一种慢性间歇性低氧肌肉损伤模型及其制备与应用

摘要

本发明涉及肌肉芯片技术领域，尤其是涉及一种慢性间歇性低氧肌肉损伤模型及其制备与应用。本发明首先在聚四氟乙烯板表面设置通道层，得到阳模；再将聚二甲基硅氧烷灌注于阳模上，后处理得到阴模；利用硅胶材料制备与阴模相匹配的硅胶框架；然后将阴模与硅胶框架叠合，后处理得到肌肉芯片；最后将成肌细胞、细胞培养液与细胞外基质的替代物混匀得到混悬液，然后将混悬液置于预处理的肌肉芯片中诱导分化，通过精密控氧系统培养得到慢性间歇性低氧肌肉损伤模型。本发明采用微加工技术提供了一个新的研究平台，模拟肌肉的核心组织结构，实现肌肉关键生理功能，并可以将其更有效的应用在阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征研究中。

说明书

技术领域

本发明涉及肌肉芯片技术领域，尤其是涉及一种慢性间歇性低氧肌肉损伤模型及其制备与应用。

背景技术

颏舌肌是上呼吸道最主要的扩张肌，也称为“上气道安全肌”，其功能异常在阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)的发病机制中占据重要位置。而OSAHS导致机体长期处于慢性间歇性低氧(CIH)状态又进一步加重了颏舌肌损伤，形成恶性循环。如果能彻底或部分修复颏舌肌损伤，恢复其功能状态，对于维持气道通畅、提升OSAHS疗效具有重要临床意义。但由于临床组织样品取材困难等问题，如何评估不同程度CIH对人颏舌肌在功能和形态等方面的影响，成为OSAHS基础研究领域亟需解决的关键问题。

目前针对OSAHS肌肉损伤的研究模型主要有传统细胞2D培养模型，缺点是细胞贴壁生长，细胞极性消失，失去了体内组织3D结构特征，不能反映复杂微环境中细胞之间，细胞与基质之间的相互作用关系，并且所反映的生物学特性与体内真实的生理、病理状况有一定的差异，更重要的是不能检测肌肉的收缩功能；CIH小鼠模型是目前OSAHS基础研究领域最常用的动物模型，但具有费用贵，耗时长，种属差异大等不可抗力缺点。因此构建一种可有效反应体内组织结构和功能特点的肌肉模型，可为OSAHS肌肉损伤研究提供一个有效的技术平台，从而加速这一领域的快速发展。

器官芯片(Organ-on-a-chip)是目前仿生人体器官最前沿技术之一，它堪称是将医药、微流控、组织工程和细胞重编程/转分化四大高新领域的重要集成，其核心是在体外构建器官的核心组织结构，实现器官的关键生理功能。无论在推进疾病体外模型发展，药物筛选和评价领域具有划时代的意义。器官芯片也越来越受到学术界、产业界和国家管理层面的认可。然而目前肌肉芯片平台的搭建相对复杂，更多的是依赖特殊的仪器和设备，很难在一般实验平台进行应用和推广。

发明内容

为了解决上述难题，本发明提供一种慢性间歇性低氧肌肉损伤模型及其制备与应用。本发明首先在聚四氟乙烯板表面设置通道层，得到阳模；再将聚二甲基硅氧烷灌注于阳模上，后处理得到阴模；利用硅胶材料制备与阴模相匹配的硅胶框架；然后将阴模与硅胶框架叠合，后处理得到肌肉芯片；最后将成肌细胞、细胞培养液与细胞外基质的替代物混匀得到混悬液，然后将混悬液置于预处理的肌肉芯片中诱导分化，通过精密控氧系统培养得到慢性间歇性低氧肌肉损伤模型。本发明采用微加工技术提供了一个新的研究平台，模拟肌肉的核心组织结构，实现肌肉关键生理功能，并可以将其更有效的应用在阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征研究中。

