用于诊断胰胆道癌的甲基化标志物组合

摘要

本发明属于生物医药领域，具体涉及用于诊断胰胆道癌的甲基化标志物组合。具体地，所述甲基化标志物包括SOX17、3‑OST‑2、NXPH1、SEPT9和TERT中一个或多个。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及用于诊断胰胆道癌的甲基化标志物组合。

背景技术

胰胆道癌(Pancreatobiliary tract cance)包括胆道癌(bile tract cancer，BTC) 和胰腺癌(pancreatic cancer)。

胆道癌起源于不同解剖位置的胆管上皮细胞，如肝内、肝外和胆囊，或可能直接起源于肝细胞(hepatocytes)。胆道癌包括胆管癌(cholangiocarcinoma，CCA)、胆囊癌(gallbladder cancer，GBC)和壶腹癌(ampullary cancer)。胆管癌是第二常见的原发性肝癌，约占所有胃肠道肿瘤的3％。胆管癌又分为肝内(iCCA)、肝门周围(pCCA)或远端(dCCA)胆管癌。尽管胆道癌在全球范围内相对不常见，但近年来其全球发病率迅速增加，且在东亚和南亚以及南美洲部分地区的发病率最高。胆道癌的风险因素包括原发性硬化性胆管炎(PSC)、肝吸虫、纤维多囊肝病(例如胆管腺瘤和胆管乳头状瘤病)、胆道和胆囊结石、病毒性肝炎和化学致癌物暴露等。而胰腺癌是全球致死率最高的癌症之一，由于其预后不良，是全世界癌症死亡的第七大原因，具体包括胰头癌、胰尾癌、弥漫性癌等。

胰胆道癌的诊断具有挑战性。由于早期症状无特异性甚至无表现症状，大多数患者确诊时已处于晚期。晚期诊断，至少会是导致BTC患者预后不良，5年总生存率在20％以下。胆管狭窄和黄疸患者可能会患有胆管癌、胆囊癌或胰腺癌，而区分恶性肿瘤和良性狭窄(医源性胆管损伤、原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis，PSC)和胆总管结石(choledocholithiasis))难度很高。常规情况下，胰胆管癌是通过多种方式联合诊断的，包括临床检查、影像学成像、内镜操作、病理学评价和生化检查(例如CA19-9)。然而，这些方法存在一些局限性，例如CA19-9不适用于Lewis抗原阴性的患者(占一般人群的7％)，同时以上方法的敏感性和特异性不令人满意。据报告，约15-24％接受恶性胆管狭窄手术的患者最终被诊断为良性。

因此，迫切需要开发一种敏感性、特异性高、安全性高的诊断胰胆道癌的较好检测方式。

发明内容

胰胆管癌患者通常临床预后较差，5年总生存率低于20％。这主要与诊断晚有关。此外术前准确区分恶性癌症与良性疾病，可以避免不必要的创伤。因此，迫切需要开发一种灵敏度高、特异性强、安全性高的诊断恶性胰胆管癌的检测方法。

为实现以上技术目的，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供了检测甲基化标志物的试剂在诊断胰胆道癌的产品中的应用，所述甲基化标志物包括SOX17、3-OST-2、NXPH1、SEPT9和TERT中一个或多个。

优选地，所述甲基化标志物由SOX17、3-OST-2、NXPH1、SEPT9和TERT 组成。

优选地，所述甲基化标志物还可以包括EBF3、RASSF1、APC、EYA4、RUNX3、 BNIP3、FHIT、SALL3、CCND2、FOXE1、CD1D、GSTP1、SFRP1、CDH1、hMLH1、 SLIT2、CDH13、KCNK12、SLIT3、CDKN2A、MGMT、CDKN2B、NDRG4、 CDO1、NPTX2、TFPI2、CLEC11、TIMP3、CNRIP1、PENK、TMEFF2(HPP1)、 DAPK1、PRKCB、VIM、DCLK1、PTCHD2、ZSCAN18、DLC1、RARβ2(RARB) 中的任意一个或多个。

