十倍体长穗偃麦草串联重复序列特异探针的开发与应用

摘要

本发明公开了十倍体长穗偃麦草串联重复序列特异探针的开发与应用。本发明利用特异性长度扩增片段测序技术(SLAF‑seq)对普通小麦、普通小麦‑十倍体长穗偃麦草易位系和十倍体长穗偃麦草进行测序，通过序列数据比对分析获得十倍体长穗偃麦草特异序列，并以十倍体长穗偃麦草特异序列为基础，开发了串联重复序列特异探针。本发明的串联重复序列特异探针不仅可以用于快速鉴定十倍体长穂偃麦草染色体及长穗偃麦草向小麦转移染色体片段过程中的易位系鉴定，而且为分子标记辅助选择改良小麦遗传特性提供重要途径，也为小麦分子育种、系统进化和种质资源鉴定提供重要的应用基础。

说明书

技术领域

本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及十倍体长穗偃麦草串联重复序列特异探针的开 发与应用。

背景技术

小麦(Triticum aestivm)是世界上种植面积最大，产量仅次于玉米的第二大粮食作物。 近半个世纪来，世界小麦的总产量已经增加两倍多，其中优良的小麦品种对提高小麦产量发 挥了决定性的作用。小麦野生近缘物种中存在着大量的小麦缺乏的有利遗传资源，充分开发 和利用这些优良基因资源培育小麦新品种已经成为小麦育种的目标之一。长穂偃麦草 (Thinopyrum ponticum，2n＝10x＝70)是多年生草本植物，属于禾本科偃麦草属，是小 麦重要的野生近缘种。它具有长穗多花、适应性广、耐逆性强等优良性状，蕴藏着许多普通 小麦所不具备的优良基因(Shannon，1978；Cox，1991)，且易与小麦杂交结实，是改良现有 小麦品种的宝贵资源库。近年来，随着工作的深入，许多新型的长穂偃麦草抗病、抗逆基因 不断被发现，使得人们意识到目前开发利用的只不过是其中极少的一部分。例如，它含有小 麦锈病抗性基因，能够抵抗近年来在非洲肆虐的新型小麦秆锈病菌Ug99(Xuet al.,2009； Zheng et al.,2014)；它还进化出一套高效控制盐分吸收、转运和分泌的调控机制，能够提 高小麦耐盐特性(Chen et al.,2004)。

通过远缘杂交及染色体工程从野生近缘种属转移优良基因已被证明是小麦遗传改良的一 条卓有成效的途径。早在50年代我国就成功进行了小麦与偃麦草属的杂交，其中小偃麦品种 “小偃6号”年种植面积曾达67万hm²以上，且在生产上使用长达20多年的时间。在小麦->

分子标记辅助选择(Marker Assisted Selection)是利用与目标基因紧密连锁的分子 标记或功能标记，在杂交后代中准确地对不同个体的基因型进行鉴别，并据此进行辅助选择 的育种技术。利用长穂偃麦草染色体专化分子标记进行标记辅助选择(MAS)对于利用偃麦草 优异基因，加速小麦分子育种进程具有重大意义。例如，利用来源于长穂偃麦草抗秆锈病基 因Sr24、Sr25、Sr26及Sr43的连锁标记，能够开展抗病种质资源的筛选、外源遗传物质的 鉴定、抗病基因的定位，有效地提高了分子标记辅助选择育种的效率(Ayala-Navarrete et al., 2007；Margo et al.,2005；Niu et al.,2014；Yu et al.,2010；Zhenget al.,2014)。

截止目前，科学家已经利用多种技术手段开发了长穗偃麦草特异性分子标记，如限制片 段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)(Autriqueet al.,1995； Liu et al.,1999)、扩增片段长度多态性(Amplified fragment lengthpolymorphism，AFLP) (Prins et al.,2001；Zhang et al.,2008)、随机扩增多态性(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)(Liu et al.,1998；You et al.,2002)、简单重复序列(Simple sequence repeats， SSR)(Li et al.,2005；Jauhar et al.,2009；Shenet al.,2004；You et al.,2002； You et al.,2003；Niu et al.,2014)、序列标志位点(Sequence Tagged Sites，STS)(Mago et al.,2005；Zhang et al.,2008)、抗病基因类似物标记(Resistance Gene Analogs Polymorphism，RGAP)(Chen et al.,2007)、靶位区域扩增多态性(Target Region Amplified Polymorphism，TRAP)(Jauhar et al.,2009)、抑制消减杂交(Suppression Subtraction Hybridization,SSH)(Ge et al.,2012)、酶切扩增多态性序列(Cleaved Amplification Polymorphism Sequence，CAPS)(Shen et al.,2004；Li et al.,2007)、序列特异性扩增 区(Sequence-characterized AmplifiedRegion，SCAR)(You et al.,2002；Prabhu et al., 2004；Yan et al.,2009)。

然而，在分子生物学飞速发展的今天，长穂偃麦草分子标记的开发工作相对滞后，标记 来源也主要集中于其二倍体种。由于十倍体长穂偃麦草基因组庞大，加之其基因组与小麦基 因组具有高度同源性，又缺乏基因组全序列信息，使得十倍体长穂偃麦草分子标记的开发研 究存在耗时长、成本高、效率低的缺点，无法批量获得染色体专化分子标记，严重阻碍了长 穗偃麦草基因资源的开发和应用。