本发明通过微加工技术在聚四氟乙烯材料上制备两个平行的哑铃状通道，从而获得阳模；阳模灌注聚二甲基硅氧烷(PDMS)后，揭膜，可在PDMS上形成细胞可以寻址的图案化基底，使得加入的成肌细胞、细胞培养液以及细胞外基质(ECM)的替代物混匀得到混悬液凝固后可以形成类似肌肉的形状；之后在3D细胞的两端放置硅胶框架作为细胞两端的附着点，可为细胞生长提供特定方向的单轴机械张力；最后通过添加含有2％马血清的培养基来诱导成肌细胞分化成为肌束。

本发明中肌肉芯片直接放置于小皿底部，无需封接。本发明的肌肉芯片经过紫外照射消毒后，先用0.2％-2％

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的第一个目的是提供一种慢性间歇性低氧肌肉损伤模型的制备方法，包括以下步骤：

(1)阳模的制备：在聚四氟乙烯板表面设置通道层，得到阳模；

(2)阴模的制备：将聚二甲基硅氧烷灌注于步骤(1)制备得到的阳模上，后处理得到阴模；

(3)框架的制备：利用硅胶材料制备与步骤(2)得到的阴模相匹配的硅胶框架；

(4)肌肉芯片的制备：将步骤(2)制备得到的阴模与步骤(3)制备得到的硅胶框架叠合，后处理得到肌肉芯片；

(5)慢性间歇性低氧肌肉损伤模型的制备：将成肌细胞、细胞培养液与细胞外基质的替代物混匀得到混悬液，然后将混悬液置于预处理的肌肉芯片中诱导分化，通过精密控氧系统培养得到慢性间歇性低氧肌肉损伤模型。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，所述通道层为两个平行哑铃状通道；

所述哑铃状通道包括连接通道以及连接通道两侧的端部通道；

所述通道的高度为1-2mm。

在本发明的一个实施方式中，阳模的具体制备过程如下：通过3D CAD软件Solidworks设计两个平行的哑铃状结构；根据软件设计的参数，通过微加工技术在聚四氟乙烯板表面制备两个平行的哑铃状凸起通道，形成阳模。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，所述后处理为静置过夜后烘干，然后冷却、揭膜得到阴模；

所述阴模为存在的两个平行哑铃状凹槽的聚二甲基硅氧烷板；

所述哑铃状凹槽包括连接凹槽以及连接凹槽两侧的端部凹槽；所述哑铃状凹槽与哑铃状通道相匹配；

所述聚二甲基硅氧烷板的长度和宽度分别与聚四氟乙烯板长度和宽度相同；

两个平行哑铃状凹槽的高度为1-2mm。

在本发明的一个实施方式中，阴模的具体制备过程如下：利用聚二甲基硅氧烷(PDMS)作为阴模材料，将PDMS灌注于阳模上，并放于低温下静置过夜后将其取出放入烘箱内烘烤，最后放置室温冷却后揭膜，此时在PDMS板上形成具有两个平行的哑铃状结构的凹槽结构的阴模。

在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，所述硅胶框架为设置有方形孔洞的“回”字型框架；

所述方形孔洞的长度与连接凹槽长度相同；

所述方形孔洞与硅胶框架外侧沿长度方向的距离与端部通道宽度相同；

所述方形孔洞的宽度比两个哑铃状凹槽沿宽度方向的最远距离大0.5-1.5mm；

所述硅胶框架高度为0.4-0.5mm。

在本发明的一个实施方式中，硅胶框架的具体制备过程如下：通过3D CAD软件Solidworks设计方形外观；根据软件设计的参数，通过微加工技术用硅胶材料制备得到硅胶框架。

在本发明的一个实施方式中，步骤(4)中，叠合方式具体为将硅胶框架置于阴模有哑铃状凹槽的一侧，并通过无菌针头进行固定；

所述后处理为消毒处理。

在本发明的一个实施方式中，肌肉芯片的具体制备过程如下：将阴模和框架对接好，通过无菌细针头将二者穿插连接起来放置于细胞培养小皿或者6孔板内，紫外灯下消毒灭菌后，待用。