优选地，所述检测甲基化标志物是指检测其甲基化程度。

优选地，所述甲基化标志物可通过本领域所公知的方法进行检测，具体地例如：全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)、焦磷酸测序(Pyrosequencing)、亚硫酸氢盐测序、甲基化特异性聚合酶链式反应(甲基化特异性PCR，Methylation- Specific PCR，MS-PCR)、亚硫酸氢盐特异性聚合酶链式反应、甲基化敏感限制性内切酶-PCR/Southern法、结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(Combined Bisulfite Restriction Analysis，COBRA)、数字聚合酶链式反应、限制性界标基因组扫描、CpG岛微阵列、单核苷酸引物延伸SNUPE、甲基化图谱分析(Methylation Profiling)、甲基化芯片中一种或多种。

本发明所述术语“胰胆道癌”也可称为胰胆管癌(Pancreatobiliary tractcance)，其包括胆道癌(bile tract cancer，BTC，亦可成为胆管癌)和胰腺癌(pancreaticcancer)；所述胆管癌包括胆管癌(cholangiocarcinoma，CCA)、胆囊癌(gallbladdercancer，GBC)和壶腹癌(ampullary cancer)；所述胰腺癌包括胰头癌、胰尾癌、弥漫性癌。

优选地，本发明中所述非癌患者在至少12个月内未确诊患有癌症的受试者，可选的，所述非癌患者可能具有以下非恶性肿瘤的症状：胆结石、胆道梗阻、胆道狭窄、胰腺占位、胰腺囊肿、胰腺炎。

优选地，所述检测是针对来源于受试者的样本进行的。

本领域可选用的样本包括胆汁、细胞、组织、外周血、血液、血清、血浆、尿液、唾液、泪液等；如本发明具体实施例所应用地，优选的样本包括胆汁或取自胆道的细胞、组织。更具体地，所述取自胆道的细胞组织包括经内镜逆行性胰胆管造影术(ERCP)活检/刷检所取得的样本。

更优选地，所述样本需要经过处理，所述处理包括DNA提取的步骤。

优选地，所述提取DNA的提取试剂可包括裂解缓冲液、结合缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液任意一种或多种。裂解缓冲液通常由蛋白变性剂、去垢剂、 pH缓冲剂和核酸酶抑制剂组成。结合缓冲液通常由蛋白变性剂和pH缓冲剂组成。所述蛋白变性剂选自异硫氰酸胍、盐酸胍和尿素中的一种或多种；去垢剂选自Tween20、IGEPAL CA-630、Triton X-100、NP-40和SDS中的一种或多种； pH缓冲剂选自Tris、硼酸、磷酸盐、MES和HEPES中的一种或多种；核酸酶抑制剂选自EDTA、EGTA和DEPC中的一种或多种。

优选地，所述处理还可以包括纯化、质检等步骤。

优选地，所述受试者包括疑似胰胆道癌患者。

本文中使用的术语“受试者”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿类动物等，其将成为特定治疗的接受者。通常，术语“受试者”和“患者”在涉及人受试者时在本文中可互换地使用。

优选地，所述受试者是人。

优选地，使用SOX17、3-OST-2、NXPH1、SEPT9和TERT共同诊断时，最佳阈值为0.422。应指出，针对上文给出的阈值浓度以及下文的详述，最佳阈值可取决于特定的测量技术。本文给出的最佳阈值，涉及使用突变胶囊技术 (Mutation Capsule technology)的测量值，如果使用不同的方法，则可能需要类推转换，这种转换是在本领域技术人员技能范畴之内的。

另一方面，本发明提供了上述检测甲基化标志物的试剂和检测其他标志物的试剂共同在诊断胰胆道癌的产品中的应用，所述其他标志物包括以下基因突变： AKT1、KRAS、APC、NRAS、ARID1A、PIK3CA、AXIN1、PPP2R1A、BAP1、 PTEN、BRAF、SMAD4、CDKN2A、TERT、TP53、EGFR、FBXW7、FGFR2、 HRAS、IDH1、IDH2中的至少一个。

术语“标志物”或“生物标志物”，指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生改变的基因指标，可用于疾病诊断、判断疾病分期或评价新药新疗法在目标人群中的安全性和有效性。

