一种没食子鞣质类成分的检测方法

摘要

本发明公开了一种没食子鞣质类成分的检测方法，采用超高效液相色谱‑四级杆飞行时间串联质谱联用技术对待检测样进行检测，而后根据检测结果完成对待检测样中各没食子鞣质类成分的结构鉴定。本发明操作步骤简单，检测快速，精确度及灵敏度高，可检测含量较少的没食子鞣质类成分，鉴定种类较全面，可从川赤芍中鉴定出25种主要的没食子鞣质类成分，填补了川赤芍中没食子鞣质类成分鉴定的空白，对川赤芍中没食子鞣质类成分的分析和川赤芍品质评价具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于中药分析技术领域，涉及一种没食子鞣质类成分的检测方法，特别涉及一种应用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱联用技术检测川赤芍药材中没食子鞣质类成分的方法。

背景技术

没食子鞣质类成分是一类可水解鞣质，水解后能生成没食子酸和糖或多元醇，结构中具有酯键或酯苷键，其中糖或多元醇部分最常见的为葡萄糖，在植物界中广泛存在。没食子鞣质类成分为川赤芍中除了芍药苷类成分外含量相对较多的化学成分，且大部分都为一个葡萄糖上连若干个没食子基团。现代药理学研究表明，没食子鞣质类成分有收敛固涩、燥湿止血、抗炎等的作用，可用于泻痢不止、疔疮出血等，同时对结肠炎、结肠癌及乳腺癌等有辅助治疗的作用。

川赤芍是中国的特有植物，为毛茛科植物川赤芍(Paeonia veitchii Lyn.)的干燥根，分布在中国的西藏、甘肃、青海、四川及陕西等地。其具有清热凉血，散瘀止痛之功效，以赤芍收载于历版《中国药典》中。川赤芍在抗炎、抗凝血、免疫调节及抗过敏等现代药理作用上发挥着重要作用。曾有学者采用高效液相色谱(HPLC)对不同来源的芍药进行含量测定，发现白芍、赤芍和川赤芍存在含量差异，发现川赤芍含没食子鞣质类成分更为丰富；也有学者采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱联用技术(UPLC-Q-TOF-MS)对白芍和赤芍中的成分进行了定性定量分析，鉴定出了若干没食子鞣质类成分。

但是，目前对于芍药研究主要集中于来源于Paeonia lactiflora的白芍和赤芍，而对于川赤芍药材的研究相对较少，也未有系统分析鉴别其中没食子鞣质类成分的方法，同时当前的检测方法难以一次性完成对川赤芍中所有没食子鞣质类成分的全部检测，当前技术条件下为完成川赤芍中所有没食子鞣质类成分的全部检测往往需要采用不同检测方法进行多次检测，其操作复杂，检测效率低。

因此，开发一种能够高效、一次性最大化完成对川赤芍中所有没食子鞣质类成分检测的方法极具应用前景。

发明内容

本发明的目的在于克服现有检测方法难以一次性完成对川赤芍中所有没食子鞣质类成分的全部检测的缺陷，提供一种能够高效、一次性最大化完成对川赤芍中所有没食子鞣质类成分检测的方法，同时其具有操作简便、检测准确性好及检测效率高的特点，借助该方法能够实现对川赤芍药材中没食子鞣质类成分的有效监控，极具应用前景。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种没食子鞣质类成分的检测方法，采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱联用技术对待检测样进行检测，而后根据检测结果完成对待检测样中各没食子鞣质类成分的结构鉴定(具体可以通过与标准物质和公开数据库对比，进一步确证没食子鞣质类成分的结构)；

所述超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱联用技术的色谱条件为：流动相：溶剂A为100％乙腈溶液，溶剂B为质量浓度为0.1％的甲酸水溶液；流动相流速为0.3～0.5mL/min；色谱柱温度为20～40℃，进样量为3～5μL；梯度洗脱条件：0-0.5min，5％A；0.5-3min，5％-12％A；3～10min，12％-20％A；10-18min，20-30％A；18-28min，30-90％A；28-30min，90％A；30-33min，90％-5％A；33-35min，5％A。

