偃麦草着丝粒区的特异探针及其应用

摘要

本发明公开了偃麦草着丝粒区的特异探针，该探针为pThp901，荧光标记的单链DNA，所述单链DNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述偃麦草为长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum)和/或中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)。本发明的pThp901可辅助识别小麦背景下的偃麦草染色体或其片段，相较于GISH分析，使用本发明的探针pThp901进行FISH鉴定，无需使用封阻，信号更强，因此更加方便快捷。探针pThp901还可用来探究整臂易位染色体的着丝粒组成。因此利用本发明的探针pThp901可推进偃麦草与小麦着丝粒序列的研究，助力小麦染色体工程育种。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体公开了一种偃麦草着丝粒区的特异探针及其应用。

背景技术

着丝粒在有丝分裂和减数分裂过程中发挥重要的功能。其组蛋白变体CENH3与微管蛋白互作，参与染色体的正确分离(Lermontova et al.2011)。虽然着丝粒的功能十分保守，但是其DNA序列发生快速进化，这种现象被称为“着丝粒悖论” (Henikoff etal.2001)。不同物种的着丝粒差别很大，主要分为点着丝粒、区间着丝粒和弥散着丝粒三类(Allshire and Karpen,2008)。芽殖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的着丝粒仅含有一个核小体，称之为点着丝粒，其核心DNA序列长度约 120bp，由富含AT的核心区CDEII(centromere DNA element II)和两个保守的侧翼序列CDEI、CDEIII组成，其中蛋白复合体与CDEI和CDEII结合，共同行使功能(Meluh et al.1998)。线虫等的整条染色体均具有着丝粒的功能，这种着丝粒称之为弥散着丝粒(Nagaki et al.2009)。高等真核生物的着丝粒包含数个kb至Mb 长度的DNA序列，这种着丝粒称之为区间着丝粒。区间着丝粒的DNA长度要比点着丝粒长，并且包含大量的串联重复序列(Jiang et al.2003)。像人类着丝粒的DNA 序列是由171bp的串联重复序列组成(Wevrick and Willard,1989)，拟南芥着丝粒 DNA序列是由180bp的串联重复序列组成(Martinez-Zapater et al.1986)。禾本科作物中一些着丝粒串联重复单元被发现并命名，如水稻的CentO序列和玉米的 CentC序列等(Cheng etal.2002；Zhong et al.2002)。着丝粒及附近区域是多倍体亚基因组分化的核心区域，因此研究小麦野生近缘种的着丝粒结构是开发其潜在育种价值的基础。小麦与黑麦1BL/1RS易位系是应用外源染色体改良小麦的成功范例，对世界小麦的生产做出了重大贡献。Wang等(2017)通过利用6C6和pAWRC.1 两种荧光探针对136份生产上广泛应用的1BL/1RS易位系品种进行FISH鉴定，发现其着丝粒均为融合着丝粒，即一部分来源于小麦，一部分来源于黑麦。该研究进一步利用单体附加系错分裂和花粉辐射的方法，创制了100份新的1R易位系。这些易位系具有融合着丝粒、小麦着丝粒和黑麦着丝粒等不同的着丝粒结构，其中以小麦与黑麦融合着丝粒居多。

长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum，2n＝10x＝70)是禾本科多年生牧草。它抗病性强，对小麦锈病、白粉病和赤霉病等常见病害均具有很强的抗性，在小麦远缘杂交和染色体工程育种中发挥了重要作用。中国科学院西北植物所育成的小偃6号新品种于1981年通过陕西省审定，开创了小麦远缘杂交品种在生产上大面积推广的先例，并成为小麦育种中的骨干亲本。研究长穗偃麦草的着丝粒结构，对于解释其成功应用具有指导意义。Zhao等(2019)研究表明，小麦着丝粒区反转录转座子CRW和Quinta 同样存在于长穗偃麦草中。此外长穗偃麦草及其祖先种E组着丝粒区多包含CRW和 Quinta，而St组多包含Abigail和CentSt。该研究表明偃麦草与小麦着丝粒序列的同质性是偃麦草得以在小麦育种中成功应用的关键因素。

参考文献

Lermontova I,Koroleva O,Rutten T,Fuchs J,Schubert V,Moraes I,KoszegiD, Schubert I(2011)Knockdown of CENH3 in Arabidopsis reduces mitoticdivisions and causes sterility by disturbed meiotic chromosomesegregation.Plant J68:40-50.