在本发明的一个实施方式中，步骤(5)中，所述预处理为将肌肉芯片浸入0.2％-2％

所述细胞培养液为含有10％FBS的培养基；

所述细胞外基质的替代物包括Matrigel胶、fibrinogen、凝血酶和抑肽酶；

成肌细胞、细胞培养液、Matrigel胶、fibrinogen、凝血酶和抑肽酶的用量比为7.5×10

诱导分化过程中，诱导分化时间为7-14天。

在本发明的一个实施方式中，预处理过程具体如下：为了形成3D肌束，将肌肉芯片浸入0.2％-2％

在本发明的一个实施方式中，步骤(5)中，精密控氧系统中，以低氧培养和常氧培养为一个循环，然后进行循环培养；

所述低氧培养过程中，保持培养环境中O

所述常氧培养过程中，保持培养环境中O

在本发明的一个实施方式中，每个循环中，保持低氧培养时间为30-40分钟，保持常氧培养时间为20-30分钟；

整个循环过程持续3-96h。

本发明的第二个目的是提供一种通过上述方法制备得到的慢性间歇性低氧肌肉损伤模型。

本发明的第三个目的是提供一种上述慢性间歇性肌肉损伤模型在阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征研究中的应用。

在本发明的一个实施方式中，首先待成肌细胞密度达80％以上时，0.25％胰酶消化，计数，最后确保每个凹槽内接种细胞数为7.5×10

在本发明的一个实施方式中，诱导成肌细胞分化形成肌束具体如下：待3D细胞培养3天稳定后，即可更换含有2％马血清的培养基进行诱导分化。每隔一天更换诱导分化的培养基。所述的2％马血清的培养基包含体积浓度为97％DMEM和1％双抗。

在本发明的一个实施方式中，检测肌束的形态具体如下：为了证明诱导成肌细胞分化和成熟情况，可将3D细胞在诱导第0、3、5、7、10和14天时对肌束进行肌节α-肌动蛋白(Sarcomericα-actinin,SAA)和肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,MHC)的免疫荧光染色，观察肌束的形态和成熟标志物的表达情况，通过量化分析评估肌束的成熟情况。

在本发明的一个实施方式中，检测肌束的收缩功能具体如下：将上述诱导分化成熟的3D肌束的两端放置于含有铂金电极装置中，通过电刺激装置刺激3D肌束收缩，通过量化3D肌束收缩位移情况来评估肌肉的收缩功能。

本发明的一种基于肌肉芯片生理模型构建的CIH肌肉损伤病理模型，将上述所获得肌肉芯片放置于CIH环境中可以评估不同程度CIH条件下对肌肉造成的损伤情况。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供了一种操作简单、重复性好的慢性间歇性低氧肌肉损伤模型制备方法，其创新性体现在：从细胞、ECM到机械力等方面更仿生肌肉微环境；肌束形态与体内肌肉组织更相似；可以检测肌束的收缩功能。相比较于传统的CIH小鼠模型，本发明提供的慢性间歇性低氧肌肉损伤模型可以模拟人肌肉，且具有价格低廉、实验周期短等优势。

(2)本发明将慢性间歇性低氧肌肉损伤模型应用于OSAHS的研究，可以精准评估不同程度CIH对肌肉在形态和功能等方面损伤情况，进而揭示OSAHS严重程度与肌肉损伤的相关性。

附图说明

图1为本发明的肌肉芯片中阳模的实物图；

图2为本发明的肌肉芯片中硅胶框架的实物图；

图3为本发明的慢性间歇性低氧肌肉损伤模型制备流程图；

图4为本发明的肌肉芯片中形成3D肌束实物图；

图5为本发明中成肌细胞接种于肌肉芯片后诱导分化不同天数后形成肌束的情况(图中依次显示肌肉在诱导分化第0、1、3、5、7、10和14天后SAA的免疫荧光染色图)；

图6为本发明中3D肌束在肌肉芯片上诱导分化不同时间后肌纤维直径和分化指数的量化分析图；其中*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；ns：无意义；