SLAF-seq(Specific-locus Amplified Fragment sequencing)是基于高通量测序技术 发展而来的大规模基因分型技术(Sun et al.,2013)。该技术主要通过生物信息学设计方案， 构建SLAF-seq文库，筛选特异性长度片段，高通量测序获得序列信息，软件定义和评估等步 骤，筛选到海量的序列标签，进一步根据序列开发特异的分子标记。应用SLAF-seq技术可以 开发高密度全基因组分子标记，构建高密度遗传连锁图谱，进行高精度QTL定位。该方法具 有通量高、准确性高、成本低、周期短等优点，在遗传定位、分子育种、种质资源鉴定等研 究领域得以应用。SLAF-seq技术适用物种范围广，已在农作物、蔬菜、林木、水产等多个物 种中成功实践(Zhang,et al.,2013)。应用SLAF-seq技术，成功获得了20个二倍体长穂 偃麦草1E染色体和89个二倍体长穂偃麦草7E染色体的分子标记(陈士强等，2013；Chen et al., 2013)。它对整个基因组进行有效的简化，筛选基因组上均匀分布且避开重复序列的片段进行 测序，避免了对重复序列区域的测序投入。当缺乏物种基因组信息时，同样可以利用该技术 降低物种复杂度，获得可靠的序列标签。因此，SLAF-seq技术的发展对长穂偃麦草染色体专 化分子标记的挖掘带来了新的机遇。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定长穗偃麦草染色体的探针。

本发明提供的用于鉴定或辅助鉴定长穗偃麦草染色体的探针为如下(1)或(2)：

(1)所述探针为序列135所示的DNA分子；

(2)所述探针是以长穗偃麦草染色体的基因组DNA为模板，采用引物对67或引物对63 或引物对65进行扩增得到的DNA分子；

所述引物对67由序列133所示的单链DNA分子和序列134所示的单链DNA分子组成；将 采用引物对67进行扩增得到的DNA分子进行荧光标记得到的探针命名为pThp5.121探针；

所述引物对63由序列125所示的单链DNA分子和序列126所示的单链DNA分子组成；将 采用引物对63进行扩增得到的DNA分子进行荧光标记得到的探针命名为pThp3.81探针；

所述引物对65由序列129所示的单链DNA分子和序列130所示的单链DNA分子组成；将 采用引物对65进行扩增得到的DNA分子进行荧光标记得到的探针命名为pThp3.96探针。

上述探针中，所述探针标记有荧光基团；所述荧光基团具体为绿色荧光基团。

本发明的第二个目的是提供用于鉴定或辅助鉴定长穗偃麦草染色体的引物对。

本发明提供的用于鉴定或辅助鉴定长穗偃麦草染色体的引物对为上述引物对67或引物 对63或引物对65。

上述引物对中，每个所述引物对中的各条引物的摩尔量比为1:1。

本发明的第三个目的是提供用于鉴定或辅助鉴定长穗偃麦草染色体的PCR试剂。

本发明提供的PCR试剂包括上述引物对。

上述PCR试剂中，每个所述引物对中的各条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为10μM。

本发明的第四个目的是提供用于鉴定或辅助鉴定长穗偃麦草染色体的试剂盒。

本发明提供的用于鉴定或辅助鉴定长穗偃麦草染色体的试剂盒包括上述引物对或上述 PCR试剂。

上述试剂盒还包括pAs1探针；所述pAs1探针为序列136所示的DNA分子；所述pAs1探针标记有荧光基团；所述荧光基团具体为红色荧光基团。

本发明的第五个目的是提供上述探针或上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒的新用 途。

本发明提供了上述探针或上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒在如下1)-12)中任 一种中的应用：

1)检测或辅助检测长穗偃麦草染色体或其片段；

2)制备检测或辅助检测长穗偃麦草染色体或其片段的产品；

3)检测或辅助检测待测植物中是否含有长穗偃麦草染色体或其片段；

4)制备检测或辅助检测待测植物中是否含有长穗偃麦草染色体或其片段的产品；

5)鉴定或辅助鉴定待测植物中的长穗偃麦草染色体为1-7号染色体中的哪个染色体；

6)制备鉴定或辅助鉴定待测植物中的长穗偃麦草染色体为1-7号染色体中的哪个染色体 的产品；

7)追踪长穗偃麦草染色体或其片段；

8)制备追踪长穗偃麦草染色体或其片段的产品；

9)分子标记辅助选择育种；

10)制备分子标记辅助选择育种的产品；

11)小麦分子育种；

12)制备小麦分子育种的产品。

上述探针或上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒或上述应用中，所述长穗偃麦草为 十倍体长穗偃麦草。

本发明的第六个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定十倍体长穗偃麦草染色体或其片段的方 法。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定十倍体长穗偃麦草染色体或其片段的方法为如下方法一或 方法二：

方法一：鉴定或辅助鉴定待测植物中是否含有十倍体长穗偃麦草染色体或其片段的方法， 用上述pThp5.121探针或pThp3.81探针或pThp3.96探针与待测植物进行原位杂交，若有杂 交信号，则表示待测植物中含有或候选含有十倍体长穗偃麦草染色体或其片段；