Henikoff,S,Ahmad,K.Malik,HS(2001).The centromere paradox:stableinheritance with rapidly evolving DNA.Science293:1098-1102.

Allshire,R.C.,and Karpen,G.H.(2008).Epigenetic regulation ofcentromeric chromatin:old dogs,new tricks？Nat.Rev.Genet.9,923-937.

Meluh PB,Yang P,Glowczewski L,Koshland D,Smith MM.Cse4p is acomponent of the core centromere of Saccharomyces cerevisiae.Cell.1998Sep 4；94(5):607-13.

Nagaki K.,Walling J.,Hirsch C.,Jiang J.,Murata M.(2009)Structure andEvolution of Plant Centromeres.In:Ugarkovic D.(eds)Centromere.Progress inMolecular and Subcellular Biology,vol 48.Springer,Berlin,Heidelberg. https://doi.org/10.1007/978-3-642-00182-6。

Jiang JM,Birchler JB,Parrott WA,et al.(2003)A molecular view of plantcentromeres.Trends Plant Sci 8:570-575.

Wevrick R,Willard HF(1989)Long-range organization of tandem arrays ofalpha satellite DNA at the centromeres of human chromosomes:high-frequencyarray-length polymorphism and meiotic stability.Proc Natl Acad Sci USA 86:9394–9398

Martinez-Zapater J,Estelle MA,Somerville CR(1986)A highly repeatedDNA sequence in Arabidopsis thaliana.Mol Gen Genet 204:417–423.

Cheng Z,Dong F,Langdon T,Ouyang S,Buell CR,Gu M,Blattner FR,Jiang J(2002)Functional rice centromeres are marked by a satellite repeat and acentromere-specific retrotransposon.Plant Cell 14:1691–1704.

Zhong CX,Marshall JB,Topp C,Mroczek R,Kato A,Nagaki K,Birchler JA,Jiang J,Dawe RK(2002)Centromeric retroelements and satellites interact withmaize kinetochore protein CENH3.Plant Cell 14:2825–2836.

Zhao J,Hao WW,Tang CG,Yao H,Li BC,Zheng Q,Li ZS,Zhang XY(2019)Plasticity in Triticeae centromere DNA sequences:a wheat×tall wheatgrass(decaploid)model.The Plant J 100:314-327.

Wang J,Liu YL,Su HD,Guo XR,Han FP(2017)Centromere structure andfunction analysis in wheat-rye translocation lines.The Plant J 91:199-207.

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何识别小麦背景下长穗偃麦草(Thinopyrumponticum，2n＝10x＝70)和中间偃麦草(Thinopyrum intermedium，2n＝6x＝42)染色体或其片段。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了单链DNA分子，所述单链DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的反向互补序列。

本发明还提供所述的单链DNA分子在制备鉴别或辅助鉴别偃麦草着丝粒区的探针中的应用。

所述偃麦草为长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum，2n＝10x＝70)和/或中间偃麦草 (Thinopyrum intermedium，2n＝6x＝42)。

本发明所提供的鉴别或辅助鉴别偃麦草着丝粒区的探针，名为pThp901，其为荧光标记的单链DNA，所述单链DNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述荧光标记，可选自Texas-red-5-dCTP或Alexa Fluor-488-dUTP中的任一。

本发明还提供以所述探针鉴别或辅助鉴别偃麦草着丝粒区的方法，包括以待测植物的基因组DNA为模板，以所述探针进行荧光原位杂交(Fluorescence in situhybridization，FISH)分析的步骤。

上述方法中，所述待测植物可为小偃麦。所述小偃麦为偃麦草与普通小麦(六倍体)杂交的衍生后代。所述偃麦草为长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum，2n＝10x＝70) 和/或中间偃麦草(Thinopyrum intermedium，2n＝6x＝42)。