本发明的没食子鞣质类成分的检测方法，特定的色谱条件赋予了其对没食子鞣质类成分种类的良好覆盖，同时其操作简便、检测准确性好及检测效率高，该方法可高效、一次性完成对川赤芍中所有没食子鞣质类成分检测，借助该方法能够实现对川赤芍药材中没食子鞣质类成分的有效监控，极具应用前景。

作为优选的技术方案：

如上所述的一种没食子鞣质类成分的检测方法，所述超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱联用技术的质谱条件为：离子源温度为100～200℃，采用负离子扫描方式；毛细管电压为1～2kV；锥孔电压为30～50V；萃取电压为3～5V；去溶剂气温度为400～500℃；采用飞行时间质谱全扫描模式。

如上所述的一种没食子鞣质类成分的检测方法，所述待检测样为川赤芍提取液。当然本发明的待检测样并不仅限于川赤芍提取液，其他含有待检测没食子鞣质类成分的样品均可适用于本发明。

如上所述的一种没食子鞣质类成分的检测方法，所述川赤芍提取液的制备方法如下：

称取一定量的川赤芍药材，打碎成粉，用丙酮溶液进行超声提取，离心处理，收集上清液并去除沉淀，用乙酸乙酯萃取；收集乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干燥，残渣再用甲醇溶解，通过滤膜(直径0.22μm的有机滤膜)过滤除去固体杂质，所得滤液即为川赤芍提取液。

如上所述的一种没食子鞣质类成分的检测方法，所述川赤芍药材的质量为0.5～2g；

所述丙酮溶液的体积浓度为60～90％，用量为50～100mL；

所述乙酸乙酯的用量为50～100mL。

如上所述的一种没食子鞣质类成分的检测方法，所述超声提取的时长为20～40min；

所述离心处理的转速为9000～12000r/min，时长为5～10min。

如上所述的一种没食子鞣质类成分的检测方法，所述减压浓缩的温度为40～60℃。

如上所述的一种没食子鞣质类成分的检测方法，所述川赤芍药材中含有25种没食子鞣质类成分，具体包括1至7取代的没食子酰葡萄糖。

如上所述的一种没食子鞣质类成分的检测方法，所述采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱联用技术对待检测样进行检测具体为使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱仪对待检测样进行检测，所述超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱仪的质量误差限定范围设置为小于5ppm。当然也可采用超高效液相色谱仪与四级杆飞行时间串联质谱仪配合完成检测。

有益效果：

(1)本发明的没食子鞣质类成分的检测方法，操作步骤简单，检测快速，且利用四极杆飞行时间串联质谱可同时获得没食子鞣质类成分的一级分子离子和二级碎片离子，质量误差小于5ppm，精确度和灵敏度高；

(2)本发明的没食子鞣质类成分的检测方法，对色谱条件和质谱条件等进行了系统优化，可检测出含量较低的没食子鞣质类成分，可检测川赤芍中含有的25种主要的没食子鞣质类化合物，填补了川赤芍中没食子鞣质类成分鉴定的空白，对不同基原芍药的分析具有重要的意义；

(3)本发明的没食子鞣质类成分的检测方法，可实现对川赤芍中没食子鞣质类成分较为全面的检测，极具应用前景。

附图说明

图1为实施例1川赤芍提取液的总离子流图；

图2为实施例1川赤芍中1,2,3,4,6-O-pentagalloylglucose(PGG)的提取离子流图；

图3为实施例1川赤芍中1,2,3,4,6-O-pentagalloylglucose(PGG)的一级质谱图；

图4为对比例1的川赤芍的总离子流图；

图5为对比例2的川赤芍的总离子流图；

图6为对比例3的川赤芍的总离子流图；

图7为对比例4的川赤芍的总离子流图；

图8为对比例5的川赤芍的总离子流图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式做进一步阐述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

以下实施例中所涉及的实验材料、仪器、试剂和标准物质具体为：

实验材料：川赤芍收集自产地，经上海中药标准化研究中心吴立宏研究员鉴定川赤芍为毛茛科植物川赤芍Paeonia veitchii Lynch的干燥根，打碎成粉，常温保存；

