一种Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜SERS检测平台的制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种Au@AgNPs‑Van/PDMS薄膜SERS检测平台的制备方法及应用，首先制备Au@AgNPs溶胶，然后合成Au@AgNPs‑Van溶液，最后构建Au@AgNPs‑Van/PDMS薄膜SERS检测平台：对PDMS膜进行亲水处理，将亲水处理后的PDMS膜放入3‑氨基丙基‑三甲氧基硅烷中，过夜震荡培养，水洗后放入Au@AgNPs‑Van溶液中，反应取出得到Au@Ag NPs‑Van/PDMS薄膜。本发明实现了Au@AgNPs‑Van/PDMS薄膜SERS检测平台应用于实际牛肉样品中食源性致病菌的快速捕获富集及SERS检测，实现复杂溶液环境中食源性致病菌的快速捕获、富集、检测。

说明书

技术领域

本发明属于食源性致病菌检测技术领域，具体涉及一种Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜SERS检测平台的制备方法及应用。

背景技术

表面增强拉曼散射（surface-enhanced Raman Scattering，SERS）技术是一种高灵敏、快速、无损检测的光谱技术。由于其超高的灵敏度和指纹识别能力，已经成为食源性致病菌分析的一个理想选择，它克服了拉曼光谱信号微弱的缺点，可直接获得目标物质的指纹图谱。

目前，常用的增强基底主要为贵金属溶胶，但贵金属溶胶在定性定量过程中具有较大的局限性。普通的SERS基底对于SERS的增强没有选择性，抗干扰能力较差，食源性致病菌指纹信号的灵敏度、特异性及重复性都会受到复杂环境的影响。因此，普通SERS基底很难直接用于复杂样本中食源性致病菌的SERS指纹图谱采集。

近年来，研究人员开始使用表面修饰的SERS基底从复杂环境中分离细菌后完成SERS检测，如抗体、噬菌体等识别分子修饰金属纳米结构表面，但这些识别分子的成本高，操作要求高。万古霉素作为糖肽类抗菌药物，具有稳定性好、成本低、质量可控等优点，其羧基与细菌细胞壁成分胞壁酰五肽末端（D-Ala-D-Ala）形成氢键复合物而牢固结合，因此，万古霉素修饰的SERS底物可用于食源性致病菌的捕获和检测。另一方面，聚二甲基硅氧烷（PDMS）作为SERS活性纳米粒子的支撑材料受到了广泛的关注，其稳定好、制备简单，具有良好拉曼惰性和水溶液分析物富集作用。将PDMS膜作为固态衬底，结合具备核壳结构且SERS增强效果良好的Au@AgNPs溶胶与具备广谱捕获能力的万古霉素合成一种高效捕获、富集与SERS指纹检测的Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜SERS检测平台来实现复杂环境中食源性致病菌的捕获，是解决SERS应用局限的有效途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜SERS检测平台的制备方法及应用。通过设计了食源性致病菌在实际复杂环境中加标回收的步骤，实现了实际复杂基质中食源性致病菌的快速捕获、富集与 SERS指纹检测。本发明制得的SERS基底材料灵敏度高、重现性好，可以高效定性、定量检测复杂环境中食源性致病菌，为实现SERS技术在复杂环境中的快速、高灵敏检测应用提供技术支撑。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜SERS检测平台的制备方法，包括以下几个步骤：

（1）合成Au@AgNPs溶胶。将99mL去离子水和1mL氯金酸（1%，wt%）加入干净的三角瓶中，电磁加热搅拌器上加热至沸腾，搅拌速度控制在600转/分钟。快速将1.5 mL 檬酸钠溶液（1%，wt%）加入到沸腾的氯金酸溶液中并持续加热15~20 min，制得AuNPs溶胶溶液。然后取50 mL上述制备的AuNPs溶液加入150 mL去离子水和2 mL柠檬酸钠（1 %，wt%），加热至煮沸后搅拌，搅拌速度控制在600转/分钟。称取2 mg硝酸银溶解于1 mL去离子水中，并将硝酸银溶液快速滴加至上述煮沸溶液中，继续煮沸30~40 min。随后关闭加热器，反应溶液继续搅拌至室温后加去离子水将液体定容回200 mL体积，即为Au@AgNPs溶胶。