本发明还所提供分析植物着丝粒区的方法，包括如下步骤：

1)以待测植物的基因组DNA为模板，以所述探针进行荧光原位杂交(Fluorescencein situ hybridization，FISH)分析；

2)根据荧光原位杂交分析结果确定待测植物染色体的着丝粒区来源：所述荧光原位杂交分析结果为有荧光的待测植物染色体，其着丝粒区来源或候选来源于偃麦草；所述荧光原位杂交分析结果为无荧光的待测植物染色体，其着丝粒区不来源或候选不来源于偃麦草。

上述方法中，所述偃麦草为长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum，2n＝10x＝70)和/或中间偃麦草(Thinopyrum intermedium，2n＝6x＝42)。

上述方法中，所述待测植物可为小偃麦。所述小偃麦为偃麦草与普通小麦(六倍体)杂交的衍生后代。所述偃麦草为长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum，2n＝10x＝70) 和/或中间偃麦草(Thinopyrum intermedium，2n＝6x＝42)。

为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴别或辅助鉴别偃麦草着丝粒区和/或分析植物着丝粒区的系统。

本发明所提供的鉴别或辅助鉴别偃麦草染色体着丝粒区和/或分析植物染色体着丝粒区的系统，由X1和X2组成；所述X1为所述探针，所述X2为进行FISH分析所需的试剂和/或仪器。

上述系统中，所述偃麦草为长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum，2n＝10x＝70)和/或中间偃麦草(Thinopyrum intermedium，2n＝6x＝42)。

上述系统中，所述探针，与所述进行FISH分析所需的试剂均可独立包装。

上述鉴别或辅助鉴别偃麦草染色体着丝粒区和/或分析植物染色体着丝粒区的系统也可为仅含有所述探针，和所述进行PCR扩增所需的试剂或试剂盒。

本发明还保护双链DNA分子，所述双链DNA分子的一条链的核苷酸序列为SEQ IDNo.1，另一条链的核苷酸序列与SEQ ID No.1反向互补。

本发明还保护生物材料，所述生物材料为下述任一种：

A1)含有所述的双链DNA分子的重组载体；

A2)含有所述的双链DNA分子的重组微生物。

本发明还保护扩增所述的双链DNA分子的引物对。

本发明的探针pThp901可辅助识别小麦背景下的长穗偃麦草(十倍体)和中间偃麦草(六倍体)染色体或其片段，相较于GISH分析，使用本发明的探针pThp901进行FISH鉴定，无需使用封阻，信号更强，因此更加方便快捷。探针pThp901还可用来探究整臂易位染色体的着丝粒组成。因此利用本发明的探针pThp901可推进偃麦草与小麦着丝粒序列的研究，助力小麦染色体工程育种。

附图说明

图1为本发明实施例1中pThp901在长穗偃麦草中的信号分布图。

图2为本发明实施例2中对小偃7430细胞进行GISH分析和FISH分析的结果对比。图2的a图为以长穗偃麦草基因组为探针，中国春基因组DNA为封阻，对小偃 7430细胞进行GISH分析的结果图；图2的b图为以pThp901为探针对小偃7430细胞进行FISH分析的结果图。图中，箭头指示长穗偃麦草染色体，Bar＝20μm。

图3为本发明实施例2中对八倍体小偃78829细胞进行GISH和FISH分析。图 3的a图是以中间偃麦草基因组为探针，中国春基因组DNA为封阻，对小偃78829 细胞进行GISH分析的结果图，图3的b图是重复序列6C6在小偃78829染色体上的信号分布，图3的c图是pThp901在小偃78829染色体上的信号分布。图中，箭头指示中间偃麦草染色体，Bar＝20μm。