图7为本发明中检测肌肉芯片中3D肌束的收缩位移图；

图8为本发明中将肌肉芯片中形成的3D肌束放置于CIH环境中构建CIH损伤肌肉病理模型图；

图9为在CIH条件下肌肉芯片中肌纤维直径和长度的量化分析统计图；其中*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；

图中标号：1、阳模；11、端部通道；12、连接通道；13、聚四氟乙烯板；2、阴模；21、端部凹槽；22、连接凹槽；23、聚二甲基硅氧烷板；3、硅胶框架；31、方形孔洞；4、混悬液；5、肌束。

具体实施方式

本发明提供一种慢性间歇性低氧肌肉损伤模型的制备方法，包括以下步骤：

(1)阳模的制备：在聚四氟乙烯板表面设置通道层，得到阳模；

(2)阴模的制备：将聚二甲基硅氧烷灌注于步骤(1)制备得到的阳模上，后处理得到阴模；

(3)框架的制备：利用硅胶材料制备与步骤(2)得到的阴模相匹配的硅胶框架；

(4)肌肉芯片的制备：将步骤(2)制备得到的阴模与步骤(3)制备得到的硅胶框架叠合，后处理得到肌肉芯片；

(5)慢性间歇性低氧肌肉损伤模型的制备：将成肌细胞、细胞培养液与细胞外基质的替代物混匀得到混悬液，然后将混悬液置于预处理的肌肉芯片中诱导分化，通过精密控氧系统培养得到慢性间歇性低氧肌肉损伤模型。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，所述通道层为两个平行哑铃状通道；

所述哑铃状通道包括连接通道以及连接通道两侧的端部通道；

所述通道的高度为1-2mm。

在本发明的一个实施方式中，阳模的具体制备过程如下：通过3D CAD软件Solidworks设计两个平行的哑铃状结构；根据软件设计的参数，通过微加工技术在聚四氟乙烯板表面制备两个平行的哑铃状凸起通道，形成阳模。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，所述后处理为静置过夜后烘干，然后冷却、揭膜得到阴模；

所述阴模为存在的两个平行哑铃状凹槽的聚二甲基硅氧烷板；

所述哑铃状凹槽包括连接凹槽以及连接凹槽两侧的端部凹槽；所述哑铃状凹槽与哑铃状通道相匹配；

所述聚二甲基硅氧烷板的长度和宽度分别与聚四氟乙烯板长度和宽度相同；

两个平行哑铃状凹槽的高度为1-2mm。

在本发明的一个实施方式中，阴模的具体制备过程如下：利用聚二甲基硅氧烷(PDMS)作为阴模材料，将PDMS灌注于阳模上，并放于低温下静置过夜后将其取出放入烘箱内烘烤，最后放置室温冷却后揭膜，此时在PDMS板上形成具有两个平行的哑铃状结构的凹槽结构的阴模。

在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，所述硅胶框架为设置有方形孔洞的“回”字型框架；

所述方形孔洞的长度与连接凹槽长度相同；

所述方形孔洞与硅胶框架外侧沿长度方向的距离与端部通道宽度相同；

所述方形孔洞的宽度比两个哑铃状凹槽沿宽度方向的最远距离大0.5-1.5mm；

所述硅胶框架高度为0.4-0.5mm。

在本发明的一个实施方式中，硅胶框架的具体制备过程如下：通过3D CAD软件Solidworks设计方形外观；根据软件设计的参数，通过微加工技术用硅胶材料制备得到硅胶框架。

在本发明的一个实施方式中，步骤(4)中，叠合方式具体为将硅胶框架置于阴模有哑铃状凹槽的一侧，并通过无菌针头进行固定；

所述后处理为消毒处理。

在本发明的一个实施方式中，肌肉芯片的具体制备过程如下：将阴模和框架对接好，通过无菌细针头将二者穿插连接起来放置于细胞培养小皿或者6孔板内，紫外灯下消毒灭菌后，待用。