更具体地，所述诊断胰胆道癌是指区分患有恶性肿瘤(胰胆道癌)的患者和不患有恶性肿瘤的患者，所述不患有恶性肿瘤的患者可能患有胆结石、胆道梗阻、胆道狭窄、胰腺占位、胰腺囊肿、胰腺炎等良性疾病。

在一种可选的实施例中，所述检测基因突变的试剂包括以下任意方法中使用的试剂：TaqMan探针法、测序法、芯片法、飞行质谱仪(MALDI-TOFMS)检测、限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)、单链构象多态性法(PCR-SSCP)、等位基因特异性PCR(AS-PCR)、SNaPshot法、SNPlex分型系统、SNPStream 分析系统、Sequenom分型系统、变性高效液相色谱法(DHPLC)、变性梯度凝胶电泳法(DGGE)。

另一方面，本发明还提供了一种诊断胰胆道癌的诊断系统，所述系统报告根据对受试者样本的甲基化标志物的检测结果得到诊断结论的计算装置。

优选地，所述系统包括：

(1)样本收集处理装置，用于完成以下步骤：收集来自受试者的样本、对样本进行处理；

(2)甲基化检测装置；

(3)根据对受试者样本的甲基化标志物的检测结果得到诊断结论的计算装置。

优选地，所述样本包括胆汁、胆道中的脱落细胞、组织样本。

优选地，所述处理包括纯化、质检、DNA提取等步骤。

另一方面，本发明还提供了一种诊断胰胆道癌的方法，所述方法根据对受试者样本的甲基化标志物的检测结果判断受试者是否患有恶性疾病(胰胆道癌)。

本发明实施方式的方法和/或系统的实施可包括手动地、自动地、或它们组合地来执行或完成所选任务。而且，根据本发明方法和/或系统的实施方式的实际仪器和设备，可通过硬件、通过软件、或通过固件或通过它们的组合使用操作系统来实施多个所选任务。

本发明具有以下有益效果：

本发明所提供的技术方案，可以以非侵入性的采样方式取得胆汁作为样品进行检测，作为具有高特异性、高敏感性的特点；在疾病的较早期准确诊断疾病，可以提早对患者进行针对性的治疗，提高治愈的可能性，延长生存期；同时对于非癌症患者，避免了不必须的手术创伤。

附图说明

图1是本发明的受试者入选标准和研究涉及流程图。

图2是本发明所涉及的受试者的基本信息统计图。

图3是各诊断模型在不同数据集中诊断效能的验证。

图4是训练队列和验证队列中受试者的检测结果统计。

图5是甲基化标志物的诊断效能的验证。

图6是各诊断模型在不同数据集中诊断效能与CA19-9的诊断效能的比较结果。

图7是刷检样本与活检样本中基因突变检测结果一致性的结果统计。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

研究人群选自从2018年11月份到2020年10月份以下五家医院收治的胰胆系疾病患者，共计338例。五家医院分别为：中国医学科学院肿瘤医院、四川达州市中心医院、首都医科大学附属北京朝阳医院、北京中医药大学东方医院、河北省襄阳市谷城县人民医院。因各种原因如非胆道癌或胆汁DNA不足的患者排除79例，最终选择了259例进行了分子检测。

在这259名患者中，被确诊为恶性或良性的209名患者被选为训练组(n＝104) 和验证组(n＝105)，其中116例为恶性肿瘤，93例为良性疾病。恶性肿瘤经ERCP (逆行性胰胆管造影术)活检/刷检(ERCP-obtained biopsies/brushings)诊断后证实为胆道恶性肿瘤(胰胆管癌症)。良性疾病患者包括78例胆结石症患者，该78 例患者手术切除的标本中未发现恶性病变，但发现有慢性胆管炎；其中15例随访12个月以上，经ERCP取胆结石，未发现恶性病变。