图4为本发明实施例2中对WTT11的细胞学分析结果。其中图4的a图是WTT11 的GISH分析结果图；图4的b图是探针6C6在WTT11中的信号分布图；图4的c 图是探针pThp901在WTT11中的信号分布结果图。箭头指示WTT11的易位染色体， Bar＝20μm。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的品种小偃68(西农)、长穗偃麦草和中国春记载于非专利文献“杨国堂，罗巧玲，刘利勤，张静，李振声，郑琪.利用SLAF-seq技术开发十倍体长穗偃麦草专化分子标记.中国农业大学学报，2019，24,01-05.”，公众可从申请人处获得作为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的品种小偃7430记载于非专利文献“Li H,Zheng Q,Pretorius ZA,Li B,Tang D,Li Z(2016)Establishment and characterization of new wheat-Thinopyrum ponticum addition and translocation lines with resistance to Ug99races.J Genet Genomics 43:573-575”，公众可从申请人处获得作为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的品种小偃78829记载于非专利文献“Zhang,X.Y.,Dong,Y.C., andWang,R.R.(1996).Characterization of genomes and chromosomes in partialamphiploids of the hybrid Triticum aestivum x Thinopyrum ponticum by in situhybridization,isozyme analysis,and RAPD.Genome39,1062-1071.”，公众可从申请人处获得作为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的品种WTT11记载于非专利文献“YangGT,Zheng Q,Hu P,Li HW,LuoQL,Li B,Li ZS(2021)Cytogenetic identification and molecular markerdevelopmentfor the novel stripe rust-resistant wheat–Thinopyrum intermediumtranslocation line WTT11.aBIOTECH 2:343–356”，公众可从申请人处获得作为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1分子标记开发流程

1、小偃麦八倍体小偃68(西农)的特异分子标记开发

小偃68(西农)是普通小麦(Triticum aestivum L.，2n＝6x＝70)与长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum，2n＝10x＝70)经远缘杂交而来的八倍体，它的染色体数目为 56条，包括42条小麦染色体和14条长穗偃麦草染色体。首先剪取小偃68(西农)、长穗偃麦草和中国春小麦的新鲜叶片，利用十二烷基肌氨酸钠(sodium N-dodecanoylsalcosinate,SLS)提取上述三种作物的基因组DNA。将DNA送至北京百迈克生物科技有限公司，利用IlluminaHiSeq

选择其中与长穗偃麦草同源性最高的前2000个特异标签，利用在线引物设计平台(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)进行引物设计。将设计好的引物送至生工生物工程股份有限公司进行合成。以小偃68(西农)、长穗偃麦草和中国春基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系及扩增流程详见表1和表2。金牌 Mix(Green)为北京擎科生物科技有限公司的产品，货号为TSE101。

表1 PCR反应体系

表2 PCR扩增程序

若是某一标记仅能在小偃68(西农)和长穗偃麦草基因组中扩增出一致条带，且不能在中国春基因组中扩增出相同的条带，则该标记为小偃68(西农)外源染色体上的特异标记。结果共获得823个小偃68(西农)的特异标记。

2、长穗偃麦草着丝粒特异探针的开发

选择仅在长穗偃麦草和小偃68(西农)基因组中特异扩增，在中国春基因组中无扩增产物的标记扩增长穗偃麦草基因组，即PCR的模板为长穗偃麦草基因组，引物为以标记M-XNXY68-901为代表的307个显性标记。扩增产物经Sanprep柱式PCR 产物纯化试剂盒(生工生物工程股份有限公司)纯化(货号：B518141-0100)。纯化后进行荧光探针标记，探针标记体系如表3所示。

表3探针标记体系

其中10×NEB buffer2和DNA polymerase I(E.coli)均为New England BioLabs股份有限公司产品，货号为M0209L，Texas-red-5-dCTP为Invitrogen公司产品。

500μL配置好的dNTPs的配方：dTTP、dGTP和dATP各加10μL到1.5mL离心管中，再加入灭菌水470μL.

配置好的DNase是将10μL的Dnase I加入190μL的缓冲液中，Dnase I的货号是000000004536282001。缓冲液的制备：加1M的Tris-HCl(PH＝7.5)2.5mL,1M的 MgCl

以荧光标记的长穗偃麦草基因组为探针，中国春基因组为封阻，对小偃68(西农)有丝分裂中期的细胞进行基因组原位杂交(Genome in situ hybridization，GISH) 分析，用以指示长穂偃麦草染色体。随后，用标记好的荧光探针进行荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)分析。若某一探针在长穗偃麦草染色体着丝粒区有明显的荧光信号，而在小麦染色体着丝粒区无荧光信号，则认为该探针为长穗偃麦草的着丝粒特异探针。

小偃68(西农)根尖有丝分裂中期细胞的制备：首先将种子置于带有滤纸的培养皿里，向培养皿里加入适量的去离子水并置于23℃恒温培养箱。24h后将培养皿里的水吸出，将种子腹沟朝下，并规律摆放。24h后待根长至2cm，剪取1cm左右根尖，置于湿润并透气的0.5ml离心管中。将离心管置于气罐中，冲入N

