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一种高效合成羟基酪醇的地衣芽胞杆菌、构建方法及应用

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本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种高效合成羟基酪醇的地衣芽胞杆菌、构建方法及其应用。本发明首先在地衣芽胞杆菌DW2基础上进一步进行多种改造，获得重组地衣芽胞杆菌DH7；选择来源于大肠杆菌中的4‑羟基苯乙酸‑3‑羟化酶和乳酸乳球菌的酮酸脱羧酶，将其转入到地衣芽胞杆菌DH7底盘细胞中，实现了羟基酪醇产量的从头合成；通过组合表达4‑羟基苯乙酸‑3‑羟化酶HpaBC和酮酸脱羧酶KivD突变体，使得所述重组地衣芽胞杆菌利用葡萄糖等廉价碳源可以高效合成羟基酪醇，产量高达5.55±0.37。本发明公开的重组地衣芽胞杆菌可以解决羟基酪醇产量低，价格昂贵的问题，具有广阔的工业前景。

著录项

公开/公告号CN114891820A

专利类型发明专利
公开/公告日2022-08-12

原文格式PDF
申请/专利权人湖北大学;
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申请/专利号CN202210595170.3
发明设计人陈守文;周飞;占杨杨;许海霞;尹昊;蔡冬波;马昕;
展开▼

申请日2022-05-28
分类号C12N15/75(2006.01);C12N15/90(2006.01);C12N1/21(2006.01);C12N15/54(2006.01);C12N15/53(2006.01);C12P7/22(2006.01);C12R1/10(2006.01);
代理机构武汉宇晨专利事务所(普通合伙) 42001;
代理人龚莹莹
地址 430000 湖北省武汉市武昌区友谊大道368号
入库时间 2023-06-19 16:22:17

法律信息

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态
2023-05-23

授权

发明专利权授予
2022-08-30

实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/75 专利申请号:2022105951703 申请日:20220528

实质审查的生效

说明书

技术领域

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种高效合成羟基酪醇的地衣芽胞杆菌、构建方法及其应用。

背景技术

羟基酪醇(Hydroxytyrosol，HT)又叫3,4-二羟基苯乙醇，是一种生物活性多酚，是目前已知的最强的天然抗氧化剂之一。羟基酪醇可以清除自由基，减少低密度脂蛋白的氧化，刺激钙的沉积。它还具有抗癌、抗炎和抗微生物活性。因此，羟基酪醇可用于化妆品、食品、保健品和医疗行业。

目前，HT是通过植物提取或化学合成在工业上制造的。自然界中，HT以橄榄苦苷的形式存在于橄榄植物中，可以从新鲜橄榄叶和橄榄加工废水中提取羟基酪醇。尽管这些材料丰富且价格低廉，但也存在一些缺点，例如收率低、酸性水蒸汽强和方法的持续时间长。化学合成则利用HT的一些类似物，如3,4-二羟基苯乙酸、3,4-二羟基苯甲醛和酪醇等作为底物合成羟基酪醇，这些方法由于基材昂贵、条件恶劣、步骤复杂或产量低不适合大规模工业化生产。

随着代谢工程和合成生物学的进步，通过重建天然途径或在微生物中引入人工生物合成途径，已经实现了从简单碳源从头生产HT。目前大多数报道都是利用大肠杆菌经过微生物改造合成羟基酪醇，这为微生物发酵法生产羟基酪醇奠定了重要基础。但是利用简单碳源从头合成HT，合成途径较长，代谢负担重，也存在效率不高和底物转化率低的问题，需要进一步提高从头效率以实现经济生产HT。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的之一是提供一种高效合成羟基酪醇的地衣芽胞杆菌。开发一种重组地衣芽胞杆菌，在产酪醇的地衣芽胞杆菌中优化表达合成羟基酪醇的基因酮酸脱羧酶基因以及羟化酶基因，构建异源合成羟基酪醇的地衣芽胞杆菌菌株。

本发明的另一个目的在于提供上述重组地衣芽胞杆菌在生产羟基酪醇中的应用。

为了解决上述问题，本发明的技术方案如下：

一种高效合成羟基酪醇的地衣芽胞杆菌，包括如下步骤：

依次敲除地衣芽胞杆菌DW2中的丙酮酸激酶基因pyk、酪氨酸/苯丙氨酸转氨酶基因hisC和醛脱氢酶基因dhaS，醇脱氢酶基因adhA获得地衣芽胞杆菌DH4，将tyrA