在本发明的一个实施方式中，步骤(5)中，所述预处理为将肌肉芯片浸入0.2％-2％

所述细胞培养液为含有10％FBS的培养基；

所述细胞外基质的替代物包括Matrigel胶、fibrinogen、凝血酶和抑肽酶；

成肌细胞、细胞培养液、Matrigel胶、fibrinogen、凝血酶和抑肽酶的用量比为7.5×10

诱导分化过程中，诱导分化时间为7-14天。

在本发明的一个实施方式中，预处理过程具体如下：为了形成3D肌束，将肌肉芯片浸入0.2％-2％

在本发明的一个实施方式中，步骤(5)中，精密控氧系统中，以低氧培养和常氧培养为一个循环，然后进行循环培养；

所述低氧培养过程中，保持培养环境中O

所述常氧培养过程中，保持培养环境中O

在本发明的一个实施方式中，每个循环中，保持低氧培养时间为30-40分钟，保持常氧培养时间为20-30分钟；

整个循环过程持续3-96h。

本发明提供一种通过上述方法制备得到的慢性间歇性低氧肌肉损伤模型。

本发明提供一种上述慢性间歇性肌肉损伤模型在阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征研究中的应用。

在本发明的一个实施方式中，首先待成肌细胞密度达80％以上时，0.25％胰酶消化，计数，最后确保每个凹槽内接种细胞数为7.5×10

在本发明的一个实施方式中，诱导成肌细胞分化形成肌束具体如下：待3D细胞培养3天稳定后，即可更换含有2％马血清的培养基进行诱导分化。每隔一天更换诱导分化的培养基。所述的2％马血清的培养基包含体积浓度为97％DMEM和1％双抗。

在本发明的一个实施方式中，检测肌束的形态具体如下：为了证明诱导成肌细胞分化和成熟情况，可将3D细胞在诱导第0、3、5、7、10和14天时对肌束进行肌节α-肌动蛋白(Sarcomericα-actinin,SAA)和肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,MHC)的免疫荧光染色，观察肌束的形态和成熟标志物的表达情况，通过量化分析评估肌束的成熟情况。

在本发明的一个实施方式中，检测肌束的收缩功能具体如下：将上述诱导分化成熟的3D肌束的两端放置于含有铂金电极装置中，通过电刺激装置刺激3D肌束收缩，通过量化3D肌束收缩位移情况来评估肌肉的收缩功能。

本发明的一种基于肌肉芯片生理模型构建的CIH肌肉损伤病理模型，将上述所获得肌肉芯片放置于CIH环境中可以评估不同程度CIH条件下对肌肉造成的损伤情况。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

在下面的实施例中，若无特殊说明，所用试剂均为市售试剂；所用检测手段及方法均为本领域常规检测手段及方法。

实施例1：肌肉芯片模型的制备。

如图1-3所示，首先通过3D CAD软件Solidworks设计两个平行的哑铃状结构；根据软件设计的参数，通过微加工技术在聚四氟乙烯板13表面制备哑铃状通道(包括连接通道12以及连接通道12两侧的端部通道11)，形成阳模1；两个哑铃状通道的长度、宽度和深度均相同。其中，连接通道12长度为7mm，宽度为2mm，深度为1.5mm；端部通道11垂直于连接通道12的长度为4mm，平行于连接通道12的长度为2mm，深度为1.5mm。相邻哑铃状通道之间的距离为4mm。

利用PDMS作为阴模2材料，将PDMS灌注于芯片阳模1上，并放于4℃冰箱内静置过夜，排除PDMS中的气泡。次日，将其取出放入烘箱内80℃烘烤1小时，PDMS凝固，放置室温冷却后，揭膜，此时在聚二甲基硅氧烷板23(PDMS板)上形成具有两个平行的哑铃状凹槽结构(包括连接凹槽22和连接凹槽22两侧的端部凹槽21)，即阴模2。

通过3D CAD软件Solidworks设计方形外观；根据软件设计的参数，通过微加工技术用硅胶材料制备硅胶框架3(设置有方形孔洞31的“回”字型框架)。硅胶框架参数为：外边宽度为12mm，长度为11mm；内边宽度为10mm，长度为7mm。上述的参数设置可以保证硅胶框架可与哑铃状凹槽相匹配。