GISH步骤如下：

以荧光标记的长穗偃麦草基因组为探针，中国春基因组为封阻，探针与封阻的质量比为1:200，配置杂交液。将上述制备的载有有丝分裂中期细胞的载玻片放入紫外交联仪进行交联。交联完成后吸取10μL杂交液(含有116.2ng探针，再加入相应的封阻和2×SSC和1×TE缓冲液)滴于染色体分裂相好的细胞处。先置于沸水中煮5 min使其变性，杂交完成后置于55℃烘箱使其复性。复性时间应大于6h，复性完成后用2×SSC和1×TE缓冲液清洗，随后滴加含4,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) 的抗褪色剂,置于荧光显微镜下观察，选择染色体形态好的细胞进行拍照。(抗褪色剂由美国Vector公司生产，货号：H-1200)。1×TE：首先配置10×TE(PH＝7.6)：分别称取Tris(三羟甲基氨基甲烷)12.1g，乙二胺四乙酸二钠2.9g，将其溶于1000 mL水中，并用浓盐酸调节PH值为7.6，即得到10×TE(PH＝7.6)，稀释10倍即为1×TE。20×SSC：分别称取175.3g氯化钠和88.2g柠檬酸钠，将其溶于800mL 去离子水中，用浓盐酸调节PH值为7.0，然后用去离子水定容至1L。2×SSC：20 ×SSC稀释10倍。2×SSC和1×TE缓冲液：即2×SSC和1×TE等体积混合。

FISH步骤如下：

将拍完照的细胞进一步进行FISH分析，首先配置杂交液，每张载玻片滴加10μL 杂交液，包括1μL配置好的探针(含有83ng探针)和9μL 2×SSC和1×TE缓冲液。然后置于沸水中煮5min使其变性,杂交完成后置于55℃烘箱使其复性，复性时间应大于6h，复性完成后取出载玻片，用2×SSC和1×TE缓冲液清洗后滴加含DAPI的抗褪色剂,并对相应的细胞观察并拍照。

顺序GISH和FISH杂交结果显示标记M-XNXY68-901在长穗偃麦草基因组中的扩增产物经荧光标记后能特异地杂交到长穗偃麦草染色体的着丝粒区。由此判断该探针为偃麦草着丝粒区的特异探针，并命名为pThp901，其DNA序列如表4所示。

表4 pThp901的DNA序列

以长穂偃麦草(十倍体)为材料，利用标记好的荧光探针pThp901进行FISH分析，杂交信号分布见图1。相较于Zhao等(2019)开发的长穗偃麦草特异探针CentSt， pThp901可以与更多的长穗偃麦草染色体的着丝粒区杂交。

实施例2偃麦草着丝粒区特异探针pThp901的应用

1识别小麦背景下的长穗偃麦草染色体

小偃7430是长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum，2n＝10x＝70)与普通小麦(Triticum aestivum L.，2n＝6x＝70)远缘杂交而来的小偃麦八倍体。抗病性鉴定结果表明，小偃 7430对小麦条锈病、小麦秆锈病表现免疫，推断其外源染色体中存在抗病基因(Zheng et al.2015；Li et al.2016)。分别对小偃7430的细胞中的长穗偃麦草着丝粒区进行 GISH分析和FISH分析。

GISH组：以荧光标记(探针标记体系见表3)的长穗偃麦草基因组为探针，中国春基因组为封阻，对小偃7430有丝分裂中期的细胞进行GISH分析，GISH等方法同实施例1中所述，结果见图2的a图。

FISH组：以荧光标记(探针标记体系见表3，纯化产物是核苷酸是序列1的双链DNA分子，进行荧光标记前，将双链DNA分子高温解链为单链)的pThp901 (如SEQ ID No.1所示)为探针，对小偃7430有丝分裂中期的细胞进行FISH分析， FISH等方法同实施例1中所述，结果见图2的b图。

经GISH和FISH后，结果如图2所示，重复序列探针pThp901在小偃7430的 12条长穗偃麦草染色体中均有荧光信号，其中有8条长穗偃麦草染色体信号强，4条染色体信号较弱，而在小麦染色体上无信号，由此判断该探针可识别小麦背景下的长穗偃麦草染色体。相较于GISH分析，FISH鉴定不使用封阻，信号更强，因此更加方便快捷。