将大肠杆菌BL21(DE3)基因组中4-羟基苯乙酸-3-羟化酶基因hpaBC与kivD

其中hpaBC的启动子可以为：PbacA，P43或Pbay；

kivD

本发明的保护范围还包括：上述的地衣芽胞杆菌用于合成羟基酪醇。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明在地衣芽胞杆菌DH7中过表达KivD突变体(V461A和V461I)和HpaBC的目的基因。通过这些酶在重组地衣芽胞杆菌DH7中的有效表达，菌株可以利用葡萄糖为底物从头合成羟基酪醇，合成成本低廉，操作简单。

2、本发明利用强启动子P43、PbacA和Pbay高效驱动外源基因在重组地衣芽胞杆菌DH7中特异性表达，提高了重组表达载体的构建和转化效率，进而有效提高了地衣芽胞杆菌合成羟基酪醇的能力，提高了羟基酪醇的产量。

附图说明

图1为羟基酪醇的合成路线。

图2为DW2/pHY300和HT1羟基酪醇液相图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1：

基因工程菌株DH7的构建：

(1)敲除pyk、hisC和dhaS：以地衣芽胞杆菌DW2的基因组为模板，利用引物pyk-AF/AR和pyk-BF/BR分别扩增丙酮酸激酶基因pyk片段的上下游同源臂，将上下游同源臂片段融合得到pyk敲除盒；利用引物(T2-T5-F/R)，以质粒T2(2)-ori为模板扩增骨架；将pyk敲除盒插入质粒T2中，利用T2-F/T2-R进行菌落PCR，获得阳性转化子，经过DNA测序，成功构建pyk敲除质粒T2-△-pyk，导入地衣芽胞杆菌DW2中(或称为地衣芽孢杆菌DW2，CN112226437A)，通过同源重组获得pyk敲除菌株DH1；酪氨酸/苯丙氨酸转氨酶基因hisC和醛脱氢酶基因dhaS敲除载体构建方法同pyk，并通过迭代敲除获得pyk，hisC和dhaS基因同时敲除的菌株DH3；

其中，pyk敲除所需引物序列为：

pyk-AF：ctgcagcccgggggatccgggatacagctacatccc

pyk-AR：ttaaagtacgcttgcacgcggcccaattgtacaaact

pyk-BF：agtttgtacaattgggccgcgtgcaagcgtactttaa

pyk-BR：gatcttttctacgagctcgcggcagcctgctttttc

T2-T5-F：ggatcccccgggctgcaggaattc

T2-T5-R：gagctcgtagaaaagatcaaagga

T2-F：atgtgataactcggcgta

T2-R：gcaagcagcagattacgc

pyk-YF:ttctcggattgatcatgg

pyk-YR:aacggcttgacgactttc

敲除hisC的引物

hisC-AF：ctgcagcccgggggatccaacggcgtcgtgttcagc

hisC-AR：gtaaaatgaggtgacagagaggtgatgattcagtca

hisC-BF：tgactgaatcatcacctctctgtcacctcattttac

hisC-BR：gatcttttctacgagctccttggcggtgaaatgaaa

hisC-YF：gtgcggaaagtggctgat

hisC-YR：acatgaacatcgtaaaagc

敲除hisC的引物

dhaS-AF：ctgcagcccgggggatccgtgcgggtgtatgttcaa

dhaS-AR：atttcacgtccgagtccctcgggtgagttgtcttgg

dhaS-BF：ccaagacaactcacccgagggactcggacgtgaaat

dhaS-BR：gatcttttctacgagctcaataccaggaaccgacaa

dhaS-YF：accgcagcaggatgttct

dhaS-YR：cgcatttgctaaaccttc

(2)敲除醇脱氢酶基因adhA：以地衣芽胞杆菌DW2的基因组为模板，利用引物adhA-AF/AR和adhA-BF/BR分别扩增adhA片段的上下游同源臂，将上下游同源臂片段融合得到ahdA敲除盒，利用引物(T2-T5-F/R)，以质粒T2(2)-ori为模板扩增骨架；将其插入质粒T2中，利用T2-F/T2-R进行菌落PCR，获得阳性转化子，经过DNA测序，成功构建ad hA敲除质粒T2-△-adhA，导入地衣芽胞杆菌DH3中，通过同源重组获得adhA敲除菌株D H4；

