/ml。在一些实施方案中，用于施用的制剂中的rVWF浓度为约5,000IU/ml至10,000IU/ml。在一些实施方案中，用于施用的制剂中的rVWF浓度为约6000IU/ml至10000IU/ml。在一些实施方案中，用于施用的制剂中的rVWF浓度为约7000IU/ml至10000IU/ml。在一些实施方案中，用于施用的制剂中的rVWF浓度为约8,000IU/ml至10,000IU/ml。在一些实施方案中，用于施用的制剂中的rVWF浓度为约9,000IU/ml至10,000IU/ml。

在一些实施方案中，用于施用的制剂包含一种或多种两性离子化合物，包括例如氨基酸如组氨酸、甘氨酸和精氨酸。在一些实施方案中，用于施用的制剂包含具有最少一个疏水基团和一个亲水基团的两亲特性的组分，包括例如聚山梨醇酯80、辛基吡喃糖苷(octylpyranosid)、二肽和/或两亲肽。在一些实施方案中，用于施用的制剂包含非还原糖或糖醇或二糖，包括例如山梨糖醇、甘露糖醇、蔗糖或海藻糖。在一些实施方案中，用于施用的制剂包含产生生理同渗重摩的无毒水溶性盐，包括例如氯化钠。在一些实施方案中，用于施用的制剂包含在6.0至8.0的范围内的pH。在一些实施方案中，用于施用的制剂包含约6.0、约6.5、约7、约7.5或约8.0的pH。在一些实施方案中，用于施用的制剂包含一种或多种稳定rVWF的二价阳离子，包括例如，Ca

在一些实施方案中，用于施用的制剂可经冷冻干燥。在一些实施方案中，用于施用的制剂是稳定的并且可以液态储存于约2℃至约8℃以及约18℃至约25℃下。在一些实施方案中，用于施用的制剂是稳定的并且可以液态储存于约2℃至约8℃下。在一些实施方案中，用于施用的制剂是稳定的并且可以液态储存于约18℃至约25℃下。

实施例

实施例1：结合至C1Q的冯维勒布兰德因子(VWF)对人吞噬细胞的作用

技术背景

如今，动脉粥样硬化被广泛认为是一种慢性炎性疾病(Ross 1999)，其涉及驱动动脉粥样硬化发生和恶化的免疫系统与止血系统之间的复杂相互作用。免疫系统的细胞和蛋白质存在于动脉粥样硬化的所有阶段，包括早期脂纹(脂质积聚部位)，其中含有被称为泡沫细胞的富含脂质的巨噬细胞，这是巨噬细胞摄取与流出胆固醇之间的平衡被破坏的后果。补体系统作为先天免疫系统一部分的不同作用在过去几年中也变得很明显。在动脉粥样硬化的晚期阶段，补体激活-特别是在涉及终末途径时-似乎会导致炎性响应，从而导致疾病病理。相比之下，在其他补体组分不表达或表达之前的早期动脉粥样硬化病变中，观察和实验研究表明，C1q(以及密切相关的甘露糖结合凝集素(MBL)和经典途径的早期下游组分)发挥保护性作用(Patzelt 2015)。

C1q(和MBL)是吞噬作用的激活配体，当结合至要摄取的颗粒或以多价方式(诸如固定在表面上时)呈递给吞噬细胞时，会触发增强的吞噬活性。在动脉粥样硬化的情形下，此功能与凋亡细胞碎片的清除以及致动脉粥样硬化形式的LDL的清除和代谢相关(Fraser2010，Samstad 2014)。一旦结合，C1q就能够直接调节吞噬细胞的激活(Fraser 2010，Benoit 2012)。然而，当单独结合的C1q诱导抗炎性(M2样)巨噬细胞表型时，额外存在的针对C1q的自身抗体(抗C1q)，如发生在全身性自身免疫中，可将这种特征转化为促炎性(M1样)表型(Thanei 2016)。因此，考虑到巨噬细胞在动脉粥样硬化中的公认作用，巨噬细胞C1q和二次结合至C1q的分子之间的相互作用需要进一步研究。

在这种情形下，重要的是要注意，已知参与动脉粥样硬化的止血系统组分已经证明与补体C1q相互作用。在这些止血组分中，血小板以及冯维勒布兰德因子(vWF)似乎特别重要。激活的血小板似乎具有促动脉粥样硬化以及调节和组织/血管重塑作用，这些作用受血管损伤和炎症部位C1q存在的影响。根据这些观察，血小板已被描述为表达几种补体受体，包括C1q的那些补体受体(Peerschke 2001)，并且能够通过C1q的连续表面沉积诱导经典途径激活。

关于vWF，众所周知，这种分子是血小板的重要配体，并且也参与动脉粥样硬化的发病机制(van Galen 2012)。vWF是一种大型多聚体糖蛋白，其在止血中具有两个关键功能，作为正常血小板粘附和聚集的桥联分子，以及充当循环中因子VIII的载剂蛋白。VWF由内皮细胞(约占循环vWF的90％)和巨核细胞合成。合成后，vWF亚基(250kD)形成二聚体，然后组装成由多至>40个的vWF单体组成的大型vWF多聚体，其储存在专门的细胞器中。在释放到循环中后，这些大型vWF多聚体在血管损伤部位介导血小板粘附和聚集，这一过程受ADAMTS13(vWF-裂解蛋白酶)对vWF的蛋白水解的调控。由于血小板和内皮下胶原存在多个相互作用位点，较大的vWF多聚体具有更高的血栓形成潜力。

我们已经证明结合的C1q允许vWF的额外结合，特别是在流动条件下发生时，并且这种结合诱导血小板滚动和粘附。vWF与C1q的结合可被Fab抗C1q和C1q衍生肽(特别是肽A08，它是C1q胶原样区域上抗C1q的带正电荷表位)特异性抑制，这表明vWF结合至C1q的胶原样区域(CLR)的N末端部分上的一个隐蔽表位。可使用通过有限酶促消化获得的C1q片段来确认与C1q的CLR的结合。在剪切应力下，C1q-vWF相互作用强烈增强，类似于vWF与胶原I的结合，并且早在灌注开始后10秒就可观察到(图1A和图1B)。

另外，我们可证明C1q vWF复合物诱导血小板滚动和tim 1粘附，这在单独使用C1q时未观察到。结合至C1q的VWF在血小板募集方面比单独包被或经由抗vWF抗体包被的等量vWF更有效。此外，我们观察到与对照肾病相比，vWF与C1q阳性凋亡微粒(图2A至图2E)、与C1q阳性胆固醇晶体的结合以及SLE患者的C1q阳性肾小球中vWF沉积增加(图2A至图2E)。

有趣的是，C1q与vWF之间的相互作用也确实发生在胆固醇晶体的表面。这些观察结果强烈表明C1q与已经证明参与动脉粥样硬化的其他因子(即，巨噬细胞、血小板和vWF)之间存在复杂的相互作用。

总之，我们首次示出了vWF与补体C1q的结合，并因此止血起始分子与补体的经典途径之间存在直接相互作用。这种直接相互作用可能有助于补体介导的炎性疾病的致病机制(

假设

结合至补体C1q的VWF调节巨噬细胞的免疫响应。

目的

阐明C1q与止血之间的相互作用，特别是关于与动脉粥样硬化和血栓栓塞相关的机制。更具体地说，我们想要研究vWF结合至C1q对巨噬细胞表型的作用。

数据和研究计划

巨噬细胞从来源于瑞士巴塞尔献血中心招募的健康献血者的PBMC中获得。结合至C1q的vWF与吞噬细胞的相互作用仅通过体外实验室实验进行研究。没有对人受试者进行应用。这项研究使用重组VWF(rVWF)。