仪器：Waters Synapt G2 Q/TOF-MS质谱仪购自美国Waters公司；利用MassLynxV4.1软件进行数据分析；

试剂：乙腈(高效液相色谱级，美国Fisher公司)；甲酸(高效液相色谱级，CNW公司)；超高效液相色谱分析用水由Milli-Q纯净水系统制备(美国Millipore公司)；

标准物质：没食子酸、1,2,3,4,6-O-Pentagalloyl glucose购自上海诗丹德标准技术服务有限公司。

实施例1

一种没食子鞣质类成分的检测方法，具体步骤如下：

(1)待检测样(川赤芍提取液)的制备：

将川赤芍药材打碎成粉后，称取1g粉末，加20mL70％丙酮溶液，超声30min，提取三次，然后以10000rpm的转速离心10min，收集上清液并去除沉淀，用乙酸乙酯萃取3次，每次20mL，收集乙酸乙酯萃取液，在50℃的条件下减压浓缩至干燥，残渣再用甲醇定容至5mL，通过滤膜(直径0.22μm的有机滤膜)过滤除去固体杂质，所得滤液即为川赤芍提取液；

(2)使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱仪对川赤芍提取液进行检测，超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱仪的质量误差限定范围设置为小于5ppm，超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱仪的色谱及质谱条件如下：

色谱条件为：流动相：溶剂A为100％乙腈溶液，溶剂B为质量浓度为0.1％的甲酸水溶液；流动相流速为0.4mL/min；色谱柱温度为25℃，进样量为5μL；梯度洗脱条件：0-0.5min，5％A；0.5-3min，5％-12％A；3～10min，12％-20％A；10-18min，20-30％A；18-28min，30-90％A；28-30min，90％A；30-33min，90％-5％A；33-35min，5％A(也即液相色谱梯度洗脱条件按表1中的程序设定)；

表1

质谱条件为：离子源温度为120

(3)根据检测结果(总离子流图如图1所示)完成对待检测样中各没食子鞣质类成分的结构鉴定，结构鉴定具体以川赤芍中的1,2,3,4,6-O-pentagalloylglucose(PGG)为例，其结构分析过程：

没食子鞣质类成分在负离子模式下具有较高响应，并在碰撞作用下发生没食子酰基的丢失，生成特征性碎片离子，以川赤芍中的1,2,3,4,6-O-pentagalloylglucose为例，其在负离子模式下的提取离子色谱图和一级质谱图如图2和3所示，可见其准分子离子峰[M-H]-的质荷比为939.1199，推测其结构式为C41H32O26；该物质在负离子模式下的二级质谱图如图3所示，可见主要碎片离子的质荷比(m/z)为469.0542和169.0146，为1,2,3,4,6-O-pentagalloylglucose的典型碎片离子，结合公开数据库，该化合物被鉴定为1,2,3,4,6-O-pentagalloylglucose，进一步通过标准物质进行比对分析，确证该化合物为1,2,3,4,6-O-pentagalloylglucose。

从待检测样中共鉴定出25种主要没食子鞣质类成分，具体的化合物鉴定结果如表2所示。

表2

对比例1

一种检测方法，其步骤与实施例1基本相同，不同之处在于，提取条件和色谱条件的设置；

提取条件为：20mL75％乙醇超声提取30min，冷却，补足减重溶液，以10000r·min

梯度洗脱条件为：0-0.5min，5％A；0.5-3min，5％-12％A；3-10min，12％-20％A；10-15min，20％-25％A；15-20min，25％-30％A；20-28min，30％-90％A；28-30min，90％A；30-33min，90％-5％A；33-35min，5％A。