另外，考虑到有一些胆道癌(bile tract cancer，BTC)患者具有ERCP病理的低敏感性，50例经ERCP活检/刷检的诊断结果为阴性或可疑的患者被归类为独立的测试队列。在测试队列中，40个恶性肿瘤患者在随访期间通过病理评估 (手术切除的标本、经皮针或ERCP获得的活检/刷检，n＝21)、放射成像(n＝2) 或临床标准(n＝17)得到证实，而10个良性疾病通过手术病理(n＝4)、放射成像(n＝1)或随访至少12个月后未发现恶性肿瘤(n＝5)得到证实。

患者入选和研究设计如图1所示。该研究由上述五家医院的伦理审查委员会批准(ID：NCC2018JJJ-001)。

所有患者均获得胆汁样本，其中181名患者在接受治疗之前通过ERCP获得胆汁样本，78名胆结石症患者在切除胆囊手术中获得胆汁样本。

获得的胆汁样品以每分钟12000转的速度离心10分钟，分离上清液和颗粒。用TIANAMP基因组DNA试剂盒(天根生物科技，北京，中国)从胆汁样品中提取DNA。用Taqman探针对人GAPDH基因进行RQ-PCR检测以确定DNA质量。

除胆汁样本外，对34例和9例患者ERCP期间获得的成对活检或刷检组织进行NGS(Next-generation sequencing technology，下一代高通量测序技术)检测测序，用QIAampDNA Mini Kit(美国Qiagen)提取基因组DNA。

进一步使用罗氏E601系统(Roche Diagnostics，Switzerland)通过电化学发光(electrochemiluminescence)技术对大多数患者的血清进行CA19-9检测。

表1、本发明测序发现的突变基因和具有甲基化修饰的基因

取400ng DNA，用超声波破碎后，进行末端修复。然后，用甲基化敏感的限制性内切酶HHAⅠ(R0139S，New England Biolabs，MA，USA)消化DNA片段，并通过突变胶囊技术(Mutation Capsule technology)进行基于扩增子靶向捕获技术的靶向基因测序，具体技术方案可参考文献Qu,C.et al.Detection of early-stage hepatocellular carcinomain asymptomatic HBsAg-seropositive individuals by liquid biopsy.Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America.116,6308-6312(2019)。

简而言之，使用KAPA Hyper Prep试剂盒(瑞士，罗氏)处理经限制性内切酶HHA Ⅰ消化DNA的片段，通过一系列步骤，包括末端修复、腺苷酸A加尾、定制的接头连接和三轮PCR扩增(第一轮使用共同序列引物，最后两轮使用包含靶标特异性和共同序列的引物)，从而获得测序文库。对23个突变基因和44 个具有甲基化修饰的基因在进行测序(表1)。

使用Digital(UID)高通量测序平台进行基因测序。简单地说，PCR扩增前为样本中的每条片段加上唯一的UID标签，然后进行文库的扩增，测序完成后通过比对片段的序列，将相同UID标记的重复片段合并，同时保留不同UID标记天然重复，并根据开始坐标及cigar信息计算出reads的结束坐标；根据reads 的开始坐标和结束坐标，将reads对应的参考序列从参考基因组上截出；将reads 分别与hg19基因组进行再次比对，获得突变的起始位置和终止位置。有效UID (EUID，Effective UID)家系的定义为包含至少两次读出且至少80％读出类型相同的UID家系(Unique Identifier，UID)。每个突变的频率是通过将替代EUID家系的数量除以替代和参考家族的总和来计算。我们进一步人工检查了突变(in IGV)并使用VEP(Ensembl Variant Effect Predictor)对候选的变异基因进行注释。

所检测到的突变至少有四个EUID家族。对于包括KRAS(G12、G13、Q61 和A146)在内的热点突变的癌基因，其检测限(LOD，limitation of detection) 设置为0.5％。而对于其他突变基因，包括常见的无热点的抑癌基因，例如TP53、 Smad4和罕见突变，为了减少假阳性的出现，LOD设置为1％。由于没有匹配的白细胞来排除种系突变，因此用种系和体细胞突变数据库对样本中检测到的突变进行筛选，从而确定种系突变的可能性最高。在种系突变数据库(1000AF， ESP6500 AA/EA，Exac AF)中发现频率为≥0.1％的突变为种系突变，首先被排除。对通过的突变进行进一步筛选，对于那些频率较高的基因(≥40％)，如果它们出现在COSMIC数据库中样本数少于10个样本，那么它们很可能是胚系突变，因此进一步被排除。