（2）合成 Au@AgNPs-Van溶液。10 mg Au@AgNPs溶胶加入10 mL的11-巯基十一烷酸（MUA）乙醇溶液（40 μM），超声反应1.5~2小时后用无水乙醇和超纯水清洗3遍，除去未反应的MUA。将获得的 Au@AgNPs-MUA 颗粒溶于2-( N-吗啉)乙磺酸（MES）缓冲液（0.1 M，pH5.5），超声10~15 min使其完全分散。依次加入1 mL碳二亚胺（EDC）水溶液（10 mg/mL）和1mL万古霉素溶液（Van，5 mg/mL）继续超声反应1.5~2小时，超纯水清洗3次制得Au@AgNPs-Van备用。

（3）构建Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜SERS检测平台。将PDMS薄膜用等离子清洗机（30W，10 min）进行处理，以提高其表面亲水性。使其表面覆盖一层紧密排列的羟基（-OH）。将亲水处理后的PDMS膜放入5%的APTMS溶液中，过夜震荡培养，取出后用无水乙醇于纯水清洗三次。APTMS溶液可以对PDMS膜表面硅烷化，APTMS中的甲氧基极易水解，水解产生的硅羟基（Si-OH）与PDMS膜羟基以氢键的方式结合，将APTMS组装于PDMS膜表面，末端暴露氨基（-NH

（4）将处理后的PDMS膜放入Au@AgNPs-Van溶液中，Au@AgNPs溶胶表面的Ag和APTMS暴露的氨基之间发生强烈的化学相互作用，引发Au@AgNPs在PDMS薄膜表面的自组装，Au@AgNPs溶胶能够吸附在PDMS膜上，从而构建“PDMS-Au@AgNPs-Van”的三明治结构，经过4 h后取出得到Au@Ag NPs-Van/PDMS薄膜。

本发明所述的Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜SERS检测平台在复杂环境中的应用，基于Au@Ag NPs-Van/PDMS薄膜SERS检测平台为SERS基底，用激光共聚焦拉曼应用于以下三方面检测分析。（1）基于Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜SERS检测平台对3种食源性致病菌进行快速识别的实际应用；（2）以金黄色葡萄球菌为例应用于SERS定量识别。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明构建了一种Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜SERS检测平台，设计了食源性致病菌在实际复杂基质中加标回收的步骤，实现了Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜SERS检测平台应用于实际牛肉样品中食源性致病菌的快速捕获富集及SERS检测。形成一种实现复杂溶液环境中食源性致病菌的快速捕获、富集、检测的新方法。

附图说明

图1为11-巯基十一烷酸（MUA）和万古霉素（Van）的分子结构示意图。

图2为万古霉素（Van）修饰Au@AgNP溶胶的原理示意图。

图3为Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜SERS检测平台的制备流程示意图。（A）PDMS薄膜亲水性处理及表面硅烷化示意图（B）Au@AgNPs-Van在PDMS薄膜上组装示意图。

图4为Au@AgNPs溶胶、Van溶液及Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜的表征。（A）为Au@AgNPs的粒径分布；（B）为Au@AgNPs的透射电镜图；（C）Au@AgNPs溶胶、Van溶液及Au@AgNPs-Van溶液的紫外可见光光谱；（D）为Au@AgNPs/PDMS薄膜的扫描电镜图。

图5为Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜SERS平台应用于牛肉样品中食源性致病菌的SERS光谱检测流程示意图。

图6为基于Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜SERS检测平台为基底对3种食源性致病菌使用激光共聚焦拉曼光谱仪进行SERS检测的平均指纹图谱。

图7为基于Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜SERS检测平台为基底对3种食源性致病菌进行SERS检测的重现性结果。（A）为产气荚膜梭菌（