将硅胶框架3置于阴模2有哑铃状凹槽的一侧，通过3号无菌细针头穿插连接起来放置于细胞培养小皿或者6孔板内，无需封接，并一起放置于紫外灯下消毒至少1小时后灭菌，待用，得到肌肉芯片。

实施例2：基于肌肉芯片平台诱导C2C12成肌细胞分化为肌纤维。

肌肉芯片具体操控流程图如图3所示。制备好完整的肌肉芯片后，为了在肌肉芯片中形成3D肌束，将C2C12细胞接种于芯片前需肌肉芯片浸入0.2％

制备混悬液4：首先待成肌细胞密度达80％以上时，胰酶消化，并计数，最后确保每个凹槽内接种细胞数为7.5×10

诱导成肌细胞分化形成肌束5：待3D细胞培养3天稳定后，即可更换含有2％马血清的培养基进行诱导分化。每隔一天更换诱导分化的培养基。所述的2％马血清的培养基包含体积浓度为97％DMEM和1％双抗，其中图4为肌肉芯片中诱导14天形成的肌束实物图。

实施例3：检测肌肉芯片中形成3D肌束的形态。

为了证明诱导成肌细胞分化和成熟情况，可将肌肉芯片中形成的C2C12细胞在诱导第0、3、5、7、10和14天时对肌束进行SAA的免疫荧光染色。首先将诱导分化不同时间点的肌束放置于2％的PFA中4℃过夜固定；次日弃掉PFA，PBS冲洗3次，每次10分钟；之后加入含有0.2％Triton-100 X的山羊血清封闭液室温封闭1小时；回收封闭液，无需冲洗，加入SAA一抗稀释液(1：100，Sigma)，4℃过夜。次日，将样品放于室温复温1小时，回收一抗稀释液，PBS冲洗3次，每次10分钟。加入山羊抗小鼠二抗(1：1000，Abcam)，4℃过夜。次日回收二抗，PBS冲洗3次，每次10分钟，加入DAPI(1：10000，碧云天)室温孵育15分钟，PBS冲洗3次，每次10分钟。染色结束后，放置于共聚焦显微镜下拍照记录肌束的形态，并通过量化分析评估肌束的成熟情况。由图5-6可知相比较于第0、3、5、7和10天，C2C12细胞在诱导分化第14天的时候，肌纤维的直径最大、细胞分化指数最高。

实施例4：检测肌肉芯片中形成3D肌束的收缩情况。

将C2C12细胞在肌肉芯片中诱导分化14天后，将其放置于两端含有铂金电极的电刺激装置中，并施加一定的电刺激。当场强为20V/cm、脉宽为10ms时可以有效刺激肌肉收缩。由图7可以看到3D肌束经过0.5Hz的电刺激时，3D肌束可以发生单收缩；10Hz频率的电刺激时，3D肌束可发生强直收缩。

实施例5：基于肌肉芯片构建CIH损伤肌肉芯片病理模型。

将C2C12细胞在肌肉芯片中诱导分化14天后，放置于Biospherix(Oxycycler，C42，USA)精密控氧系统中，进行病理造模。其中CIH条件为其中CIH条件为：1％O

为了检测3D肌束在CIH环境下的损伤情况，将置于CIH环境第一天、第二天、第三天和第四条的3D肌束进行MHC和SAA的免疫荧光染色。免疫荧光染色方法如上述所示，其中MHC的使用浓度为1：10(DSHB)。染色结束后将3D肌束放置于共聚焦显微镜下拍照记录肌束的形态，并通过量化分析肌束的损伤情况。

由图8显示了3D肌束暴露于CIH环境不同天数时，肌束形态变化。如在CIH环境第一天时，肌纤维开始出现明显的水肿和断裂；随着时间推移，肌纤维逐渐变细、变短，最后肌纤维形态几乎完全消失；图9量化分析肌纤维的直径和长度显示3D肌束暴露于CIH环境越久损伤越大。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。