所有这三者，补体C1q、巨噬细胞和vWF，都参与动脉粥样硬化的发病机制。然而，虽然已经描述了C1q与巨噬细胞之间(Fraser 2010，Benoit 2012)、C1q与vWF之间以及vWF与巨噬细胞之间的相互作用(van Schooten 2008，CastroNunez 2012)，但所有三者之间的相互作用，即，结合至C1q的vWF与巨噬细胞的相互作用仍有待确定。更具体地说，与C1q结合的vWF可能会影响C1q诱导的巨噬细胞表型。这一假设得到了我们在将HMDM暴露于单独C1q或C1q-vWF复合物的实验中观察到的形态变化的支持(图3A和图3B)。

通过针对表面标志物、细胞因子释放和吞噬能力染色来扩展这一观察结果。另外，在流动条件下研究了外周血单核细胞与C1q和C1q-vWF复合物的相互作用，这已经证明与巨噬细胞与vWF之间的相互作用相关联(Castro-Nunez 2012)。最后，研究了C1q-vWF复合物与巨噬细胞之间的相互作用，然后使用更有功能的测定进行分析，将巨噬细胞暴露于胆固醇晶体(涂覆有单独C1q或与C1q复合的vWF)和/或凋亡微粒。这一点很重要，因为胆固醇晶体(Samstad 2014)以及凋亡细胞碎片两者已经证明结合C1q并伴随连续的补体激活，并且它们的清除机制似乎在动脉粥样硬化的发病机制中很重要。

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实施例2：冯维勒布兰德因子与补体C1q的结合减少了巨噬细胞中的胆固醇晶体的吞噬作用和连续IL-1分泌

摘要

补体C1q是经典途径的起始分子，可独立于补体激活发挥多种免疫调节功能。C1q的非经典功能包括清除凋亡细胞和胆固醇晶体(CC)以及调节由免疫细胞(诸如巨噬细胞)分泌的细胞因子。此外，已经证明C1q介导冯维勒布兰德因子(vWF)(初期止血的起始分子)的结合。然而，这种C1q-vWF相互作用对巨噬细胞对CC的吞噬作用的后果仍然难以捉摸。因此，我们使用CC-C1q-vWF复合物来研究对人单核细胞衍生巨噬细胞(HMDM)的免疫学作用。通过分析表面受体表达、CC复合物的吞噬作用、细胞因子分泌和胱天蛋白酶-1活性来探究HMDM。我们发现vWF仅以C1q依赖性方式结合至CC。与没有vWF的CC-C1q相比，巨噬细胞暴露于CC-C1q-vWF复合物导致吞噬作用介导受体MerTK、LRP-1和SR-A1以及共刺激受体CD14、LAIR1和PD-L1的表达上调，但在vWF存在下，CC-C1q复合物的晚期和早期吞噬作用受到阻碍。另外，这导致胱天蛋白酶-1激活减少和促炎性IL-1β细胞因子分泌、IL-1β/IL-1RA比和IL-1α/IL-1RA比连续降低。总之，我们的结果表明，发现vWF结合至C1q可明显调节C1q对HMDM的作用。以这种方式，C1q-vWF相互作用可能有利于延缓泡沫细胞形成和减弱炎症(Donat等人，Frontiers in Immunology，10(2019)1-11，Article 2712)。

补体系统是先天免疫系统的一个非常有效的部分。补体的多种功能包括防御细菌感染、桥联先天和适应性免疫以及清除免疫复合物和炎症组分(Walport，2001)。补体系统可通过三种不同的途径被激活：经典途径、凝集素途径和替代途径。所有三种途径汇聚在一个共同的末端响应中，导致形成C5a和C3a作为有效的炎性效应分子以及C5b-9作为膜攻击复合物。然而，每条途径都是通过不同的特征识别分子启动的(Morgan和Harris，2015)。C1q通过感知结合抗体以及病原体-和损伤-相关分子模式(PAMP/DAMP)触发经典途径的启动。另外，最近的研究表明C1q的许多功能不依赖下游补体激活(Nayak等认，2010)。一方面，用C1q调理可增强吞噬细胞对多种结构的清除，即免疫复合物(Bobak等人，1987)和凋亡细胞(Bohlson等人，2007)以及致动脉粥样硬化脂蛋白(Fraser和Tenner，2010)和胆固醇晶体(CC)(Samstad等人，2014)。另一方面，已经很好地描述了C1q的抗炎性性质。例如，结合的C1q会减少吞噬细胞对促炎性细胞因子的释放并增加吞噬细胞对抗炎性介体的产生(Fraser等人，2006；Fraser等人，2009)。另外，凋亡细胞上C1q的存在使巨噬细胞极化偏向抗炎性表型(Benoit等人，2012)。

除了广泛研究的C1q参与免疫之外，补体与凝血之间的复杂串扰变得越来越明显(Markiewski等人，2007)。

已发现补体组分可诱导止血，反之亦然，凝血因子可触发补体激活，因此组合了两个强大的血浆级联。在止血级联中，冯维勒布兰德因子(vWF)通过介导血小板粘附和聚集作为重要的起始分子。免疫细胞，诸如巨噬细胞能够通过清道夫受体吸收和清除vWF(vanSchooten等人，2008；Wohner等人，2018)。此外，vWF已经证明与补体因子H相互作用(Feng等人，2013；Turner和Moake，2013)，并且因此可通过替代途径调节补体的激活(Feng等人，2015)。此外，我们组发现了vWF与C1q之间的直接相互作用，证明结合至诸如凋亡细胞和CC的表面的C1q作为vWF的结合伴侣(Kolm等人，2016)。

CC可发现作为动脉粥样硬化动脉内膜的性能特点，从早期病变到晚期斑块(Franklin等人，2016)，并被广泛用作动脉粥样硬化的体外模型(Corr等人，2016；Zimmer等人，2016；Bakke等人，2017)。CC的形成发生在脂纹发展后，通过被称为泡沫细胞的富含脂质的巨噬细胞对胆固醇的摄取增加和流出耗尽导致。在动脉粥样硬化的体外和体内模型中，CC已经证明参与含有NOD[核苷酸寡聚化结构域]、LRR[富含亮氨酸的重复序列]和PYD[吡啶结构域]的蛋白质3(NLRP3)炎性体和下游细胞因子分泌的激活，从而触发局部和全身炎症(Abela，2010；Duewell等人，2010；Rajamaki等人，2010)。虽然CC和巨噬细胞在动脉粥样硬化中的作用似乎很明确，但C1q可以发挥双重作用。一方面，结合至氧化的低密度脂蛋白(LDL)或CC的C1q已经证明可激活经典途径，并在这种情形下驱动动物模型中动脉粥样硬化的进展(Schmiedt等人，1998；Buono等人，2002)。另一方面，C1q也已被描述为在体内早期动脉粥样硬化中具有保护作用(Bhatia等人，2007；Lewis等人，2009)并在体外增加胆固醇流出转运蛋白的表达(Fraser和Tenner，2010)，因此揭示了动脉粥样硬化保护性质。类似地，vWF在动脉粥样硬化中的作用仍然存在争议。尽管各种研究表明vWF缺乏提供对动物免受动脉粥样硬化的保护，但在人类中，vWF缺乏对动脉粥样硬化的明确保护作用迄今尚未得到证明(van Galen等人，2012)。