图8为在实际牛肉样品加标回收处理过程中金黄色葡萄球菌生长情况及残留量。

图9为基于Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜SERS检测平台为基底对不同浓度金黄色葡萄球菌的SERS检测结果。图9（A）为基于Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜SERS检测平台为基底测定不同浓度金黄色葡萄球菌的拉曼图谱；图9（B）为不同浓度金黄色葡萄球菌浓度的对数值与其SERS光谱在1531 cm

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。

实施例1

如图2-3所示为Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜SERS检测平台的制备方法实施例的原理示意图及流程示意图，包括以下步骤：

（1）合成Au@AgNPs溶胶。将99 mL去离子水和1mL氯金酸（1%，wt%）加入干净的三角瓶中，电磁加热搅拌器上加热至沸腾，搅拌速度控制在600转/分钟。快速将1.5 mL檬酸钠溶液（1%，wt%）加入到沸腾的氯金酸溶液中并持续加热15~20 min，制得AuNPs溶胶溶液。然后取50 mL上述制备的AuNPs溶液加入150 mL去离子水和2 mL柠檬酸钠（1 %，wt%），加热至煮沸后搅拌，搅拌速度控制在600转/分钟。称取2 mg硝酸银溶解于1 mL去离子水中，并将硝酸银溶液快速滴加至上述煮沸溶液中，继续煮沸30~40 min。随后关闭加热器，反应溶液继续搅拌至室温后加去离子水将液体定容回200 mL体积，即为Au@AgNPs溶胶。

（2）合成Au@AgNPs-Van溶液。将10 mg Au@AgNPs溶胶加入10 mL的11-巯基十一烷酸（MUA）乙醇溶液（40 μM），超声反应1.5~2小时后用无水乙醇和超纯水清洗3遍，除去未反应的MUA。将获得的Au@AgNPs-MUA颗粒溶于2-( N-吗啉)乙磺酸（MES）缓冲液（0.1 M，pH5.5），超声10~15 min使其完全分散。依次加入1 mL碳二亚胺（EDC）水溶液（10 mg/mL）和1mL万古霉素溶液（Van，5 mg/mL）继续超声反应1.5~2小时，超纯水清洗3次制得Au@AgNPs-Van溶液备用。在合成Au@AgNPs-Van溶液的方法中11-巯基十一烷酸（MUA）具有双向修饰作用，其可以通过酰胺缩合反应将万古霉素偶联在MUA的末端羧基上，MUA 作为常用的多功能修饰链，一端是巯基可以通过Ag-S键牢固结合在Ag壳表面，另一端是羧基可以提供偶联万古霉素的位点。EDC溶液可以活化促进万古霉素与MUA之间的化学偶联（如图1和图2所示）。

（3）构建Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜SERS检测平台。将PDMS薄膜用等离子清洗机（30W，10 min）进行处理，以提高其表面亲水性。使其表面覆盖一层紧密排列的羟基（-OH）。将亲水处理后的PDMS膜放入5%的APTMS中，过夜震荡培养，取出后用无水乙醇于纯水清洗三次。APTMS溶液可以对PDMS膜表面硅烷化，APTMS的甲氧基极易水解，水解产生的硅羟基（Si-OH）与PDMS膜羟基以氢键的方式结合，将APTMS组装于PDMS膜表面，末端暴露氨基（-NH

（4）将处理后的PDMS膜放入Au@AgNPs-Van溶液中，Au@AgNPs表面的Ag和APTMS暴露的氨基之间发生强烈的化学相互作用，引发Au@AgNPs在PDMS薄膜表面的自组装，Au@AgNPs能够吸附在PDMS膜上，从而构建“PDMS-Au@AgNPs-Van”的三明治结构，经过4 h后取出得到Au@Ag NPs-Van/PDMS薄膜。如图3（B）所示。