2识别小麦背景下的中间偃麦草染色体

小偃78829是普通小麦(Triticum aestivum L.，2n＝6x＝70)与中间偃麦草(中间偃麦草(Thinopyrum intermedium，2n＝6x＝42)经远缘杂交而来的八倍体。它共有56 条染色体，包括42条小麦染色体和14条中间偃麦草染色体(Zhang et al.1996)。分别对小偃78829进行GISH和FISH分析，方法如下：

首先制备6C6探针，以中国春小麦基因组DNA为模板，用6C6的引物序列进行扩增。扩增产物经Sanprep柱式PCR产物纯化试剂盒(生工生物工程股份有限公司) 纯化，纯化后进行荧光探针标记，见实施例1.1。

6C6-F：GCCTGCACAGAGCTCTTCTT；

6C6-R：GAGCCATGTATTGCGTCTCA

小偃78829根尖有丝分裂中期的细胞的制备，顺序GISH和FISH均见实施例1 中所述。每张载玻片滴加10μL杂交液。每10μL杂交液包括83ng 6C6和83ng pThp901探针，并用2×SSC和1×TE缓冲液补足。然后置于沸水中煮5min使其变性,杂交完成后置于55℃烘箱使其复性，复性时间应大于6h，复性完成后取出载玻片，用2×SSC和1×TE缓冲液清洗后滴加含DAPI的抗褪色剂,并对相应的细胞观察并拍照。

结果如图3所示，6C6在42条小麦染色体的着丝粒区均有明显的荧光信号，但是在小偃78829的14条外源染色体中均无信号。pThp901在小麦染色体的着丝粒区均无荧光信号，但在14条外源染色体的着丝粒区均有明显的杂交信号。

3探究整臂易位系WTT11的着丝粒组成

抗病性鉴定表明，小偃78829对条锈病表现为免疫。因此对小偃78829的花粉进行辐射诱变，并授予感病小麦品种小偃81，获得一批易位系。经条锈病抗性鉴定，筛选到一个对条锈病近免疫的易位系WTT11。WTT11的易位类型为整臂易位，易位染色体的组成为TTh·2DL(Yang et al.2021)。

为进一步明确WTT11易位染色体的着丝粒组成，利用Alexa Fluor-488-dUTP(绿色)标记的6C6和Texas-red-5-dCTP(红色)标记的pThp901探针对其进行FISH分析，同时以荧光标记(探针标记体系见表3)的中间偃麦草基因组为探针，中国春基因组为封阻，对WTT11有丝分裂中期的细胞进行GISH分析。

杂交结果见图4，显示易位染色体着丝粒区仅有pThp901的荧光信号，无6C6的荧光信号。由此说明该易位染色体着丝粒是使用中间偃麦草的着丝粒。

本发明的探针pThp901可辅助识别小麦背景下的长穗偃麦草(Thinopyrumponticum，2n＝10x＝70)和中间偃麦草(Thinopyrum intermedium，2n＝6x＝42)染色体或其片段，用来探究整臂易位染色体的着丝粒组成。因此利用本发明的探针pThp901 可推进偃麦草与小麦着丝粒序列的研究，助力小麦染色体工程育种。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 偃麦草着丝粒区的特异探针及其应用

<130> GNCSY220090

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 442

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatccgcaaa gtcaatgcag cggagccggt gatggaggca cagaagccac tcaagtggtc 60

gcactcgccc atcgtctttg acgccgagga ccaccctgat cgcaccactg cggtcgggtg 120

tttgccgttg ttggtctcac caacaattcg caacctcaag gtgacaaaga tgctggttga 180

cggtggggct ggcttgaact tgatctctcc agatgtgatc aagaggctgc agatccccga 240

caaggatctc gaggagacag gcagtttcca agggatcagt ccggggagga acaagccgaa 300

gggccaagtc acattgccgg tcacgttcgg cagcgagctc aactatcgga cggagaagat 360

taccttcgac gtcgtcaaga tgccgctgcc gtacaatggg attctgggcc gcccagccct 420

ggcaaagttt atggcctgcg tc 442