川赤芍中没食子鞣质类成分响应较低，代表性色谱图如图4所示，共鉴定出18种没食子鞣质类成分，具体的化合物鉴定结果如表3所示。

表3

对比例2

一种检测方法，其步骤与实施例1基本相同，不同之处在于，色谱条件的设置；

色谱条件为：流动相：溶剂A为100％乙腈溶液，溶剂B为质量浓度为0.1％的甲酸水溶液；流动相流速为0.4mL/min；色谱柱温度为25℃，进样量为5μL；梯度洗脱条件：0-0.5min，5％A；0.5-3min，5％-12％A；3-10min，12％-20％A；10-20min，20％-25％A；20-30min，25％-30％A；30-38min，30％-90％A，38-40min，90％A；40-43min，90％-5％A；43-45min，5％A。

川赤芍中没食子鞣质类成分较实施例1未有较大变化，但色谱图峰形及分离度不如实施例1，代表性色谱图如图5所示。

对比例3

一种检测方法，其步骤与实施例1基本相同，不同之处在于，色谱条件的设置；

色谱条件为：流动相：溶剂A为100％乙腈溶液，溶剂B为质量浓度为0.1％的甲酸水溶液；流动相流速为0.4mL/min；色谱柱温度为45℃，进样量为5μL；梯度洗脱条件：0-0.5min，5％A；0.5-3min，5％-12％A；3～10min，12％-20％A；10-18min，20-30％A；18-28min，30-90％A；28-30min，90％A；30-33min，90％-5％A；33-35min，5％A。

川赤芍中没食子鞣质类成分较实施例1检测到的成分减少，响应值变低，代表性色谱图如图6所示。

对比例4

一种检测方法，其步骤与实施例1基本相同，不同之处在于，色谱条件的设置；

色谱条件为：流动相：溶剂A为100％乙腈溶液，溶剂B为质量浓度为0.1％的甲酸水溶液；流动相流速为0.2mL/min；色谱柱温度为25℃，进样量为5μL；梯度洗脱条件：0-0.5min，5％A；0.5-3min，5％-12％A；3～10min，12％-20％A；10-18min，20-30％A；18-28min，30-90％A；28-30min，90％A；30-33min，90％-5％A；33-35min，5％A。

川赤芍中没食子鞣质类成分较实施例1响应值变低，分离度不如实施例1，代表性色谱图如图7所示。

对比例5

一种检测方法，其步骤与实施例1基本相同，不同之处在于，色谱条件的设置；

色谱条件为：流动相：溶剂A为100％乙腈溶液，溶剂B为质量浓度为0.1％的甲酸水溶液；流动相流速为0.4mL/min；色谱柱温度为25℃，进样量为2μL；梯度洗脱条件：0-0.5min，5％A；0.5-3min，5％-12％A；3～10min，12％-20％A；10-18min，20-30％A；18-28min，30-90％A；28-30min，90％A；30-33min，90％-5％A；33-35min，5％A。

川赤芍中没食子鞣质类成分较实施例1响应值变低，部分含量少的多取代没食子酰葡萄糖未能检测出，代表性色谱图如图8所示。

通过实施例1及对比例1～5，可以发现只有特定的色谱条件才能实现对川赤芍中以上25种没食子鞣质类成分的检测，同时采用本发明的色谱条件才能在保证分离度的同时检测出川赤芍中以上25种没食子鞣质类成分，采用本发明的方法可实现对川赤芍中没食子鞣质类成分的检测，具有操作简单、准确度高、检测精度高、稳定可靠等优点，填补了川赤芍中没食子鞣质类成分鉴定的空白，对不同基原芍药的分析具有重要的意义。

经验证，本发明的没食子鞣质类成分的检测方法，操作步骤简单，检测快速，且利用四极杆飞行时间串联质谱可同时获得没食子鞣质类成分的一级分子离子和二级碎片离子，质量误差小于5ppm，精确度和灵敏度高；对色谱条件和质谱条件等进行了系统优化，可检测出含量较低的没食子鞣质类成分，可检测川赤芍中含有的25种主要的没食子鞣质类化合物，填补了川赤芍中没食子鞣质类成分鉴定的空白，对不同基原芍药的分析具有重要的意义；可实现对川赤芍中没食子鞣质类成分较为全面的检测，极具应用前景。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应该理解，这些仅是举例说明，在不违背本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。