adhA敲除所用引物如下

adhA-AF:ctgcagcccgggggatccagcagtgtagcacgataa

adhA-AR:gggaggcggaatctttccaatcatatgtaatacagagag

adhA-BF:ctctctgtattacatatgattggaaagattccgcctccc

adhA-BR:gatcttttctacgagctcccttaatggagggcggtcaa

adhA-YF:tcatgagtcctccgattc

adhA-YR:ttttatacgagcggtgac。

(3)tyrA

tyrA

ldh-AF：ctgcagcccgggggatccccgacctgtgatggagat

ldh-AR：ggagcgcgttcgacgatgcatattgtgcaatacttc

Pylb-F：gaagtattgcacaatatgcatcgtcgaacgcgctcc

Pylb-R：ggtcaattcagcaaccatacaaatctccccctttgt

TyrA-F：acaaagggggagatttgtatggttgctgaattgacc

TyrA-R：tccgtcctctctgctcttaatgaaggtattgggctg

TamyL-F：cagcccaataccttcattaagagcagagaggacgga

TamyL-R：aacagattcccaaacggacgcaataatgccgtcgca

ldh-BF：tgcgacggcattattgcgtccgtttgggaatctgtt

ldh-BR：gatcttttctacgagctctcaagcctcccatctgtg

ldh-YF:catatcagcggaatcatc

ldh-YR:ccgcttaatacaaggaga

(4)aroK和aroA启动子替换为PbacA：

利用引物ParoK-AF/AR扩增aroK启动子上下游500bp序列，分别作为上下同源臂，以地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA为模板扩增PbacA启动子序列，将上同源臂，启动子和下同源臂进行融合，设计引物(T2-T5-F和T2-T5-R)，以质粒T2(2)-ori为模板扩增骨架；使用一步克隆试剂盒将融合片段和线性质粒片段进行连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过PCR验证，测序分析，分别获得重组质粒T

aroA强化表达载体菌株构建方法同aroK启动子置换菌株，最终获得DH7菌株。

aroK启动子置换所用引物如下所示：

ParoK-AF：ctgcagcccgggggatccgtaggctcatttgctgat

PbacA(aroK)-AR：aatctcgccgaaatcgcaggctatttccaccagtcgtcaa

PbacA(aroK)-F：ttgacgactggtggaaatagcctgcgatttcggcgagatt

PbacA(aroK)-R：tctcattgcggcattcatataaaaattctcctttttgat

PbacA(aroK)-BF：atcaaaaaggagaatttttatatgaatgccgcaatgaga

ParoK-BR：gatcttttctacgagctcctttcaagttgtggaatg

ParoK-YF：aggcgttcaggcggaatt

ParoK-YR：gacacagcgatagaaaca

aroA启动子置换所用引物如下所示：

ParoA-AF：ctgcagcccgggggatccgaagtggacgcacatttc

PbacA(aroA)-AR：tctcgccgaaatcgcagggttatccatcctttcttt

PbacA(aroA)-F：aaagaaaggatggataaccctgcgatttcggcgaga

PbacA(aroA)-R：aagttcagtgttgctcatataaaaattctccttttt

PbacA(aroA)-BF：aaaaaggagaatttttatatgagcaacactgaactt

ParoA-BR：gatcttttctacgagctccaacacgctttaagattt

ParoA-YF：gttgacgcacgcttcgtt

ParoA-YR：attgatgaattccttcag

实施例2：

野生型kivD和hpaBC共表达菌株构建

步骤1：根据大肠杆菌BL21(DE3)基因组中hpaBC的序列，设计引物(P43-HpaBC-F和HpaBC-R)扩增hpaBC的序列，根据枯草芽胞杆菌168基因组中P43启动子的序列(SEQ IDNO.92所示)，设计引物(Amp-P43-F和P43-HpaBC-R)扩增出P43的序列；

其中，Amp-P43-F、P43-HpaBC-R、P43-HpaBC-F、HpaBC-R的序列为：

Amp-P43-F：acttttcggggaaatgtctgataggtggtatgtttt

P43-HpaBC-R：gaaatcttctggtttcatgtgtacattcctctctta

P43-HpaBC-F：taagagaggaatgtacacatgaaaccagaagatttc

HpaBC-R：gtaaacttggtctgacagttaaatcgcagcttccattt

步骤2：通过重叠延伸PCR将P43和hpaBC(SEQ ID NO.91所示)连接到一起(所用引物为Amp-P43-F和HpaBC-R)，获得融合片段；

步骤3：设计引物(T5-amp-F和T5-amp-R)，以质粒pHY-PbacA-kivD(ZhanY,etal.Efficient synthesis of 2-phenylethanol from L-phenylalanine by engineeredBacillus lichenif ormis using molasses as carbon source.Appl MicrobiolBiotechnol.2020.104(17):7507-7520)为模板扩增骨架。kivD序列为SEQ ID NO.88所示。