方法二：鉴定或辅助鉴定待测植物中含有的十倍体长穗偃麦草染色体为1-7号染色体中 的哪个染色体的方法，用上述pThp5.121探针或pThp3.81探针或pThp3.96探针和上述pAs1 探针与待测植物进行原位杂交，根据杂交谱带的颜色、位置和浓淡来综合判断待测植物中含 有的十倍体长穗偃麦草染色体为1-7号染色体中的哪个染色体；

所述原位杂交是指探针与待测植物根尖体细胞有丝分裂中期分裂相进行原位杂交；所述 原位杂交不含有封阻的步骤。

上述方法中，所述待测植物为含有长穗偃麦草染色体或其片段的小麦属植物；所述含有 长穗偃麦草染色体或其片段的小麦属植物具体可为八倍体小偃麦“小偃68”。

八倍体小偃麦“小偃68”中含有12条(6对)完整的十倍体长穂偃麦草染色体及2条(1 对)普通小麦-十倍体长穂偃麦草易位染色体。本发明的在近端部点状分布的重复序列探针 pThp5.121或pThp3.81或pThp3.96在八倍体小偃麦“小偃68”中8条(4对)完整的长穂偃麦草染色体及2条(1对)易位染色体中的长穂偃麦草染色体片段上都有特定且不完全相同的谱带，而探针pAs1在小麦及其近缘种的染色体中也有分布，主要分布在D组染色体上，在十倍体长穂偃麦草染色体上也有分布。因此，将本发明的探针pThp5.121或pThp3.81或pThp3.96和pAs1探针分别标记成含不同荧光基团的探针，再通过分析杂交谱带的颜色、位置和浓淡即可综合判断待测植物中的十倍体长穗偃麦草染色体为1-7号染色体中的哪个染色 体。具体方法如下：

若短臂端部出现明亮的pThp5.121杂交信号；且短臂和长臂的端部和近端部均出现pAs1 杂交信号，其中，短臂端部和近端部出现的pAs1杂交信号与pThp5.121杂交信号重合的染色 体为1号染色体(1号染色体是最长的1对外源染色体，为中部着丝粒染色体)；

若没有出现pThp5.121杂交信号；且短臂端部、中部以及长臂近端部均出现pAs1杂交信 号，且短臂出现的pAs1杂交信号明显强于长臂的染色体为2号染色体(中部着丝粒染色体)；

若没有出现pThp5.121杂交信号；且短臂和长臂的近端部均出现pAs1杂交信号，且长臂 出现的pAs1杂交信号明显强于短臂的染色体为3号染色体(亚中部着丝粒染色体)；

若长臂端部出现pThp5.121杂交信号；且短臂近端部出现明显的pAs1杂交信号的染色体 为4号染色体(中部着丝粒染色体)；

若长臂端部出现pThp5.121杂交信号；且短臂和长臂的端部和近端部均出现pAs1杂交信 号，且出现的pAs1杂交信号强度相近，其中，长臂端部出现的pAs1杂交信号与pThp5.121 杂交信号重合的染色体为5号染色体(中部着丝粒染色体)；

若短臂和长臂的端部均出现pThp5.121杂交信号，且短臂出现的pThp5.121杂交信号略 强于长臂；且没有出现pAs1杂交信号的染色体为6号染色体(亚中部着丝粒染色体)；

若短臂端部出现pThp5.121杂交信号，且中部出现5个明亮的pAs1杂交信号的染色体为 7号染色体(小麦-长穂偃麦草易位杂色体)。

本发明的最后一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测植物中含有的十倍体长穗偃麦草 染色体为1-7号染色体中的哪个染色体的产品。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测植物中含有的十倍体长穗偃麦草染色体为1-7号染色 体中的哪个染色体的产品包括上述探针pThp5.121或pThp3.81或pThp3.96和上述探针pAs1。

本发明利用特异性长度扩增片段测序技术(Specific-locus AmplifiedFragment sequencing，SLAF-seq)对普通小麦、普通小麦-十倍体长穗偃麦草易位系和十倍体长穗偃麦 草进行测序，通过序列数据比对分析获得十倍体长穗偃麦草特异序列，并以十倍体长穗偃麦 草特异序列为基础，开发了十倍体长穂偃麦草的串联重复序列特异探针。本发明串联重复序 列特异探针不仅可以用于快速鉴定十倍体长穂偃麦草染色体及长穗偃麦草向小麦转移染色体 片段过程中的易位系鉴定，而且为分子标记辅助选择改良小麦遗传特性提供重要途径，也为 小麦分子育种、系统进化和种质资源鉴定提供重要的应用基础。

附图说明

图1为十倍体长穗偃麦草专化分子标记EA2-31在普通小麦-十倍体长穗偃麦草易位系EA、 中国春(CS)和十倍体长穗偃麦草Th.ponticum(10x)中的扩增结果。M：MarkerII；1：普 通小麦-十倍体长穗偃麦草易位系EA；2：中国春(CS)；3：十倍体长穗偃麦草Th.ponticum (10x)。

图2为八倍体小偃麦“小偃68”根尖体细胞中期染色体原位杂交图。A为十倍体长穗偃 麦草全基因组探针；B为十倍体长穗偃麦草专化荧光探针pThp5.121；C为pAs1探针。