总之，CC、巨噬细胞、C1q和vWF都参与动脉粥样硬化。然而，C1q与vWF之间相互作用的后果，特别是对于吞噬细胞，仍有待确定。为了更好地理解这种相互作用，我们研究的目的是通过研究巨噬细胞的受体表达、吞噬作用和细胞因子分泌来探究由胆固醇晶体、C1q和冯维勒布兰德因子组成的复合物(CC-C1q-vWF复合物)的免疫作用。

材料和方法

CC的制备

将胆固醇(适用于细胞培养，Sigma Aldrich，St.Louis，MO，USA)在60℃下溶解在95％乙醇中(12.5g/l)，无菌过滤并使其在室温(RT)下结晶7天(d)。从悬浮液中除去过量的液体，然后干燥5天。最后，将CC研磨并储存在-20℃下直至进一步使用。

用于表征C1q和vWF结合的CC、CC-C1q和CC-C1q-vWF复合物的制备

将CC悬浮在PBS(Life Technology，Carlsbad，CA，USA)中并进行超声处理。为了产生CC-C1q复合物，加入50μg/ml纯化的C1q(Complement Technology，Tyler，Tx，USA)并在RT下于振荡器上孵育1小时(hr)。为了产生CC-C1q-vWF复合物，将10μg/ml重组vWF(由Shire，Lexington，MA，USA提供；表征描述于Turecek等人，

细胞培养

通过使用Lymphoprep(Stemcell Technologies，Vancouver，Canada)的Ficoll梯度离心从新鲜的血沉棕黄层(Blood Transfusion Centre of the University Hospitalof the University Hospital Basel，Basel，Switzerland)分离外周血单个核细胞。根据制造商的说明，通过CD14+磁激活细胞分选珠(Miltenyi，Bergisch Gladbach，Germany)获得单核细胞(通过流式细胞术测定产生95-98％CD14+单核细胞的平均纯度)。将单核细胞分化为人单核细胞衍生的巨噬细胞(HMDM)，在补充有1％青霉素/链霉素(DMEM+)、10％胎牛血清(FCS)(均来自Life Technology)和50ng/ml GM-CSF(Immunotools，Frisoythe，Germany)的DMEM中以0.5x10

用CC复合物处理

7天后，将HMDM用预热的DMEM+洗涤，任选地用100ng/ml脂多糖(LPS)(大肠杆菌O127：B8，Sigma Aldrich)刺激并用0.5mg/ml CC、CC-C1q或CC-C1q-vWF复合物处理(对于指定的时间点)。如上所述制备复合物，用PBS洗涤并重悬于DMEM+中，然后添加到细胞中。

表面受体表达

如上所述将HMDM用LPS刺激并用CC、CC-C1q或CC-C1q-vWF复合物处理。18小时后，将HMDM用PBS清洗，并在4℃下用PBS/10mM EDTA(AppliChem，Darmstadt，Germany)孵育30min。将细胞收集在FACS缓冲液(PBS/0.1％FCS/1mM EDTA)中并以5x10

将HMDM洗涤并重悬于FACS缓冲液中。使用BD LSRFortessa(BD Biosciences)获取数据并使用FlowJo10进行分析。分别对SSC/CD14+细胞(抗体组1)或SSC/CD91+细胞(抗体组2)进行门控，并计算几何平均荧光强度(gMFI)。

吞噬作用测定

评估HMDM的颗粒度.如上所述，HMDM保持未经处理或用CC、CC-C1q或CC-C1q-vWF复合物处理。18小时后，将HMDM用PBS/10mM EDTA收集，并在FACS缓冲液中以5x10

经吞噬的pHrodo染色的CC复合物的评估.将HMDM用PBS/10mM EDTA收集，并以5x10

分泌细胞因子水平的量化

如上所述将HMDM用LPS刺激并用CC、CC-C1q或CC-C1q-vWF复合物处理。18小时后，收集上清液，离心去除细胞碎片和CC并储存在-80℃下直至测量。根据制造商的说明，使用ELISA试剂盒一式两份进行细胞因子分泌分析。使用Biolegend ELISA试剂盒测量IL-1β、IL-1α、IL-6和IL-10，使用AbcamELISA试剂盒测量IL-18和IL-1RA，并使用BD BioscienceELISA试剂盒测量TNFα。

胱天蛋白酶-1活性测定

如上所述，HMDM保持未经处理或用CC、CC-C1q或CC-C1q-vWF复合物处理。18小时后，将HMDM用PBS/10mMEDTA收集，并以5x10

统计分析

如果没有另外说明，数据表示为中位数±四分位距(IQR)。使用Wilcoxon配对符号秩检验来比较两组配对数据。当比较超过2组时，如所指定的使用重复测量(RM)ANOVA，随后进行Tukey后检验。使用统计软件包程序(GraphPad Prism 7，La Jolla，CA，USA)分析数据。p值＜0.05视为统计上显著的。

结果

vWF以C1q依赖性方式结合至CC

尽管C1q被描述为各种DAMP的经典调理素(Benoit等人，2012)，但这种补体分子也已经证明粘附于氧化的LDL(Fraser和Tenner，2010)。另外，Samstad等人在与人血浆孵育后证明了C1q结合在CC上(Samstad等人，，2014)。因此，我们首先分析了CC上的表面结合的C1q是否二次能够结合vWF。因此，我们通过流式细胞术(图4A至图4C)、共焦显微术(图4D)和成像流式细胞术(图4E)表征了vWF与固定在CC上的C1q的结合。CC表面上的C1q沉积示出在图4A中。在不存在C1q的情况下，CC与vWF的孵育显示出在CC表面上没有vWF沉积(图4B、图4C中的橙色直方图)。只有在存在表面结合的C1q的情况下，vWF才能结合(图4B、图4C中的绿色直方图)。在存在C1q的情况下vWF结合的gMFI是没有C1q的CC的67倍(C1q+vWF：gMFI的平均gMFI±SD为134,000土44,000对vWF：gMFI的平均gMFI±SD为2,000土500，p＝0.0087)。在下个步骤中，我们分析了结合至CC-C1q复合物的vWF的定位。使用共焦显微术，可在CC的表面上看到C1q和vWF。C1q和vWF染色共定位(图4D)。最后，我们使用成像流式细胞术来分析更大的CC群体。同样，我们在CC表面观察到类似的C1q和vWF合并染色模式(图4E)。