在甲基化分析方面，末端带有HHA Ⅰ限制位点的簇是未甲基化的序列，至少含有一个HHA Ⅰ限制位点且末端不是限制位点的分子是甲基化序列。每个碱基的甲基化比率为甲基化分子数量与甲基化和非甲基化分子数量之和的比。

AKT1、KRAS、APC、NRAS、ARID1A、PIK3CA、AXIN1、PPP2R1A、BAP1、 PTEN、BRAF、SMAD4、CDKN2A、TERT、TP53、EGFR、FBXW7、FGFR2、 HRAS、IDH1、IDH2突变时均出现恶性肿瘤(如下表2)。

表2、突变的检测结果

在44个甲基化修饰基因中，使用训练队列(Training set)，采用逐步惩罚Logistic回归方法筛选出5个甲基化修饰基因SOX17、3-OST-2、NXPH1、SEPT9 和TERT用于构建诊断模型。用上述5个甲基化修饰基因标志物对训练队列进行惩罚Logistic回归，采用留一法交叉验证，通过受试者工作特征曲线下面积(ROC 曲线)、灵敏度和特异度指标来评估模型的性能。根据ROC分析的Youden指数来确定甲基化的截止值。

在BileScreen模型中，突变和甲基化整合时，两者之一为阳性即为阳性。接下来用单独的验证队列和测试队列中进一步评估了该BileScreen模型的性能。

另外，由于在训练队列和验证队列(Validation set)中，选择的良性病例多为患有胆结石的年轻女性，导致恶性和良性患者在年龄和性别上存在一定倾向性。为了排除这种人为样本选择对诊断预测结果的影响，将52名年龄和性别匹配的恶性患者和52名良性患者分配到训练队列中。因此，验证队列中的年龄和性别分布是不均匀的(图2)。但所有突变和甲基化与年龄、性别无明显相关性(相关系数/correlation coefficient<0.5，或Wilcoxon检验P>0.05)。

采用ROC分析(pROC包)和Wilcoxon检验评价个体突变基因或甲基化修饰的基因在预测疾病状态中的作用。采用惩罚Logistic回归方法(glmnet包)筛选诊断模型的基因标记物。在训练队列中，ROC曲线以原始分数为输入，单独使用Youden指数来确定甲基化的最佳截止点。此外，ROC分析用来比较不同方法的性能，以由相应的截止点确定的“0或1”值作为输入。使用标准2×2列联表(contingency tables)计算灵敏度和特异度。所有R包相关分析均基于R软件 (V.3.6.3)。

对训练队列中的104名患者进行了测序和数据分析，其中包括52例经ERCP 诊断病理证实的恶性肿瘤患者和52例良性疾病患者，该52例患者中有一部份经手术病理确定组织部位未发生癌变，另一部分为胆管结石患者，且至少进行了12 个月的随访，被确定为良性疾病，临床特征总结如图2。

利用突变胶囊技术(Mutation Capsule technology)，对胆汁样本的DNA进行了分析，检测了23个突变基因和44个甲基化修饰基因。在癌症中最常见的突变基因是TP53(50％)和KRAS(46％)。在癌症和良性疾病患者中同时检测到了 CTNNB1和GNAS突变，因此基因与恶性状态没有显著相关性，CTNNB1和GN AS突变被排除在BileScreen模型之外。

表3、各数据集的检测准确性

使用基因突变区分胰胆管癌患者和非癌症(良性疾病)受试者：

AKT1、KRAS、APC、NRAS、ARID1A、PIK3CA、AXIN1、PPP2R1A、BAP1、 PTEN、BRAF、SMAD4、CDKN2A、TERT、TP53、EGFR、FBXW7、FGFR2、 HRAS、IDH1、IDH2的突变，其中至少检测到一个突变被视为阳性；单靠突变区分胰胆管癌患者和非癌症受试者的敏感性(Sensitivity)为81％、特异性 (Specificity)为100％、AUC为0.90(表3，图3A)。