图3为pThp5.121和pAs1的杂交谱带绘制的模式图谱。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的普通小麦中国春(CS，2n＝6x＝42)、十倍体长穗偃麦草(Th.ponticum， 2n＝10x＝70)和八倍体小偃麦“小偃68”(Xiaoyan 68，2n＝8x＝56)均在文献“Q.Zheng, Z.Lv,Z.Niu,B.Li,H.Li,S.S.Xu,F.Han,Z.Li,Molecular cytogeneticcharacterization and stem rust resistance of five wheat-Thinopyrum ponticumpartial amphiploids,J Genet Genomics 41(11)(2014)591-599.”中公开过，公众可从中国科学 院遗传与发育生物学研究所获得。

下述实施例中的普通小麦-十倍体长穗偃麦草易位系(EA，2n＝6x＝42)，系谱为小偃 81/4/小偃81/3/小偃81//陕229/小偃68，该易位染色体存在于八倍体小偃麦“小偃68”中。 其中，“小偃81”是由中国科学院遗传与发育生物学研究所选育，2005年通过河北省农作物 品种委员会审定，审定编号：冀审麦2005006号，“陕229”是由陕西省农业科学院粮作所选 育，1994年通过江苏省农作物品种委员会审定，审定编号：苏种审字227号。

实施例1、十倍体长穗偃麦草专化分子标记及荧光探针的开发及应用

一、十倍体长穗偃麦草专化分子标记的开发及应用

1、基因组DNA的提取和纯化

利用CTAB法分别提取普通小麦中国春、十倍体长穂偃麦草、八倍体小偃麦“小偃68”和 普通小麦-十倍体长穂偃麦草易位系的基因组DNA，具体操作步骤如下：

(1)取适量幼嫩组织，在液氮中冷冻后迅速研磨成粉末并装入2mL离心管中。

(2)加入65℃预热的CTAB提取液800μL，剧烈振荡，65℃水浴40-60min，间或轻轻摇匀。

(3)取出离心管，每管加入800μL氯仿:异戊醇(24:1)，上下颠倒充分混匀，室温，12000rpm/min，离心15min。

(4)吸取上清液约600μL转移至新的1.5mL离心管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，-20 ℃低温放置30min。

(5)室温，12000rpm/min离心10min，弃上清。

(6)加75％乙醇700μL，上下颠倒洗涤沉淀，4℃，10000rpm离心5min，弃上清。

(7)65℃烘箱干燥3-5min，溶于适量含有RNase(10mg/mL)的1×TE中，37℃消化RNA1h，电泳检测DNA的质量，-20℃保存。

2、基于SLAF-seq技术获得特异序列标签

用SLAF-seq的方法对普通小麦中国春、十倍体长穂偃麦草、普通小麦-十倍体长穂偃麦 草易位系的基因组DNA进行测序(由北京百迈客生物科技有限公司完成)，得到各样品的序列 标签。利用Blast方法将普通小麦-十倍体长穂偃麦草易位系序列标签与中国春序列标签及已 知的小麦基因组序列进行比对，剔除与小麦序列相似度在50％以上的序列标签；余下的序列标 签再与十倍体长穂偃麦草序列标签进行比对，获取相似度在50％以上的序列标签为十倍体长穗 偃麦草特异SLAF序列标签。最终共获得十倍体长穗偃麦草特异序列标签585个。

3、十倍体长穗偃麦草专化分子标记的开发

根据SLAF-seq技术获得的序列标签，任意选择171个特异SLAF序列标签利用Primer Premier 5.0软件各设计引物1对。在生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物，用HAP 方式纯化。

4、PCR反应

以普通小麦-十倍体长穗偃麦草易位系(EA)及亲本普通小麦中国春(CS)、十倍体长穗 偃麦草(Th.ponticum，2n＝10x＝70)为模板，根据测序获得的长穗偃麦草特异序列设计 的引物进行PCR扩增。PCR反应体系如表1所示，PCR反应程序如表2所示。

表1.PCR反应体系

PCR反应组分体积(μL)2×Taq Master Mix(北京康为世纪生物科技有限公司)10H₂O6.6DMSO0.8引物F(10μm)0.8引物R(10μm)0.8DNA(150ng/μL)1总计20

表2.PCR反应程序

5、琼脂糖凝胶电泳及PCR反应产物的纯化与测序

PCR扩增产物在2％的琼脂糖凝胶，120V稳定电压下进行电泳20分钟，电泳缓冲液为1× TAE。电泳结束后，观察结果、拍照分析并对PCR产物进行纯化(生工生物工程(上海)股份 有限公司试剂盒)与测序。若普通小麦-长穗偃麦草易位系及十倍体长穗偃麦草有扩增条带， 而中国春没有扩增条带，则认为此标记为十倍体长穗偃麦草专化分子标记。

结果表明，171对引物中有67对引物在普通小麦-长穗偃麦草易位系和十倍体长穗偃麦草 中均有扩增条带，而普通小麦中国春均没有扩增条带。本发明的67个十倍体长穗偃麦草专化 分子标记均具有良好的准确性、可靠性和专化性，67个十倍体长穗偃麦草专化分子标记如表3 所示。图1为专化分子标记EA2-31在普通小麦-十倍体长穗偃麦草易位系、中国春、十倍体长 穗偃麦草中的扩增结果。从图1中可以看出：EA2-31在普通小麦-十倍体长穗偃麦草易位系(EA) 和十倍体长穗偃麦草中均扩增得到大小为500bp的条带，而普通小麦中国春没有扩增条带。