总之，结果表明结合的C1q介导vWF与CC的结合，而单独的vWF不能结合至CC的表面。

CC-C1q-vWF复合物上调HMDM的表面受体表达

巨噬细胞具有很高的可塑性，使这些细胞能够根据环境刺激改变其表型(Sica和Mantovani，2012)。在这种情形下，已经证明C1q引起MerTK受体的上调表达，所述受体参与死细胞去除过程，称为胞葬作用(Galvan等人，2012)。此外，已经针对C1q描述了巨噬细胞向抗炎性状态的极化(Thanei和Trendelenburg，2016)。因此，我们旨在研究我们体外模型中HMDM的表型。出于此目的，HMDM保持未经处理或用CC、CC-C1q或CC-C1q-vWF复合物处理18小时。为了模拟存在于例如动脉粥样硬化斑块中的炎性环境(Ross，1999)，将HMDM同时暴露于100ng/ml LPS持续18小时。通过分析表面CD14、CD86、LAIR1、LRP-1、MerTK、MHC II、PD-L1和SR-A1的表达来研究表型(图2A-H)。与CC-C1q复合物相比，用CC-C1q-vWF复合物刺激的HMDM显著上调CD14(p＝0.0312)、LAIR1(p＝0.0312)、LRP-1(p＝0.0312)、MerTK(p＝0.0312)、PD-L1(p＝0.0312)和SR-A1(p＝0.0312)的表达。在六个供体中的四个中，CD86表达上调，而在六个供体中的五个中MHC II表达下调。CD86和MHC II的中位受体表达均未受到显著影响。此外，与未经处理的HMDM相比，CC处理不会引起表面受体表达的任何显著变化(数据未示出)。

我们结果表明，CC-C1q-vWF复合物通过上调胞吐受体MerTK、清道夫受体LAIR1、LRP-1和SR-A1以及共刺激受体(即，CD14和PD-L1)来独特地影响表面受体的表达。

HMDM对CC-C1q-vWF复合物的吞噬作用受到阻碍

由于C1q参与胞葬作用(Taylor等人，2000)以及吞噬作用(Fraser等人，2009)的过程，并且由于vWF的额外存在上调了胞葬作用和清道夫受体(图5A至图5H)，我们接下来探究了C1q-vWF结合在HMDM摄取CC复合物中的作用(图6A至图6D)。因此，HMDM保持未经处理或用CC、CC-C1q或CC-C1q-vWF复合物处理18小时。CC的吞噬作用导致细胞颗粒度的增加，这可使用流式细胞术通过SSC的转变来测定。作为对照分析，未经处理的CD11c+ HMDM不表达SSC高群体。当HMDM用CC、CC-C1q或CC-C1-vWF复合物处理时，所述细胞表现出SSC

总之，与CC-C1q复合物相比，HMDM降低了CC-C1q-vWF复合物的晚期以及早期吞噬作用。

CC-C1q-vWF复合物降低HMDM的IL-1细胞因子分泌

CC已被反复描述为人单核细胞和巨噬细胞中IL-1β分泌的有效诱导剂(Duewell等人，2010)。相反，C1q已经证明可减弱相同细胞类型的促炎性细胞因子分泌(Thanei和Trendelenburg，2016)。因此，我们接下来检查了CC-C1q-vWF复合物对HMDM细胞因子谱的作用。出于此目的，将保持未经处理或用CC、CC-C1q或CC-C1q-vWF复合物处理的HMDM用100ng/ml LPS刺激18小时，并分析上清液中分泌的IL-1B、IL-1α、IL-1RA、IL-18、IL-6、IL-10和TNFα细胞因子水平(图7A至图7I)。与未经处理的HMDM相比，CC处理诱导由HMDM产生的强烈IL-1β和IL-1α分泌，以及IL-18分泌的适度增加。使用CC-C1q复合物观察到IL-1β和IL-1α的促炎性细胞因子稳健下降，以及IL-6和TNFα分泌呈下降趋势。CC-C1q复合物上额外存在的vWF导致IL-1β分泌(p＝0.0078)、IL-1β/IL-1RA比(p＝0.0078)和IL-1α/IL-1RA比的降低显著增强(p＝0.0234)。结合至CC-C1q复合物的vWF并没有显著改变所有其他细胞因子。根据添加的处理，HMDM细胞因子分泌的差异不归因于细胞死亡的差异，如通过早期和晚期细胞凋亡或坏死的量化所评估的(数据未示出)。

总之，我们的数据显示出在vWF存在的情况下，在暴露于CC-C1q复合物后，由HMDM产生的IL-1β细胞因子分泌以及IL-1β/IL-1RA和IL-1α/IL-1RA比进一步降低。这种降低似乎是IL-1特异性的。

CC-C1q-vWF复合物阻抑HMDM的胱天蛋白酶-1活性

众所周知，IL-1的成熟、裂解和分泌在转录以及转录后水平上受到调控。虽然原-IL-1β转录需要通过模式识别受体的启动信号，但成熟取决于NLRP3炎性体的形成和连续的胱天蛋白酶-1激活(Broz和Dixit，2016)。因此，我们旨在检查观察到的IL-1细胞因子分泌变化是否是先前NLRP3炎性体组装产生的作用。为了解决这一点，HMDM保持未经处理或用CC、CC-C1q或CC-C1q-vWF复合物处理18小时，并用FLICA探针量化对胱天蛋白酶-1激活的作用。在CC处理后，HMDM显示出FLICA信号明显增加，表明胱天蛋白酶-1活性。虽然CC上C1q的存在仅表现出胱天蛋白酶-1活性的轻微降低，但vWF的额外存在显著抑制了HMDM中的胱天蛋白酶-1活性(CC-C1q的六个独立供体中的中值FLICA+细胞(IQR)：11.54％(7.29％-28.38％)对CC-C1q-vWF：9.37％(5.92％-22.73％)，p＝0.0312))(图8B)。

总体而言，我们的数据显示，用CC-C1q-vWF复合物处理的HMDM表现出降低的胱天蛋白酶-1活性，这会影响NLRP3炎性体依赖性IL-1β的分泌。

讨论

补体与止血系统之间的串扰是广泛的，并且可为人体提供协同效益(Rayes等人，2014；Nissila等人，2018)。然而，许多相互作用的作用仍然未知。具体地说，尽管之前已经证明了结合的补体C1q与冯维勒布兰德因子之间的相互作用(Kolm等人，2016)，但它对免疫系统的影响仍有待阐明。在我们的研究中，我们现在说明胆固醇晶体(CC)提供了另一个允许C1q-vWF相互作用的生理表面。此外，我们发现vWF与C1q的结合能够通过上调吞噬作用介导受体和共刺激受体的表达、阻碍吞噬作用以及增强阻抑促炎性细胞因子分泌来调节巨噬细胞的免疫响应。

CC的沉积被描述为动脉粥样硬化斑块的标志。在识别为DAMP并被吞噬细胞摄取后，CC触发ROS形成和溶酶体渗漏，伴随着连续的NLRP3炎性体组装、胱天蛋白酶-1产生和IL-1β分泌。(Rajamaki等人，2010)。IL-1β分泌导致吞噬细胞通过放大环路与其他促炎性细胞因子和趋化因子协同作用进一步募集(Libby，2017)。吞噬细胞，尤其是巨噬细胞，还负责在外周循环利用LDL和胆固醇的基本功能，但在疾病过程中，当它们的循环能力不堪重负时，它们会发展成富含脂质的巨噬细胞衍生的泡沫细胞。在第一步中，那些泡沫细胞会因各种刺激而凋亡，诸如长时间的内质网应激。在第二步中，未充分清除的凋亡细胞(如由于缺乏胞葬作用而发生在晚期病变中)导致细胞坏死，进而促成坏死核心的形成(Tabas，2010)。因此，增强LDL和CC的摄入会促进泡沫细胞的发育，这被描述为在动脉粥样硬化的后期是有害的(Maguire等人，2019)。因此，CC诱导动脉炎症和动脉粥样硬化斑块不稳定的结论(Janoudi等人，2016)似乎是合理的。在动脉粥样硬化的情形下，补体C1q可视为是一把双刃剑。先前的研究表明，氧化LDL和修饰LDL的清除通过结合C1q可增强(Fraser和Tenner，2010)，但同时通过降低促炎性细胞因子分泌导致巨噬细胞向抗炎性表型极(Ho等人，2016)化另外，C1q诱导胆固醇流出转运蛋白的mRNA转录(Fraser和Tenner，2010)。与这些动脉粥样硬化保护特质相比，C1q被证明存在于来自人血浆的CC上(Pilely等人，2017)，并被发现与人动脉中的ApoE复合(Yin等人，2019)，在人动脉中其能够激活补体并因此有助于动脉粥样硬化进展(Niculescu等人，1985；Torzewski等人，1998)。