其中，T5-amp-F和T5-amp-R的序列为：

T5-amp-F：gacatttccccgaaaagtgccac

T5-amp-R：ctgtcagaccaagtttactcatata；

步骤4：使用一步克隆试剂盒将步骤(6)和(7)得到的基因片段和线性质粒片段进行连接，通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α，在37℃的条件下经含有四环抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：amp-YF和amp-YR)筛选到阳性转化子，DNA测序验证正确，命名为共表达载体pHY-PbacA-kivD-P43-hpaBC；

其中，amp-YF和amp-YR的序列为：

amp-YF：ccctgatctcgacttcgt

amp-YR：ttaaggggtctgacgctc

步骤5：将pHY-PbacA-kivD-P43-hpaBC质粒电转至DH7中，菌株PCR验证，成功获得成功转化重组质粒pHY-PbacA-kivD-P43-hpaBC的重组菌株HT1。

实施例3：

突变型kivD(V461A或V461I)和hpaBC共表达菌株的构建

步骤1：以实施例2中的载体pHY-PbacA-kivD-P43-hpaBC为模板，分别以引物V461A-F/R和V461I-F/R扩增含V461A和V461I的突变的骨架。

V461A-F：gttatacagctgaaagagaaattcatggaccaaatcaaa

V461A-R：ctctttcagctgtataaccatcattattgataataaagc

V461I-F：gttatacaatcgaaagagaaattcatggaccaaatcaaa

V461I-R：ctctttcgattgtataaccatcattattgataataaagc

步骤2：使用一步克隆试剂盒将步骤(1)得到的V461A和V461I的线性骨架进行载体自连，通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α，在37℃的条件下经含有四环抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：pHY-YF和pHY-YR)，并通过DNA测序验证突变位点成功突变，并将V461A和V461I突变体载体分别命名为pHY-PbacA-kivD

步骤3：将pHY-PbacA-kivD

实施例4：

不同启动子组合表达突变型kivD(V461A和V461I)和hpaBC的重组菌株的构建

步骤1：以实施例3中的质粒pHY-PbacA-kivD

其余15种组合表达载体如下表所示：

P43-kivD-F：tttttataacaggaattctgataggtggtatgtttt

P43-kivD-R：atctcctactgtatacatgtgtacattcctctctta

PbacA-kivD-F：tttttataacaggaattccctgcgatttcggcgaga

PbacA-kivD-R：atctcctactgtatacatataaaaattctccttttt

Pbay-kivD-F:tttttataacaggaattccctgcgatttcggcgaga

Pbay-kivD-R：atctcctactgtatacatacaaatctccccctttgt

kivD-T5-F：gaattcctgttataaaaaaaggatc

kivD-T5-R:：atgtatacagtaggagattaccta

P43-hpaBC-F:acttttcggggaaatgtctgataggtggtatgtttt

P43-hpaBC-R:gaaatcttctggtttcatgtgtacattcctctctta

PbacA-hpaBC-F:acttttcggggaaatgtccctgcgatttcggcgaga

PbacA-hpaBC-R:gaaatcttctggtttcatataaaaattctccttttt

Pbay-hpaBC-F:acttttcggggaaatgtccctgcgatttcggcgaga

Pbay-hpaBC-R:gaaatcttctggtttcatacaaatctccccctttgt

hpaBC-T5-F：gacatttccccgaaaagtgccac

HpaBC-T5-R:atgaaaccagaagatttccg

步骤2：将构建的18种不同组合表达的重组质粒和对照载体pHY300电转化至重组菌株DH7中，获得18中重组地衣芽胞杆菌HT2～HT19和HT0对照菌株。

实施例5：

重组地衣芽胞杆菌羟基酪醇发酵

1)种子发酵：平板上活化地衣芽胞杆菌DW2/pHY-300，HT0和不同重组地衣芽胞杆菌HT1～HT19，挑菌接至分别接种至含有50mL液体LB的250mL三角瓶中，37℃，230rp m培养13h。然后随后以2％(体积比)的接种量接种至发酵培养基中；羟基酪醇发酵培养基的培养条件为37℃，230rpm培养48h，发酵结束后测定羟基酪醇产量。

所述的羟基酪醇发酵培养基的配方是10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/LNaCl，18.6g/LK

2)发酵液前处理：利用去离子水将发酵液稀释，离心除菌体，再经0.22μm水相滤膜过滤。

3)采用高效液相色谱(HPLC)检测羟基酪醇。测定条件具体为：使用Agilent 1260高效液相色谱仪，色谱柱为C18柱(4.6mm ID×250mm,5μm)，流动相为甲醇：0.1％甲酸＝2：8，流速0.6mL/min，柱温30℃，进样量10.0μL，检测波长为224nm，洗脱25min。根据羟基酪醇标准品制作的标准曲线计算出发酵液中羟基酪醇的含量。结果表明，对照菌株DW2/pHY-300和DH0菌株未检测到羟基酪醇，而重组菌株中都检测到有羟基酪醇，其中H T7(pHY-P43-kivD