表3. 67个十倍体长穗偃麦草专化分子标记

实施例2、十倍体长穗偃麦草串联重复序列特异探针的开发及应用

以十倍体长穗偃麦草(Th.ponticum，2n＝10x＝70)为模板，采用实施例1中获得的67个专化分子标记进行PCR扩增，得到PCR产物。所得的PCR产物经纯化后标记成FISH探针，对八倍体小偃麦“小偃68”根尖体细胞有丝分裂中期分裂相进行原位杂交。选择在十倍体长穂偃麦草染色体上有特异杂交信号，而在小麦染色体上无杂交信号的探针作为十倍体长穂偃 麦草专化荧光探针。同时以利用十倍体长穂偃麦草全基因组DNA做探针进行GISH分析作为对 照，利用十倍体长穂偃麦草全基因组DNA做探针进行GISH分析的具体步骤参照文献“Q.Zheng, Z.Lv,Z.Niu,B.Li,H.Li,S.S.Xu,F.Han,Z.Li,Molecular cytogeneticcharacterization and stem rust resistance of five wheat-Thinopyrum ponticumpartial amphiploids,J Genet Genomics 41(11)(2014)591-599.”中的方法。

1、荧光探针的制备

(1)十倍体长穗偃麦草串联重复序列特异探针

以十倍体长穗偃麦草为模板，分别采用实施例1中获得的67个专化分子标记进行PCR扩 增，得到PCR产物，PCR产物纯化后，按照表4中的体系进行标记，分别制备得到荧光探针。 标记的具体步骤如下：

1)按照表4中的浓度和组分配制标记体系，其中，标记的-dNTPs为Alexa Fluor-488-dUTP (绿光，购自Invitrogen公司)；未标记的-dNTPs购自Invitrogen公司；DNA聚合酶(浓度 为10U/μL)购自Invitrogen公司；Dnase(浓度为100mU/μL)购自北京全式金生物技术有限 公司；10×Nick translation buffer(溶剂为水)中含有500mM Tris，50mM MgCl₂，pH＝7.8。

2)用枪头反复吹打步骤1)获得的标记体系，混匀，不能涡旋，15℃保温2小时。置于金 属浴仪(H₂0³-PRO，中国)中15℃反应2小时。13000rpm离心30-40min，弃上清，收集沉淀。

3)分别用70％乙醇和无水乙醇洗一次步骤2)获得的沉淀，避光晾干。然后向沉淀中加10μL 缓冲液(10μL缓冲液由0.3M NaCl，0.03M柠檬酸钠，10mM Tris，1mM EDTA和水组成，化学 试剂均购自国药集团化学试剂有限公司)，使探针终浓度为200ng/μL。

表4.标记体系

(2)粗山羊草串联重复序列特异探针pAs1

粗山羊草串联重复序列特异探针pAs1如序列136所示，其制备方法同步骤(1)，不同之 处为采用Texas-red-5-dCTP(红光，购自PerkinElmer公司)标记pAs1。

2、原位杂交

(1)根尖体细胞有丝分裂中期分裂相的制片

1)N₂O处理根尖细胞

选择成熟饱满的种子，放入垫有潮湿滤纸的培养皿中，用水淋湿并保持一定的湿度，在 23℃恒温培养箱内培养，待根尖长到1-2厘米时，剪取根尖，放入湿润的离心管中，盖上盖子 后放入气室中处理2h，压强为10ATM(1.01Mpa)。

2)根尖固定

90％乙酸固定根尖10分钟，蒸馏水冲洗2次，每次5min。

3)酶解

用滤纸将根尖上的水稍微吸干，将根尖分生组织切下，放入20μL混合酶溶液(1％的果胶 酶Y-23和2％纤维素酶Onozuka R-10溶于1×柠檬酸缓冲液，均购于日本JapanYakult公司)， 37℃水浴40-60min。

4)滴片镜检

70％酒精冲洗酶解后的根尖2次，余200μL的70％酒精在离心管里，捣碎根尖，低速离心10sec 左右，将酒精倒干，根据植物根尖大小加冰乙醇(每个根尖20-40μL)悬浮根尖细胞；将干净 的载玻片放入湿盒，将6-7μL的根尖细胞悬浮液滴到载玻片上，盖上盒盖，5分钟以后镜检， 将染色体制片标本保存在冰箱中备用。

(2)原位杂交

将待杂交的载玻片放入紫外交联仪(code-No.CL-1000，购自美国UVP公司)中，UV能 量为0.125J/cm²。将制片放在冰上，将探针与封阻按合适比例制备杂交液，每张载玻片上加>