关于vWF，先前对vWF缺乏动物(van Galen)和ADAMTS13缺乏患者(不能裂解vWF多聚体)(Bettoni等人，2017)的研究表明，vWF的动脉粥样硬化和血栓进展作用。因此，可假设在巨噬细胞上的CC-C1q复合物上额外存在vWF会产生不利后果。然而，vWF与补体因子H的相互作用减弱了体外补体的促炎性作用(Rayes等人，2014)，并且随后vWF与C1q的结合对免疫响应的作用仍未探索。

以前，C1q和vWF被认为是独立作用的分子。在这里，我们鉴定了不仅是结合至CC表面的C1q的复杂形成，以及随后结合了vWF。与单独的CC-C1q复合物相比，用CC-C1q-vWF复合物处理HMDM会导致胞葬作用表面受体(MerTK)、清道夫受体(LRP-1和SR-A1)和共刺激受体(CD14、LAIR1和PD-L1)的表达上调。调查吞噬作用介导受体MerTK和LRP-1作用的研究表明动脉粥样硬化保护特性(Cai等人，2017；Mueller等人，2018)，而SR-A1在心血管疾病中的作用仍然存在争议(由Ben及其同事综述(Ben等人，2015))。另外，LAIR1被描述为对泡沫细胞形成具有有益作用(Yi等人，2018)。因此，我们接下来试图确定对HMDM吞噬能力的作用。有趣的是，vWF在CC-C1q复合物上的存在大大降低了HMDM对CC的晚期以及早期吞噬作用，从而逆转了单独C1q的作用。这一意外发现的一个可能解释是吞噬作用介导受体的上调表达代表一个增强的反馈环路，所述回路被触发以补偿CC-C1q-vWF复合物的摄入减少。最后，我们的数据说明，与没有vWF的CC-C1q复合物相比，当用CC-C1q-vWF复合物处理时，HMDM的IL-1细胞因子分泌显著减少。抗IL-1β抗体卡纳单抗(Canakinumab)抗炎性血栓形成结果研究(CANTOS)证明了IL-1在心血管疾病中的临床意义(Ridker等人，2017)。因此，吞噬作用和炎症的减少可延缓斑块的进展(Libby，2002；Moore等人，2013)。

我们的研究的一个限制是体外特征不能完全反映可能更复杂的人体内情况。然而，C1q在人动脉粥样硬化中的作用得到了表明C1q在患者动脉粥样硬化颈动脉中表达的研究的支持(Vlaicu等人，1985；Cao等人，2003；Peerschke等人，2004)，并且因此强调了我们结果的相关性。其次，在体内，剪切应力对于发挥vWF的全部功能潜力是必要的(Springer，2014)。然而在我们的研究中，没有施加永久剪切应力，因为剪切应力的生理发生宁可反映斑块破裂期间由连续血流引起的情况，而不是斑块本身内部的情况。

最后，C1q-vWF相互作用以CC-C1q-vWF复合物的形式对HMDM产生作用的机制可能是由于不同的作用模式。第一种可能是vWF对C1q分子的至少部分空间屏蔽，从而削弱C1q的作用(例如，图6A至图6D)。另一种作用模式可能是vWF的独立作用(例如，图5A至图5H和图7A至图7I)。未来的研究将不得不探索负责CC-C1q-vWF复合物整体影响的潜在作用模式。另外，由于体内补体与止血系统之间的相互作用可能更复杂，我们的体外模型必须进一步开发以接近生理环境。最近，Gravastrand等人已经描述了CC诱导补体依赖性止血激活(Gravastrand等人，2019)。因此，下游补体组分，诸如C4和C3在我们系统中的实施及其在额外存在血小板的情况下对HMDM的作用值得未来开展更多工作。

总之，通过这项研究，我们对补体C1q和止血启动vWF之间的新兴串扰提供了新的见解。我们的研究结果表明，vWF与CC上的C1q结合可调控人单核细胞衍生的巨噬细胞的免疫响应。我们发现CC-C1q-vWF复合物会引起吞噬作用受阻，同时由巨噬细胞进行的IL-1细胞因子分泌也随之减少，这可能证明有利于减缓斑块进展。

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序列表

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 前原VWF的合成序列

<400> 1

agctcacagc tattgtggtg ggaaagggag ggtggttggt ggatgtcaca gcttgggctt 60

tatctccccc agcagtgggg actccacagc ccctgggcta cataacagca agacagtccg 120

gagctgtagc agacctgatt gagcctttgc agcagctgag agcatggcct agggtgggcg 180

gcaccattgt ccagcagctg agtttcccag ggaccttgga gatagccgca gccctcattt 240

gcaggggaag atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt 300

gccagggacc ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct 360

tttcggaagt gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg 420

cagttacctc ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca 480

gaatggcaag agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt 540

tgtcaatggt accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg 600

gctgtatcta gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt 660

ggccaggatc gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa 720

gacctgcggg ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga 780

agggaccttg acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga gcagtggaga 840

acagtggtgt gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat 900

gcagaagggc ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg 960

ccaccctctg gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg 1020

tgctgggggg ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca 1080

ggagggaatg gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc 1140

tggtatggag tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat 1200

caatgaaatg tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct 1260

ggatgaaggc ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta 1320

ccctcccggc acctccctct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg 1380

gatctgcagc aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc acaggtcaat cacacttcaa 1440

gagctttgac aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga 1500

ttgccaggac cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga 1560

cgctgtgtgc acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa 1620

actgaagcat ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac gtccagctcc ccctcctgaa 1680

aggtgacctc cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga 1740

cctgcagatg gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc 1800

cgggaagacc tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac 1860

cccctctggg ctggcggagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg 1920

ggactgccag gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac 1980

caggttctcc gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg 2040

tgccgtcagc ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga 2100

cggccgcgag tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg 2160

cgtgcgcgtc gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt 2220

gtacctgcag tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga 2280

ggaatgcaat gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga 2340

gaggggggac tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca 2400

gccagaagac atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca 2460

ctgtaccatg agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct 2520

gtctcatcgc agcaaaagga gcctatcctg tcggcccccc atggtcaagc tggtgtgtcc 2580

cgctgacaac ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga actatgacct 2640

ggagtgcatg agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca 2700

tgagaacaga tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca aggagtatgc 2760

ccctggagaa acagtgaaga ttggctgcaa cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa 2820

ctgcacagac catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac 2880

cttcgacggg ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta 2940

ctgcggcagt aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc 3000

ctcagtgaaa tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgagctgtt 3060

tgacggggag gtgaatgtga agaggcccat gaaggatgag actcactttg aggtggtgga 3120

gtctggccgg tacatcattc tgctgctggg caaagccctc tccgtggtct gggaccgcca 3180

cctgagcatc tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg gcctgtgtgg 3240