对上述步骤得到的Au@AgNPs溶胶、Au@AgNPs-Van溶液及Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜分别进行表征，得到表征结果如图4所示。其中，图4（A）和（B）结果表明，Au@AgNPs溶胶呈Au核Ag壳夹层球体结构，Au@AgNPs的粒径大小主要分布在35-85 nm范围内，平均尺寸约为69nm。图4（C）结果表明，Au@AgNPs溶胶的紫外-可见吸收光谱在420 nm和517 nm处出现SPR吸收峰，经过万古霉素（Van）溶液孵育后的Au@AgNPs溶胶较于孵育前在280 nm处出现新的吸收峰。Van在EDC缓冲液体系中活化后，能够通过Ag-S键Au@AgNPs表面的纳米金结合，从而将Van固定在Au@AgNPs溶胶表面，证明了Van与Au@AgNPs溶胶的成功结合。图4（D）结果表明，SEM电镜图显示Au@AgNPs-Van颗粒均匀的分布在PDMS膜表面，表明Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜制备成功。

实施例2

食源性致病菌的培养：将-80 ℃磁珠保存产气荚膜梭菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌分别用FTG液体培养基、LB液体培养基和TSB液体培养基在37 ℃培养箱震荡培养18 h。将三种食源性致病菌的增菌液用无菌生理盐水离心清洗三次，重悬后稀释合适的梯度，各取100 μL均匀的涂在平板培养基上，置于37 ℃培养箱中培养24 h后根据长出的菌落数目计算初始菌液浓度。将其余的菌悬液分装保存在4 ℃冰箱中备用。

样品加标回收设置：将5 g新鲜牛肉装入无菌袋正反面紫外照射各30 min以消除杂菌干扰，之后在无菌操作台将其破碎均质加入45 mL无菌水混匀分装。取9 mL均质后的牛肉悬液分别加入1 mL 10

样品检测之前，以520.7 cm

图6结果可以看出基于Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜SERS检测平台为基底对3种食源性致病菌使用激光共聚焦拉曼光谱仪进行SERS检测的平均指纹图谱中拉曼振动峰出峰位置和出峰强度差异明显，可以清楚地区分不同食源性致病菌的拉曼信号及特征，表明以Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜为基底的SERS技术具有检测和区分实际牛肉样品不同种类食源性致病菌的能力。图7结果表明Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜基底材料对3种食源性致病菌SERS检测的重现良好，表明基于Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜为基底材料的SERS技术检测食源性致病菌具有良好重现性，为基于SERS技术对食源性致病菌的快速检测提供了强有力的支持。

实施例3

使用Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜SERS检测平台对牛肉样品中金黄色葡萄球菌的捕获效率进行检测，具体步骤如下：SERS基底的捕获效率对食源性致病菌检测灵敏度产生影响。为研究Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜SERS检测平台对食源性致病菌的捕获效率，本实例以金黄色葡萄球菌为检测对象，按照实例2中的方法进行金黄色葡萄球菌的培养纯化和加标回收，通过微生物“金标准”检测方法平板计数法，对牛肉悬液反接金黄色葡萄球菌后尚未过滤的微生物数量（C）、过滤液中的微生物残留量（C1）和漂洗液中微生物残留量（C2）进行计数，过滤率（Filtration rate，FR）由公式FR=C1/C×100%计算，捕获效率（Capturingefficiency，CE）可以CE=(C1-C2)/C1×100%来计算。结果如图8所示。过滤率过滤率（FR）为71.17 %，Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜对金黄色葡萄球菌的捕获效率（CE）约为69.4%。

实施例4

在实施例3的基础上，将不同浓度的金黄色葡萄球菌溶液按照1 mL：9 mL的比例与牛肉过滤液混合均匀后，使用Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜SERS检测平台对牛肉样品中金黄色葡萄球菌进行定量检测，按照实例2进行SERS光谱采集。

图9为基于Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜SERS检测平台为基底对不同浓度金黄色葡萄球菌的SERS检测结果。图9（A）为Au@AgNPs-Van/PDMS薄膜捕获到不同浓度金黄色葡萄球菌的SERS光谱，在 10

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，并非用来限定被发明范围。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应为本发明保护范畴。