表1不同重组菌株羟基酪醇产量

序列表

<110> 湖北大学

<120> 一种高效合成羟基酪醇的地衣芽胞杆菌、构建方法及应用

<160> 94

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgcagcccg ggggatccgg gatacagcta catccc 36

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttaaagtacg cttgcacgcg gcccaattgt acaaact 37

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agtttgtaca attgggccgc gtgcaagcgt actttaa 37

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatcttttct acgagctcgc ggcagcctgc tttttc 36

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggatcccccg ggctgcagga attc 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gagctcgtag aaaagatcaa agga 24

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgtgataac tcggcgta 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcaagcagca gattacgc 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttctcggatt gatcatgg 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aacggcttga cgactttc 18

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctgcagcccg ggggatccaa cggcgtcgtg ttcagc 36

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtaaaatgag gtgacagaga ggtgatgatt cagtca 36

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgactgaatc atcacctctc tgtcacctca ttttac 36

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gatcttttct acgagctcct tggcggtgaa atgaaa 36

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gtgcggaaag tggctgat 18

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

acatgaacat cgtaaaagc 19

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctgcagcccg ggggatccgt gcgggtgtat gttcaa 36

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atttcacgtc cgagtccctc gggtgagttg tcttgg 36

<210> 19

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ccaagacaac tcacccgagg gactcggacg tgaaat 36

<210> 20

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gatcttttct acgagctcaa taccaggaac cgacaa 36

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

accgcagcag gatgttct 18

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cgcatttgct aaaccttc 18

<210> 23

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ctgcagcccg ggggatccag cagtgtagca cgataa 36

<210> 24

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gggaggcgga atctttccaa tcatatgtaa tacagagag 39

<210> 25

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ctctctgtat tacatatgat tggaaagatt ccgcctccc 39

<210> 26

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gatcttttct acgagctccc ttaatggagg gcggtcaa 38

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tcatgagtcc tccgattc 18

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ttttatacga gcggtgac 18

<210> 29

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ctgcagcccg ggggatcccc gacctgtgat ggagat 36

<210> 30

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ggagcgcgtt cgacgatgca tattgtgcaa tacttc 36

<210> 31

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gaagtattgc acaatatgca tcgtcgaacg cgctcc 36

<210> 32

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ggtcaattca gcaaccatac aaatctcccc ctttgt 36