使用甲基化标志物区分胰胆管癌患者和非癌症(良性疾病)受试者：

对于甲基化标志物，通过逐步惩罚Logistic回归方法，选择了SOX17、3- OST-2、NXPH1、SEPT9和TERT这5个标记构建诊断模型(图3，表4)。通过留一法，仅甲基化标志物就能很好地从非癌症病例中识别出胰胆管癌患者，灵敏度为88％，特异度为98％，AUC为0.93(表3，图3)。甲基化评分的截止值为 0.422，产生了最大的Youden指数(图5)。

表4、基于5个甲基化标志物构建诊断模型

最后，当基因突变和甲基化标志物结合在一起时，即BileScreen：

阳性定义为两者中的任何一个为阳性，其性能进一步提高，敏感性为94％，特异性为98％，AUC为0.96(表3，图3)。BileScreen在另外105例病例(验证队列)中得到验证，其中64例为恶性病例，41例为良性病例(图4)。BileScreen 准确预测了59例恶性病例和40例非癌症病例的患病状态。BileScreen在验证队列中显示出92％的敏感性和98％的特异性，AUC为0.95(表3，图3)。如果仅采用基因突变，其敏感性和特异性分别为78％和100％。仅甲基化标志物分析的灵敏度和特异度分别为81％和98％(表3)。

我们进一步对50例ERCP(测试队列，Test cohort)结果不明确的患者进行了BileScreen验证，因为此50例患者的ERCP诊断结果为“可疑恶性肿瘤”或“无法排除癌症”。这些病例被随访至少12个月，50例中有40例被发现是恶性肿瘤。其余10例在随访期内未发现癌症，被诊断为良性。40例恶性病变中有 36例阳性，10例良性病变中有2例阳性，其敏感性为90％，特异性为80％(图 3)。对于那些不能通过ERCP得到确诊的患者，BileScreen结果与临床结果显著相关(P<0.001，连续性校正卡方检验)。

仅突变或甲基化就能区分癌症和良性患者，其敏感度分别为75％和80％，特异度分别为90％和80％，AUC分别为0.83和0.8(表3，图3)。

在训练队列和验证队列中，我们分别筛选出85名和74名患者，其血清CA19- 9数据可用(图2，表5)，对这些患者的血清CA19-9和BileScreen进行了直接比较。血清CA19-9在2个队列中鉴别良性和恶性的AUC分别为0.78和0.81 (图6)，以≥27U/mL为截止值，血清CA19-9敏感性分别为88％和91％，特异性分别为67％和70％(表5)。

表5、各模型和CA19-9在不同数据集中的验证结果

相比之下，BileScreen的敏感性分别为93％和94％，特异性分别为98％和 96％。在整个训练和验证队列中，CA19-9的敏感度和特异度分别为90％和68％，均低于BileScreen的93％和97％。因此，BileScreen在检测胰胆道癌方面，特别是在检测特异性方面，优于血清CA19-9。

此外，测试队列中的38名患者血清CA19-9结果如图6A所示，血清CA19- 9的特异性极低(14％)，AUC为0.51，敏感性为84％(表4，图6)。与训练和验证队列相比，CA19-9在预测ERCP诊断为可疑恶性肿瘤的患者中的准确性较低。相反，BileScreen在这一群体中的敏感性和特异性分别为87％和86％。

在测试队列中，34名患者通过ERCP获得活检样本，9名患者获得刷检样本。我们对基因和组织样本进行分析，进行头对头比较研究。在43个病例中， 70个突变均存在于两种样本类型中，5个突变仅在胆汁(刷检样本)中检测到， 9个仅在组织(活检样本)中检测到(图7)。因此，胆汁中93％(70/75)的突变也可在组织中检测到，另外一些突变仅在胆汁中发现，89％(70/79)的组织源性突变可在胆汁中检测到。另外，43例样本中有36例在至少一种类型的样本中检测到突变，其中34例(94％)在两种样本类型之间检测到至少一种共同突变。因此，通过胆汁检测的患者的突变状态与通过组织检测的突变状态的符合率为 95％(41/43)。