结果共开发得到如下3个长穗偃麦草专化荧光探针：pThp5.121、pThp3.81和pThp3.96 探针。这3个专化荧光探针的SLAF序列及引物见表5，并对专化荧光探针在八倍体小偃麦“小 偃68”上的杂交信号进行分析(图2)。结果表明：当利用十倍体长穗偃麦草基因组DNA做探 针，普通小麦中国春DNA做封阻，对八倍体小偃麦“小偃68”根尖染色体进行荧光原位杂交 时(图2A)，探针与封阻的比例为1:200，6对来自长穗偃麦草的外源染色体以及1对含有小 麦-长穗偃麦草易位染色体有明显的杂交信号。当利用长穗偃麦草专化的串联重复序列 pThp5.121做探针对八倍体小偃麦“小偃68”进行荧光原位杂交时，共5对染色体端部区域 出现点状的杂交信号。其中1对染色体在长臂和短臂的端部均出现点状的杂交信号；4对染 色体的长臂或短臂的端部出现点状的杂交信号(图2B)。又以来源于粗山羊草的串联重复序 列pAs1做探针进行了荧光杂交(图2C)，通过分析pThp5.121探针与pAs1探针的杂交谱带 的颜色、位置和浓淡来综合判断，进一步区分八倍体小偃麦“小偃68”中不同的长穗偃麦草 染色体。重复序列探针pThp5.121和pAs1杂交信号清晰且表现稳定，在外源染色体和染色体 片段上的分布和丰度明显不同，使得6对来自长穗偃麦草的外源染色体以及1对含有小麦- 长穗偃麦草易位染色体呈现明显不同的杂交谱带，可清楚的分辨长穗偃麦草中的1-7号染色 体。根据探针pThp5.121和pAs1的杂交谱带绘制的模式图谱如图3所示，图3中浅灰色信号 为pAs1杂交位点，深灰色信号为pThp5.121杂交位点，黑色信号为pAs1和pThp5.121共同 的杂交位点。八倍体小偃麦“小偃68”中的6对来自长穗偃麦草的外源染色体以及1对含有 小麦-长穗偃麦草易位染色体的具体检测结果如下：

1号染色体是最长的1对外源染色体，为中部着丝粒染色体，在短臂端部出现明亮的 pThp5.121杂交信号；pAs1杂交信号位于长臂和短臂的端部和近端部，其中短臂端部和近端 部的信号与pThp5.121杂交信号重合。

2号染色体是中部着丝粒染色体，无pThp5.121杂交信号；染色体短臂端部、中部以及 长臂近端部均出现pAs1杂交信号，染色体短臂的信号明显强于长臂。

3号染色体是亚中部着丝粒染色体，没有出现pThp5.121杂交信号；染色体短臂和长臂 的近端部均出现pAs1杂交信号，且长臂的pAs1杂交信号要明显强于短臂。

4号染色体是中部着丝粒染色体，长臂端部出现pThp5.121杂交信号；短臂近端部出现 明显的pAs1杂交信号。

5号染色体是中部着丝粒染色体，pThp5.121杂交信号位于长臂端部；pAs1杂交信号位 于长臂和短臂的端部和近端部，信号强度相近，其中长臂端部的pAs1杂交信号与pThp5.121 杂交信号重合。

6号染色体是亚中部着丝粒染色体，pThp5.121杂交信号分别位于长臂和短臂的端部，短 臂的pThp5.121杂交信号略强于长臂，没有出现pAs1杂交信号。

7号染色体是小麦-长穂偃麦草易位杂色体，pThp5.121杂交信号位于易位染色体短臂端 部，即长穗偃麦草染色体片段所在位置；易位染色体的中部出现5个明亮的pAs1杂交信号， 根据信号带型可判断该片段为普通小麦4DS·4DL。根据杂交结果，该易位染色体可命名为 T？Th-4DS·4DL。

专化荧光探针pThp3.81和pThp3.96的原位杂交结果与pThp5.121无显著性差异，均可 用于鉴定或辅助鉴定十倍体长穗偃麦草染色体或其片段及鉴定或辅助鉴定待测植物中的十倍 体长穗偃麦草染色体为1-7号染色体中的哪个染色体。