<210> 33

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

acaaaggggg agatttgtat ggttgctgaa ttgacc 36

<210> 34

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

tccgtcctct ctgctcttaa tgaaggtatt gggctg 36

<210> 35

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

cagcccaata ccttcattaa gagcagagag gacgga 36

<210> 36

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

aacagattcc caaacggacg caataatgcc gtcgca 36

<210> 37

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

tgcgacggca ttattgcgtc cgtttgggaa tctgtt 36

<210> 38

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

gatcttttct acgagctctc aagcctccca tctgtg 36

<210> 39

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

catatcagcg gaatcatc 18

<210> 40

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

ccgcttaata caaggaga 18

<210> 41

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

ctgcagcccg ggggatccgt aggctcattt gctgat 36

<210> 42

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

aatctcgccg aaatcgcagg ctatttccac cagtcgtcaa 40

<210> 43

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

ttgacgactg gtggaaatag cctgcgattt cggcgagatt 40

<210> 44

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

tctcattgcg gcattcatat aaaaattctc ctttttgat 39

<210> 45

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

atcaaaaagg agaattttta tatgaatgcc gcaatgaga 39

<210> 46

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

gatcttttct acgagctcct ttcaagttgt ggaatg 36

<210> 47

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

aggcgttcag gcggaatt 18

<210> 48

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

gacacagcga tagaaaca 18

<210> 49

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

ctgcagcccg ggggatccga agtggacgca catttc 36

<210> 50

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

tctcgccgaa atcgcagggt tatccatcct ttcttt 36

<210> 51

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

aaagaaagga tggataaccc tgcgatttcg gcgaga 36

<210> 52

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

aagttcagtg ttgctcatat aaaaattctc cttttt 36

<210> 53

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

aaaaaggaga atttttatat gagcaacact gaactt 36

<210> 54

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

gatcttttct acgagctcca acacgcttta agattt 36

<210> 55

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

gttgacgcac gcttcgtt 18

<210> 56

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

attgatgaat tccttcag 18

<210> 57

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

acttttcggg gaaatgtctg ataggtggta tgtttt 36

<210> 58

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

gaaatcttct ggtttcatgt gtacattcct ctctta 36

<210> 59

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

taagagagga atgtacacat gaaaccagaa gatttc 36

<210> 60

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

gtaaacttgg tctgacagtt aaatcgcagc ttccattt 38

<210> 61

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

gacatttccc cgaaaagtgc cac 23

<210> 62

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

ctgtcagacc aagtttactc atata 25

<210> 63

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

ccctgatctc gacttcgt 18

<210> 64

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

ttaaggggtc tgacgctc 18

<210> 65

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

gttatacagc tgaaagagaa attcatggac caaatcaaa 39

<210> 66

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

ctctttcagc tgtataacca tcattattga taataaagc 39

<210> 67

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

gttatacaat cgaaagagaa attcatggac caaatcaaa 39

<210> 68

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

ctctttcgat tgtataacca tcattattga taataaagc 39

<210> 69

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

tttttataac aggaattctg ataggtggta tgtttt 36

<210> 70

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

atctcctact gtatacatgt gtacattcct ctctta 36

<210> 71

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

tttttataac aggaattccc tgcgatttcg gcgaga 36

<210> 72

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

atctcctact gtatacatat aaaaattctc cttttt 36

<210> 73

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

tttttataac aggaattccc tgcgatttcg gcgaga 36

<210> 74

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

atctcctact gtatacatac aaatctcccc ctttgt 36

<210> 75

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

gaattcctgt tataaaaaaa ggatc 25

<210> 76

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

atgtatacag taggagatta ccta 24

<210> 77

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

acttttcggg gaaatgtctg ataggtggta tgtttt 36

<210> 78

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 78

gaaatcttct ggtttcatgt gtacattcct ctctta 36

<210> 79

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

acttttcggg gaaatgtccc tgcgatttcg gcgaga 36

<210> 80

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 80

gaaatcttct ggtttcatat aaaaattctc cttttt 36

<210> 81

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

acttttcggg gaaatgtccc tgcgatttcg gcgaga 36

<210> 82

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 82

gaaatcttct ggtttcatac aaatctcccc ctttgt 36

<210> 83

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 83

gacatttccc cgaaaagtgc cac 23

<210> 84

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 84

atgaaaccag aagatttccg 20

<210> 85

<211> 1122

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 85

atggttgctg aattgaccgc attacgcgat caaattgatg aagtcgataa agcgctgctg 60

aatttattag cgaagcgtct ggaactggtt gctgaagtgg gcgaggtgaa aagccgcttt 120

ggactgccta tttatgttcc ggagcgcgag gcatctatct tggcctcgcg tcgtgcagag 180

gcggaagctc tgggtgtacc gccagatctg attgaggatg ttttgcgtcg ggtgatgcgt 240

gaatcttact ccagtgaaaa cgacaaagga tttaaaacac tttgtccgtc actgcgtccg 300

gtggttatcg tcggcggtgg cggtcagatg ggacgcctgt tcgagaagat gctgaccctc 360

tcgggttatc aggtgcggat tctggagcaa catgactggg atcgagcggc tgatattgtt 420

gccgatgccg gaatggtgat tgttagtgtg ccaatccacg ttactgagca agttattggc 480

aaattaccgc ctttaccgaa agattgtatt ctggtcgatc tggcatcagt gaaaaatggg 540

ccattacagg ccatgctggt ggcgcatgat ggtccggtgc tggggctaca cccgatgttc 600

ggtccggaca gcggtagcct ggcaaagcaa gttgtggtct ggtgtgatgg acgtaaaccg 660

gaagcatacc aatggtttct ggagcaaatt caggtctggg gcgctcggct gcatcgtatt 720

agcgccgtcg agcacgatca gaatatggcg tttattcagg cactgcgcca ctttgctact 780

tttgcttacg ggctgcacct ggcagaagaa aatgttcagc ttgagcaact tctggcgctc 840

tcttcgccga tttaccgcct tgagctggcg atggtcgggc gactgtttgc tcaggatccg 900

cagctttatg ccgacatcat tatgtcgtca gagcgtaatc tggcgttaat caaacgttac 960

tataagcgtt tcggcgaggc gattgagttg ctggagcagg gcgataagca ggcgtttatt 1020

gacagtttcc gcaaggtgga gcactggttc ggcgattacg tacagcgttt tcagagtgaa 1080

agccgcgtgt tattgcgtca ggcgaatgac aatcgccagt aa 1122

<210> 86

<211> 373

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 86

Met Val Ala Glu Leu Thr Ala Leu Arg Asp Gln Ile Asp Glu Val Asp

1 5 10 15

Lys Ala Leu Leu Asn Leu Leu Ala Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala Glu