gaattttgat ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga 3300

ccctgtggac tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccagaaaagt 3360

gcctctggac tcatcccctg ccacctgcca taacaacatc atgaagcaga cgatggtgga 3420

ttcctcctgt agaatcctta ccagtgacgt cttccaggac tgcaacaagc tggtggaccc 3480

cgagccatat ctggatgtct gcatttacga cacctgctcc tgtgagtcca ttggggactg 3540

cgcctgcttc tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt 3600

ggtgacctgg aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga atctccggga 3660

gaacgggtat gagtgtgagt ggcgctataa cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg 3720

tcagcaccct gagccactgg cctgccctgt gcagtgtgtg gagggctgcc atgcccactg 3780

ccctccaggg aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg aagactgtcc 3840

agtgtgtgag gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag 3900

tgaccctgag cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct gtgaagcctg 3960

ccaggagccg ggaggcctgg tggtgcctcc cacagatgcc ccggtgagcc ccaccactct 4020

gtatgtggag gacatctcgg aaccgccgtt gcacgatttc tactgcagca ggctactgga 4080

cctggtcttc ctgctggatg gctcctccag gctgtccgag gctgagtttg aagtgctgaa 4140

ggcctttgtg gtggacatga tggagcggct gcgcatctcc cagaagtggg tccgcgtggc 4200

cgtggtggag taccacgacg gctcccacgc ctacatcggg ctcaaggacc ggaagcgacc 4260

gtcagagctg cggcgcattg ccagccaggt gaagtatgcg ggcagccagg tggcctccac 4320

cagcgaggtc ttgaaataca cactgttcca aatcttcagc aagatcgacc gccctgaagc 4380

ctcccgcatc accctgctcc tgatggccag ccaggagccc caacggatgt cccggaactt 4440

tgtccgctac gtccagggcc tgaagaagaa gaaggtcatt gtgatcccgg tgggcattgg 4500

gccccatgcc aacctcaagc agatccgcct catcgagaag caggcccctg agaacaaggc 4560

cttcgtgctg agcagtgtgg atgagctgga gcagcaaagg gacgagatcg ttagctacct 4620

ctgtgacctt gcccctgaag cccctcctcc tactctgccc cccgacatgg cacaagtcac 4680

tgtgggcccg gggctcttgg gggtttcgac cctggggccc aagaggaact ccatggttct 4740

ggatgtggcg ttcgtcctgg aaggatcgga caaaattggt gaagccgact tcaacaggag 4800

caaggagttc atggaggagg tgattcagcg gatggatgtg ggccaggaca gcatccacgt 4860

cacggtgctg cagtactcct acatggtgac tgtggagtac cccttcagcg aggcacagtc 4920

caaaggggac atcctgcagc gggtgcgaga gatccgctac cagggcggca acaggaccaa 4980

cactgggctg gccctgcggt acctctctga ccacagcttc ttggtcagcc agggtgaccg 5040

ggagcaggcg cccaacctgg tctacatggt caccggaaat cctgcctctg atgagatcaa 5100

gaggctgcct ggagacatcc aggtggtgcc cattggagtg ggccctaatg ccaacgtgca 5160

ggagctggag aggattggct ggcccaatgc ccctatcctc atccaggact ttgagacgct 5220

cccccgagag gctcctgacc tggtgctgca gaggtgctgc tccggagagg ggctgcagat 5280

ccccaccctc tcccctgcac ctgactgcag ccagcccctg gacgtgatcc ttctcctgga 5340

tggctcctcc agtttcccag cttcttattt tgatgaaatg aagagtttcg ccaaggcttt 5400

catttcaaaa gccaatatag ggcctcgtct cactcaggtg tcagtgctgc agtatggaag 5460

catcaccacc attgacgtgc catggaacgt ggtcccggag aaagcccatt tgctgagcct 5520

tgtggacgtc atgcagcggg agggaggccc cagccaaatc ggggatgcct tgggctttgc 5580

tgtgcgatac ttgacttcag aaatgcatgg tgccaggccg ggagcctcaa aggcggtggt 5640

catcctggtc acggacgtct ctgtggattc agtggatgca gcagctgatg ccgccaggtc 5700

caacagagtg acagtgttcc ctattggaat tggagatcgc tacgatgcag cccagctacg 5760

gatcttggca ggcccagcag gcgactccaa cgtggtgaag ctccagcgaa tcgaagacct 5820

ccctaccatg gtcaccttgg gcaattcctt cctccacaaa ctgtgctctg gatttgttag 5880

gatttgcatg gatgaggatg ggaatgagaa gaggcccggg gacgtctgga ccttgccaga 5940

ccagtgccac accgtgactt gccagccaga tggccagacc ttgctgaaga gtcatcgggt 6000

caactgtgac cgggggctga ggccttcgtg ccctaacagc cagtcccctg ttaaagtgga 6060

agagacctgt ggctgccgct ggacctgccc ctgcgtgtgc acaggcagct ccactcggca 6120

catcgtgacc tttgatgggc agaatttcaa gctgactggc agctgttctt atgtcctatt 6180

tcaaaacaag gagcaggacc tggaggtgat tctccataat ggtgcctgca gccctggagc 6240

aaggcagggc tgcatgaaat ccatcgaggt gaagcacagt gccctctccg tcgagctgca 6300

cagtgacatg gaggtgacgg tgaatgggag actggtctct gttccttacg tgggtgggaa 6360

catggaagtc aacgtttatg gtgccatcat gcatgaggtc agattcaatc accttggtca 6420

catcttcaca ttcactccac aaaacaatga gttccaactg cagctcagcc ccaagacttt 6480

tgcttcaaag acgtatggtc tgtgtgggat ctgtgatgag aacggagcca atgacttcat 6540

gctgagggat ggcacagtca ccacagactg gaaaacactt gttcaggaat ggactgtgca 6600

gcggccaggg cagacgtgcc agcccatcct ggaggagcag tgtcttgtcc ccgacagctc 6660

ccactgccag gtcctcctct taccactgtt tgctgaatgc cacaaggtcc tggctccagc 6720

cacattctat gccatctgcc agcaggacag ttgccaccag gagcaagtgt gtgaggtgat 6780

cgcctcttat gcccacctct gtcggaccaa cggggtctgc gttgactgga ggacacctga 6840

tttctgtgct atgtcatgcc caccatctct ggtctacaac cactgtgagc atggctgtcc 6900

ccggcactgt gatggcaacg tgagctcctg tggggaccat ccctccgaag gctgtttctg 6960

ccctccagat aaagtcatgt tggaaggcag ctgtgtccct gaagaggcct gcactcagtg 7020

cattggtgag gatggagtcc agcaccagtt cctggaagcc tgggtcccgg accaccagcc 7080

ctgtcagatc tgcacatgcc tcagcgggcg gaaggtcaac tgcacaacgc agccctgccc 7140

cacggccaaa gctcccacgt gtggcctgtg tgaagtagcc cgcctccgcc agaatgcaga 7200

ccagtgctgc cccgagtatg agtgtgtgtg tgacccagtg agctgtgacc tgcccccagt 7260

gcctcactgt gaacgtggcc tccagcccac actgaccaac cctggcgagt gcagacccaa 7320

cttcacctgc gcctgcagga aggaggagtg caaaagagtg tccccaccct cctgcccccc 7380

gcaccgtttg cccacccttc ggaagaccca gtgctgtgat gagtatgagt gtgcctgcaa 7440

ctgtgtcaac tccacagtga gctgtcccct tgggtacttg gcctcaactg ccaccaatga 7500

ctgtggctgt accacaacca cctgccttcc cgacaaggtg tgtgtccacc gaagcaccat 7560

ctaccctgtg ggccagttct gggaggaggg ctgcgatgtg tgcacctgca ccgacatgga 7620

ggatgccgtg atgggcctcc gcgtggccca gtgctcccag aagccctgtg aggacagctg 7680

tcggtcgggc ttcacttacg ttctgcatga aggcgagtgc tgtggaaggt gcctgccatc 7740

tgcctgtgag gtggtgactg gctcaccgcg gggggactcc cagtcttcct ggaagagtgt 7800

cggctcccag tgggcctccc cggagaaccc ctgcctcatc aatgagtgtg tccgagtgaa 7860

ggaggaggtc tttatacaac aaaggaacgt ctcctgcccc cagctggagg tccctgtctg 7920

cccctcgggc tttcagctga gctgtaagac ctcagcgtgc tgcccaagct gtcgctgtga 7980

gcgcatggag gcctgcatgc tcaatggcac tgtcattggg cccgggaaga ctgtgatgat 8040

cgatgtgtgc acgacctgcc gctgcatggt gcaggtgggg gtcatctctg gattcaagct 8100

ggagtgcagg aagaccacct gcaacccctg ccccctgggt tacaaggaag aaaataacac 8160

aggtgaatgt tgtgggagat gtttgcctac ggcttgcacc attcagctaa gaggaggaca 8220

gatcatgaca ctgaagcgtg atgagacgct ccaggatggc tgtgatactc acttctgcaa 8280

ggtcaatgag agaggagagt acttctggga gaagagggtc acaggctgcc caccctttga 8340

tgaacacaag tgtctggctg agggaggtaa aattatgaaa attccaggca cctgctgtga 8400

cacatgtgag gagcctgagt gcaacgacat cactgccagg ctgcagtatg tcaaggtggg 8460

aagctgtaag tctgaagtag aggtggatat ccactactgc cagggcaaat gtgccagcaa 8520

agccatgtac tccattgaca tcaacgatgt gcaggaccag tgctcctgct gctctccgac 8580

acggacggag cccatgcagg tggccctgca ctgcaccaat ggctctgttg tgtaccatga 8640

ggttctcaat gccatggagt gcaaatgctc ccccaggaag tgcagcaagt gaggctgctg 8700

cagctgcatg ggtgcctgct gctgcctgcc ttggcctgat ggccaggcca gagtgctgcc 8760

agtcctctgc atgttctgct cttgtgccct tctgagccca caataaaggc tgagctctta 8820

tcttgcaaaa ggc 8833

<210> 2

<211> 2783

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 前原VWF的合成序列

<400> 2

Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Leu Ile Leu Pro Gly

1 5 10 15

Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr Ala Arg Cys

20 25 30

Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly Ser Met Tyr

35 40 45

Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly Cys Gln Lys

50 55 60

Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys Arg Val Ser

65 70 75 80

Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu Phe Val Asn

85 90 95

Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro Tyr Ala Ser

100 105 110

Lys Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys Leu Ser Gly Glu Ala Tyr

115 120 125

Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly Asn Phe Gln Val Leu Leu

130 135 140

Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asn

145 150 155 160

Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln Glu Gly Thr Leu Thr Ser

165 170 175

Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala Leu Ser Ser Gly Glu Gln

180 185 190

Trp Cys Glu Arg Pro Ser Ser Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met

195 200 205

Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val

210 215 220

Phe Ala Arg Cys His Pro Leu Val Asp Pro Glu Pro Phe Cys Glu Lys

225 230 235 240

Thr Leu Cys Glu Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu

245 250 255

Leu Glu Tyr Ala Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly

260 265 270

Trp Thr Asp His Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu

275 280 285

Tyr Arg Gln Cys Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His

290 295 300

Ile Asn Glu Met Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro

305 310 315 320

Glu Gly Gln Leu Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys

325 330 335

Pro Cys Val His Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser

340 345 350

Arg Asp Cys Asn Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser

355 360 365

Asn Glu Glu Cys Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe

370 375 380

Lys Ser Phe Asp Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr

385 390 395 400

Leu Leu Ala Arg Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu

405 410 415

Thr Val Gln Cys Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val

420 425 430

Thr Val Arg Leu Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His

435 440 445

Gly Ala Gly Val Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu

450 455 460

Lys Gly Asp Leu Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu

465 470 475 480

Ser Tyr Gly Glu Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu

485 490 495

Leu Val Lys Leu Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys

500 505 510

Gly Asn Tyr Asn Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly

515 520 525

Leu Ala Glu Pro Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His

530 535 540

Gly Asp Cys Gln Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu

545 550 555 560

Asn Pro Arg Met Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr

565 570 575

Ser Pro Thr Phe Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr

580 585 590

Leu Arg Asn Cys Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu

595 600 605

Cys Leu Cys Gly Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg

610 615 620

Val Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly

625 630 635 640

Gln Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser

645 650 655

Leu Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys

660 665 670

Phe Cys Pro Pro Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys Ala Gln

675 680 685

Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp Ile Phe

690 695 700

Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met His Cys

705 710 715 720

Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val Leu Ser

725 730 735

Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro

740 745 750

Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu

755 760 765

Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met Ser Met

770 775 780

Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg His Glu

785 790 795 800

Asn Arg Cys Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala

805 810 815

Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp

820 825 830

Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr

835 840 845

Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe

850 855 860

Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn

865 870 875 880

Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro

885 890 895

Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu

900 905 910

Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp

915 920 925

Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu

930 935 940

Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser

945 950 955 960

Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly

965 970 975

Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln

980 985 990

Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser

995 1000 1005

Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala

1010 1015 1020

Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser

1025 1030 1035

Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu

1040 1045 1050

Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val Cys Ile Tyr Asp Thr Cys

1055 1060 1065

Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys Phe Cys Asp Thr Ile

1070 1075 1080

Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly Lys Val Val Thr

1085 1090 1095

Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu Glu Arg Asn

1100 1105 1110

Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn Ser Cys

1115 1120 1125

Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro Leu Ala

1130 1135 1140

Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro

1145 1150 1155

Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu

1160 1165 1170

Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly

1175 1180 1185

Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile

1190 1195 1200

Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu

1205 1210 1215

Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr Asp Ala Pro Val Ser Pro

1220 1225 1230

Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser Glu Pro Pro Leu His Asp

1235 1240 1245

Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu Val Phe Leu Leu Asp Gly

1250 1255 1260

Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe Glu Val Leu Lys Ala Phe

1265 1270 1275

Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg Ile Ser Gln Lys Trp Val

1280 1285 1290

Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp Gly Ser His Ala Tyr Ile

1295 1300 1305

Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu Leu Arg Arg Ile Ala

1310 1315 1320

Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln Val Ala Ser Thr Ser Glu

1325 1330 1335

Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile Phe Ser Lys Ile Asp Arg

1340 1345 1350

Pro Glu Ala Ser Arg Ile Thr Leu Leu Leu Met Ala Ser Gln Glu

1355 1360 1365

Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val Arg Tyr Val Gln Gly Leu

1370 1375 1380

Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro Val Gly Ile Gly Pro His

1385 1390 1395

Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile Glu Lys Gln Ala Pro Glu

1400 1405 1410

Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val Asp Glu Leu Glu Gln Gln

1415 1420 1425

Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala

1430 1435 1440

Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro Asp Met Ala Gln Val Thr Val Gly