表5.长穗偃麦草专化荧光探针SLAF序列及引物

序列表

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 十倍体长穗偃麦草串联重复序列特异探针的开发与应用

<160> 134

<210> 1

<211> 25bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

atctgtatcc ctagagtcgc tcatc 25

<210> 2

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

ccacttcttg gtgtagcagt gac 23

<210> 3

<211> 19bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

acacccgcca ctgctaagc 19

<210> 4

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

ccatcactcc cacaacccat c 21

<210> 5

<211> 24bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

aggaaccttg aatttatggc acag 24

<210> 6

<211> 24bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

tgacaagtcg tgcagatttt cact 24

<210> 7

<211> 24bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 7

cagattatgt ggacttactc ggca 24

<210> 8

<211> 24bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 8

tccaaaacct gttgtctaga gcct 24

<210> 9

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 9

cgaaagactg gcacggataa g 21

<210> 10

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 10

tgagtcggca ataccccaac 20

<210> 11

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 11

actaaaggaa catgcggtca cac 23

<210> 12

<211> 24bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 12

ttgttagtga cttaacggtg gcac 24

<210> 13

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 13

agtttcaggt tccgacagaa t 21

<210> 14

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 14

cagttgttct tgctgtggct 20

<210> 15

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 15

gttgataatc ttggagatga t 21

<210> 16

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 16

tgacaaactc atgcctctag g 21

<210> 17

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 17

ccattcatgt cggaccaaaa 20

<210> 18

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 18

cgctgcatgg cgtgattgat 20

<210> 19

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 19

gaagagaagg agaaggacgg g 21

<210> 20

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 20

tgtaatgact aggtgtttgg c 21

<210> 21

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 21

tcaggtctcg gcatctcatc t 21

<210> 22

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 22

ttatatttcc ctttgtttgc a 21

<210> 23

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 23

ggtttgagaa aaacaacatg a 21

<210> 24

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 24

atcgatcaca aggagaaacg 20

<210> 25

<211> 18bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 25

accgtggggg tggataag 18

<210> 26

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 26

cgagaaactg cattaagtaa a 21

<210> 27

<211> 18bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 27

ctcagtggta gcagcctc 18

<210> 28

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 28

cagcgacttg caagtcttgc 20

<210> 29

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 29

catcaccaca tggctttcaa 20

<210> 30

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 30

taatattttg actagcatgc g 21

<210> 31

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 31

aaagacaaag acagtgatta c 21

<210> 32

<211> 19bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 32

tcataatatc atgtatgcc 19

<210> 33

<211> 19bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 33

cagcccagag aattttttt 19

<210> 34

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 34

agtgaggttt acttaagcaa c 21

<210> 35

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 35

ttatagcgaa ggtcaccgta c 21

<210> 36

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 36

cgttcatgat tggatcagaa g 21

<210> 37

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 37

agctgctgca accccagcct 20

<210> 38

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 38

cacgtctaac agccaacagt t 21

<210> 39

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 39

gaagatacgc tatcggttca a 21

<210> 40

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 40

cgttcataaa caacggagca 20

<210> 41

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 41

tacatttgat cagctgagca acc 23

<210> 42

<211> 24bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 42

aaacataact gtggtttagt aaag 24

<210> 43

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 43

ctgatcttcg tcgtgggtca t 21

<210> 44

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 44

agtgtacatc cactcacaat cc 22

<210> 45

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 45

aggtgttctg tgcactactc tg 22

<210> 46

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 46

aagaaggtgg tatgccctct ta 22

<210> 47

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 47

caggttagtt ggtgatttat tt 22

<210> 48

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 48

atgtgcattt atgttcacag a 21

<210> 49

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 49

ggctcctctc ttttgagggg tta 23

<210> 50

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 50

agtattacaa agaaaacaaa ga 22

<210> 51

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 51

aagaaggtga cgcgtttttt tc 22

<210> 52

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 52

tagctgttaa gctacagcat ag 22

<210> 53

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 53

acacatgacc ctccaactgc a 21

<210> 54

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 54

ttgaagatgt gaatgccaat c 21

<210> 55

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 55

actgatgttt tactttttta ttt 23

<210> 56

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 56

atcactgtgt ctcaatgctt cca 23

<210> 57

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 57

gctagtgggt ggacctgctc 20

<210> 58

<211> 18bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 58

ccatgctcgc cagcacct 18

<210> 59

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 59

cttgctctag agcaaaaact ag 22

<210> 60

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 60

ttacacgtac ctttcacaaa gca 23

<210> 61

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 61

agggtgatat acagcctatc 20

<210> 62

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 62

cacccctaat taaacctgtt tag 23

<210> 63

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 63

tgcttcaatg cttgctcatc 20

<210> 64

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 64

ttaaggtttt ttttttgggg tag 23

<210> 65

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 65

acaagagttg gggtctgata tgg 23

<210> 66

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 66

aggttcaact aaggatccat c 21

<210> 67

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 67

agggggattt acagcctatc taa 23

<210> 68

<211> 18bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 68

cacccctaat taacccaa 18

<210> 69

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 69

cctataaatc aaatatcgtc tag 23

<210> 70

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 70

agtgttcccc aaatatccat ctc 23

<210> 71

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 71

acaataagac cactcgacaa a 21

<210> 72

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 72

gtattaatga ggtcaaaaag tgt 23

<210> 73

<211> 18bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 73

tggtttgcga cacttgaa 18

<210> 74

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 74

tgagttccag gctgcttttc at 22

<210> 75

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 75

tttttcattt ttcctttttc tgt 23

<210> 76

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 76

ctctgtaaca ccccatgtca tt 22

<210> 77