20 25 30

Val Gly Glu Val Lys Ser Arg Phe Gly Leu Pro Ile Tyr Val Pro Glu

35 40 45

Arg Glu Ala Ser Ile Leu Ala Ser Arg Arg Ala Glu Ala Glu Ala Leu

50 55 60

Gly Val Pro Pro Asp Leu Ile Glu Asp Val Leu Arg Arg Val Met Arg

65 70 75 80

Glu Ser Tyr Ser Ser Glu Asn Asp Lys Gly Phe Lys Thr Leu Cys Pro

85 90 95

Ser Leu Arg Pro Val Val Ile Val Gly Gly Gly Gly Gln Met Gly Arg

100 105 110

Leu Phe Glu Lys Met Leu Thr Leu Ser Gly Tyr Gln Val Arg Ile Leu

115 120 125

Glu Gln His Asp Trp Asp Arg Ala Ala Asp Ile Val Ala Asp Ala Gly

130 135 140

Met Val Ile Val Ser Val Pro Ile His Val Thr Glu Gln Val Ile Gly

145 150 155 160

Lys Leu Pro Pro Leu Pro Lys Asp Cys Ile Leu Val Asp Leu Ala Ser

165 170 175

Val Lys Asn Gly Pro Leu Gln Ala Met Leu Val Ala His Asp Gly Pro

180 185 190

Val Leu Gly Leu His Pro Met Phe Gly Pro Asp Ser Gly Ser Leu Ala

195 200 205

Lys Gln Val Val Val Trp Cys Asp Gly Arg Lys Pro Glu Ala Tyr Gln

210 215 220

Trp Phe Leu Glu Gln Ile Gln Val Trp Gly Ala Arg Leu His Arg Ile

225 230 235 240

Ser Ala Val Glu His Asp Gln Asn Met Ala Phe Ile Gln Ala Leu Arg

245 250 255

His Phe Ala Thr Phe Ala Tyr Gly Leu His Leu Ala Glu Glu Asn Val

260 265 270

Gln Leu Glu Gln Leu Leu Ala Leu Ser Ser Pro Ile Tyr Arg Leu Glu

275 280 285

Leu Ala Met Val Gly Arg Leu Phe Ala Gln Asp Pro Gln Leu Tyr Ala

290 295 300

Asp Ile Ile Met Ser Ser Glu Arg Asn Leu Ala Leu Ile Lys Arg Tyr

305 310 315 320

Tyr Lys Arg Phe Gly Glu Ala Ile Glu Leu Leu Glu Gln Gly Asp Lys

325 330 335

Gln Ala Phe Ile Asp Ser Phe Arg Lys Val Glu His Trp Phe Gly Asp

340 345 350

Tyr Val Gln Arg Phe Gln Ser Glu Ser Arg Val Leu Leu Arg Gln Ala

355 360 365

Asn Asp Asn Arg Gln

370

<210> 87

<211> 1647

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 87

atgtatacag taggagatta cctattagac cgattacacg agttaggaat tgaagaaatt 60

tttggagtcc ctggagacta taacttacaa tttttagatc aaattatttc ccgcaaggat 120

atgaaatggg tcggaaatgc taatgaatta aatgcttcat atatggctga tggctatgct 180

cgtactaaaa aagctgccgc atttcttaca acctttggag taggtgaatt gagtgcagtt 240

aatggattag caggaagtta cgccgaaaat ttaccagtag tagaaatagt gggatcacct 300

acatcaaaag ttcaaaatga aggaaaattt gttcatcata cgctggctga cggtgatttt 360

aaacacttta tgaaaatgca cgaacctgtt acagcagctc gaactttact gacagcagaa 420

aatgcaaccg ttgaaattga ccgagtactt tctgcactat taaaagaaag aaaacctgtc 480

tatatcaact taccagttga tgttgctgct gcaaaagcag agaaaccctc actccctttg 540

aaaaaagaaa actcaacttc aaatacaagt gaccaagaga tcttgaacaa aattcaagaa 600

agcttgaaaa atgccaaaaa accaatcgtg attacaggac atgaaataat tagttttggc 660

ttagaaaaaa cagtctctca atttatttca aagacaaaac tacctattac gacattaaac 720

tttggaaaaa gttcagttga tgaagctctc ccttcatttt taggaatcta taatggtaaa 780

ctctcagagc ctaatcttaa agaattcgtg gaatcagccg acttcatcct gatgcttgga 840

gttaaactca cagactcttc aacaggagcc ttcactcatc atttaaatga aaataaaatg 900

atttcactga atatagatga aggaaaaata tttaacgaaa gcatccaaaa ttttgatttt 960