1445 1450 1455

Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu Gly Pro Lys Arg Asn Ser

1460 1465 1470

Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu Glu Gly Ser Asp Lys Ile

1475 1480 1485

Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys Glu Phe Met Glu Glu Val

1490 1495 1500

Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp Ser Ile His Val Thr Val

1505 1510 1515

Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val Glu Tyr Pro Phe Ser Glu

1520 1525 1530

Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln Arg Val Arg Glu Ile Arg

1535 1540 1545

Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr Gly Leu Ala Leu Arg Tyr

1550 1555 1560

Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser Gln Gly Asp Arg Glu Gln

1565 1570 1575

Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr Gly Asn Pro Ala Ser Asp

1580 1585 1590

Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile Gln Val Val Pro Ile Gly

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Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu Leu Glu Arg Ile Gly Trp

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Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp Phe Glu Thr Leu Pro Arg

1625 1630 1635

Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg Cys Cys Ser Gly Glu Gly

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Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala Pro Asp Cys Ser Gln Pro

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Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly Ser Ser Ser Phe Pro Ala

1670 1675 1680

Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe Ala Lys Ala Phe Ile Ser

1685 1690 1695

Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr Gln Val Ser Val Leu Gln

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Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val Pro Trp Asn Val Val Pro

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Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val Asp Val Met Gln Arg Glu

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Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala Leu Gly Phe Ala Val Arg

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Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala Arg Pro Gly Ala Ser Lys

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Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val Ser Val Asp Ser Val Asp

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Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn Arg Val Thr Val Phe Pro

1790 1795 1800

Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala Ala Gln Leu Arg Ile Leu

1805 1810 1815

Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val Val Lys Leu Gln Arg Ile

1820 1825 1830

Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu Gly Asn Ser Phe Leu His

1835 1840 1845

Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile Cys Met Asp Glu Asp Gly

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His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly Gln Thr Leu Leu Lys Ser

1880 1885 1890

His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu Arg Pro Ser Cys Pro Asn

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Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu Thr Cys Gly Cys Arg Trp

1910 1915 1920

Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser Ser Thr Arg His Ile Val

1925 1930 1935

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1940 1945 1950

Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp Leu Glu Val Ile Leu His

1955 1960 1965

Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg Gln Gly Cys Met Lys Ser

1970 1975 1980

Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser Val Glu Leu His Ser Asp

1985 1990 1995

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2015 2020 2025

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Val Cys Glu Val Ile Ala Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn

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Gly Val Cys Val Asp Trp Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser

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2180 2185 2190

Arg His Cys Asp Gly Asn Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser

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2210 2215 2220

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2750 2755 2760

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<211> 2050

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 成熟VWF的合成序列

<400> 3

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Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln Val Ala

580 585 590

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1700 1705 1710

Cys Arg Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys

1715 1720 1725

Gly Arg Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro

1730 1735 1740

Arg Gly Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp

1745 1750 1755

Ala Ser Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val

1760 1765 1770

Lys Glu Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln

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Leu Glu Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys

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Thr Ser Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala

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Cys Met Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met

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Ile Asp Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val

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Ile Ser Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>补体C1q亚基A的合成序列

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Ser Ser Ser Arg Gly Gln Val Arg Arg Ser Leu Gly Phe Cys Asp Thr

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245

<210> 5

<211> 253

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>补体C1q亚基B的合成序列

<400> 5

Met Met Met Lys Ile Pro Trp Gly Ser Ile Pro Val Leu Met Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Gly Leu Ile Asp Ile Ser Gln Ala Gln Leu Ser Cys Thr

20 25 30

Gly Pro Pro Ala Ile Pro Gly Ile Pro Gly Ile Pro Gly Thr Pro Gly

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Pro Asp Gly Gln Pro Gly Thr Pro Gly Ile Lys Gly Glu Lys Gly Leu

50 55 60

Pro Gly Leu Ala Gly Asp His Gly Glu Phe Gly Glu Lys Gly Asp Pro

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Gly Ile Pro Gly Asn Pro Gly Lys Val Gly Pro Lys Gly Pro Met Gly

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Pro Lys Gly Gly Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Lys Gly Glu

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Ser Gly Asp Tyr Lys Ala Thr Gln Lys Ile Ala Phe Ser Ala Thr Arg

115 120 125

Thr Ile Asn Val Pro Leu Arg Arg Asp Gln Thr Ile Arg Phe Asp His

130 135 140

Val Ile Thr Asn Met Asn Asn Asn Tyr Glu Pro Arg Ser Gly Lys Phe

145 150 155 160

Thr Cys Lys Val Pro Gly Leu Tyr Tyr Phe Thr Tyr His Ala Ser Ser

165 170 175

Arg Gly Asn Leu Cys Val Asn Leu Met Arg Gly Arg Glu Arg Ala Gln

180 185 190

Lys Val Val Thr Phe Cys Asp Tyr Ala Tyr Asn Thr Phe Gln Val Thr

195 200 205

Thr Gly Gly Met Val Leu Lys Leu Glu Gln Gly Glu Asn Val Phe Leu

210 215 220

Gln Ala Thr Asp Lys Asn Ser Leu Leu Gly Met Glu Gly Ala Asn Ser

225 230 235 240

Ile Phe Ser Gly Phe Leu Leu Phe Pro Asp Met Glu Ala

245 250

<210> 6

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>补体C1q亚基C的合成序列

<400> 6

Met Asp Val Gly Pro Ser Ser Leu Pro His Leu Gly Leu Lys Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Arg Gly Gln Ala Asn Thr Gly Cys

20 25 30

Tyr Gly Ile Pro Gly Met Pro Gly Leu Pro Gly Ala Pro Gly Lys Asp

35 40 45

Gly Tyr Asp Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Ile Pro Gly Ile Arg Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Glu Pro Gly Leu

65 70 75 80

Pro Gly His Pro Gly Lys Asn Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly Met Pro

85 90 95

Gly Val Pro Gly Pro Met Gly Ile Pro Gly Glu Pro Gly Glu Glu Gly

100 105 110

Arg Tyr Lys Gln Lys Phe Gln Ser Val Phe Thr Val Thr Arg Gln Thr

115 120 125

His Gln Pro Pro Ala Pro Asn Ser Leu Ile Arg Phe Asn Ala Val Leu

130 135 140

Thr Asn Pro Gln Gly Asp Tyr Asp Thr Ser Thr Gly Lys Phe Thr Cys

145 150 155 160

Lys Val Pro Gly Leu Tyr Tyr Phe Val Tyr His Ala Ser His Thr Ala

165 170 175

Asn Leu Cys Val Leu Leu Tyr Arg Ser Gly Val Lys Val Val Thr Phe

180 185 190

Cys Gly His Thr Ser Lys Thr Asn Gln Val Asn Ser Gly Gly Val Leu

195 200 205

Leu Arg Leu Gln Val Gly Glu Glu Val Trp Leu Ala Val Asn Asp Tyr

210 215 220

Tyr Asp Met Val Gly Ile Gln Gly Ser Asp Ser Val Phe Ser Gly Phe

225 230 235 240

Leu Leu Phe Pro Asp

245