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 77

tcccattcgg cgaggcttca tta 23

<210> 78

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 78

ctttgggtga gatcatagaa tca 23

<210> 79

<211> 19bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 79

ctgttgactg gtcagctga 19

<210> 80

<211> 19bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 80

tcgggagcta cggcgacgt 19

<210> 81

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 81

attctctgga catgcattgt tgc 23

<210> 82

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 82

cacattgcaa atggatggga 20

<210> 83

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 83

atgtatatcg aaggcaaaca tac 23

<210> 84

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 84

actttgtagt tagaaacaga gga 23

<210> 85

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 85

ggcatcccat tcttcccgta 20

<210> 86

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 86

tctatatgta cctgcttcaa 20

<210> 87

<211> 19bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 87

ccatgagagc gaagatgat 19

<210> 88

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 88

acttgtgcat atttgtaaaa tgt 23

<210> 89

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 89

ttagattgta acgcaacctg gg 22

<210> 90

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 90

aacgacatta tcttgctttg ct 22

<210> 91

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 91

aaaggacgac tataagggtc aca 23

<210> 92

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 92

tgataggaat gttttggtga gg 22

<210> 93

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 93

aggttcacct caggatccat ct 22

<210> 94

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 94

aaaagatttg gggtctaatg cag 23

<210> 95

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 95

cctcttcttt ctcttagttg ccc 23

<210> 96

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 96

atgtattcat ctcttgggta c 21

<210> 97

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 97

tgataaaccc tccgctgcca a 21

<210> 98

<211> 18bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 98

agcctcgttg agcccagt 18

<210> 99

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 99

ctccgagttc caaacggcta 20

<210> 100

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 100

agtgtacgac tcctctgggc att 23

<210> 101

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 101

cttagttata tgcaaactta gca 23

<210> 102

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 102

ctctaatgcc atccatgtcg aa 22

<210> 103

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 103

ccaggggtct cttttccctc ata 23

<210> 104

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 104

acagtcatgc ttgatacaag cag 23

<210> 105

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 105

aaaagatttg gggtctaatg cag 23

<210> 106

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 106

aggttcacct caggatccat ct 22

<210> 107

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 107

cagtctgagt ttactgtttt aaa 23

<210> 108

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 108

aggtgactca tgatcaacca ac 22

<210> 109

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 109

ctctcatgcc atccatgttg aa 22

<210> 110

<211> 19bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 110

ccctccgcac tgcactctt 19

<210> 111

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 111

cactgtgaca cccggtttgt aat 23

<210> 112

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 112

aggggaggtt tcgtccacat t 21

<210> 113

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 113

gcctgtcaca catacttcag tcg 23

<210> 114

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 114

tgcagcttgt tcaggagagg 20

<210> 115

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 115

agtgaataaa ctaatagatc aaa 23

<210> 116

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 116

cacataactt cctcggattg c 21

<210> 117

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 117

atccatttcc cctacatcca ac 22

<210> 118

<211> 18bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 118

catttggggc gcattttt 18

<210> 119

<211> 19bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 119

tgcgtctcat ttgccacat 19

<210> 120

<211> 18bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 120

ggcgacgccg acggaagc 18

<210> 121

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 121

aaggaactag tccagatttc ca 22

<210> 122

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 122

accacaatga tcttgtgatt g 21

<210> 123

<211> 18bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 123

gttggcaccg tcaatggc 18

<210> 124

<211> 23bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 124

agactagtac tccctcggtt cca 23

<210> 125

<211> 18bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 125

cgtcggagag gcgtagcg 18

<210> 126

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 126

accgaactcc gtcacacgtt 20

<210> 127

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 127

atgtattcat ctcttgggta c 21

<210> 128

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 128

cctcttcttt ctcttagttg cc 22

<210> 129

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 129

atcctacgtc gcccggtaca aa 22

<210> 130

<211> 19bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 130

cccaaatccg ggatggtgt 19

<210> 131

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 131

gatataccgg agcattggga 20

<210> 132

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 132

acccacagac agactctgcc t 21

<210> 133

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 133

ttcacgggta actcatgttg gt 22

<210> 134

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 134

accggactcg gtgctacttg 20

<210> 135

<211> 381bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 135

ttcacgggta actcatgttg gtcgggtatc gatctccgtg ccgatccgac cgatgacgtg 60

ccgtgtgggg cgaaatttct ttttcccgcc caaaacctcg cctcccgcct caagtgccgt 120

ctcgcgccct cgcaccactg ttggatccct ccccttttga taaagtcctt tgcatcactg 180

ttggatccct cccctttttg tatttttgtt tagtgtcgcc ggggagacgc ggtgggagcg 240

gtgtgcaata gtacaccctg ttttggcatg gcggcggaat tttcccgccc gaaatggcga 300

aaaagtaacc acgccggcga gtgtctcaaa gcgctcccgg aggtgtaaaa acatgtatag 360

gcaagtagca ccgagtccgg t 381

<210> 136

<211> 1015bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 136

ggatccactt cgtgtacaaa acggacaatc tctttcaaag tatcaggatt tcatccggga 60

actcgtctgt tacaaaggga tttcattttt aaaacctatt tgaactcctg actttttgtg 120

tgttcaaaat gcaccattaa aagccacatc atcatttttc aatcctttct gacttcattt 180

gttatttttc atgcatttac taattatttt gagctataag accctaaaat tgaaaagcat 240

ttcaaatgaa ctctgaaaag gttgaaactt ggcatgatat catcaattca tccacatagc 300

atgtgcagga aagttgagag ggttatggca aaaactggat gcacttcgtg tacaaaacgg 360

acaatctctt tcaaagtatc aggatttcat ccggaaactc gtctgttaca aagggatttc 420

atttttttaa cttatttgaa ctcctgactt tttgtgtgtt caaaatgcac cattcaaagc 480

cacatcatca tttttcaatc ctttctgact tcatttgtta tttttcatgc atttactaat 540

tatttttagc tataagaccc taaaattgaa aagcatttca aatgaactct gaaaaggttg 600

aaacttggca tgatatcatc atttcatcca catagcatgt gcaagaaagt tgagagggtt 660

acggcaaaaa ctggatgcac ttcgtgtaca aaacggacaa tctctttcaa agtatcagga 720

tttcatccgg aaactcgtct gttacaaagg gatttcattt ttttaaactt acttgaactc 780

ctgacttttt gtgtgttcaa aatgcaccat tcaaagccac atcatcattt ttcaatcctt 840

tctgacttca tttgttattt ttcatgcatt tactaattat tttgagctat aagaccctaa 900

aattgaaaag catttccaat gaactctgaa aaggttgaaa gttggcatca tatcatcatt 960

tcatccacat agcatgtgca agaaatttga gagggttacg gcaaaaactg gatcc 1015