gaatccctca tctcctctct cttagaccta agcgaaatag aatacaaagg aaaatatatc 1020

gataaaaagc aagaagactt tgttccatca aatgcgcttt tatcacaaga ccgcctatgg 1080

caagcagttg aaaacctaac tcaaagcaat gaaacaatcg ttgctgaaca agggacatca 1140

ttctttggcg cttcatcaat tttcttaaaa ccaaagagtc attttattgg tcaaccctta 1200

tggggatcaa ttggatatac attcccagca gcattaggaa gccaaattgc agataaagaa 1260

agcagacacc ttttatttat tggtgatggt tcacttcaac ttacggtgca agaattagga 1320

ttagcaatca gagaaaaaat taatccaatt tgctttatta tcaataatga tggttataca 1380

gtcgaaagag aaattcatgg accaaatcaa agctacaatg atattccaat gtggaattac 1440

tcaaaattac cagaatcatt tggagcaaca gaagaacgag tagtctcgaa aatcgttaga 1500

actgaaaatg aatttgtgtc tgtcatgaaa gaagctcaag cagatccaaa tagaatgtac 1560

tggattgagt tagttttggc aaaagaagat gcaccaaaag tactgaaaaa aatgggcaaa 1620

ctatttgctg aacaaaataa atcataa 1647

<210> 88

<211> 548

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 88

Met Tyr Thr Val Gly Asp Tyr Leu Leu Asp Arg Leu His Glu Leu Gly

1 5 10 15

Ile Glu Glu Ile Phe Gly Val Pro Gly Asp Tyr Asn Leu Gln Phe Leu

20 25 30

Asp Gln Ile Ile Ser Arg Lys Asp Met Lys Trp Val Gly Asn Ala Asn

35 40 45

Glu Leu Asn Ala Ser Tyr Met Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Thr Lys Lys

50 55 60

Ala Ala Ala Phe Leu Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser Ala Val

65 70 75 80

Asn Gly Leu Ala Gly Ser Tyr Ala Glu Asn Leu Pro Val Val Glu Ile

85 90 95

Val Gly Ser Pro Thr Ser Lys Val Gln Asn Glu Gly Lys Phe Val His

100 105 110

His Thr Leu Ala Asp Gly Asp Phe Lys His Phe Met Lys Met His Glu

115 120 125

Pro Val Thr Ala Ala Arg Thr Leu Leu Thr Ala Glu Asn Ala Thr Val

130 135 140

Glu Ile Asp Arg Val Leu Ser Ala Leu Leu Lys Glu Arg Lys Pro Val

145 150 155 160

Tyr Ile Asn Leu Pro Val Asp Val Ala Ala Ala Lys Ala Glu Lys Pro

165 170 175

Ser Leu Pro Leu Lys Lys Glu Asn Ser Thr Ser Asn Thr Ser Asp Gln

180 185 190

Glu Ile Leu Asn Lys Ile Gln Glu Ser Leu Lys Asn Ala Lys Lys Pro

195 200 205

Ile Val Ile Thr Gly His Glu Ile Ile Ser Phe Gly Leu Glu Lys Thr

210 215 220

Val Ser Gln Phe Ile Ser Lys Thr Lys Leu Pro Ile Thr Thr Leu Asn

225 230 235 240

Phe Gly Lys Ser Ser Val Asp Glu Ala Leu Pro Ser Phe Leu Gly Ile

245 250 255

Tyr Asn Gly Lys Leu Ser Glu Pro Asn Leu Lys Glu Phe Val Glu Ser

260 265 270

Ala Asp Phe Ile Leu Met Leu Gly Val Lys Leu Thr Asp Ser Ser Thr

275 280 285

Gly Ala Phe Thr His His Leu Asn Glu Asn Lys Met Ile Ser Leu Asn

290 295 300

Ile Asp Glu Gly Lys Ile Phe Asn Glu Ser Ile Gln Asn Phe Asp Phe

305 310 315 320

Glu Ser Leu Ile Ser Ser Leu Leu Asp Leu Ser Glu Ile Glu Tyr Lys

325 330 335

Gly Lys Tyr Ile Asp Lys Lys Gln Glu Asp Phe Val Pro Ser Asn Ala

340 345 350

Leu Leu Ser Gln Asp Arg Leu Trp Gln Ala Val Glu Asn Leu Thr Gln

355 360 365

Ser Asn Glu Thr Ile Val Ala Glu Gln Gly Thr Ser Phe Phe Gly Ala

370 375 380

Ser Ser Ile Phe Leu Lys Pro Lys Ser His Phe Ile Gly Gln Pro Leu

385 390 395 400

Trp Gly Ser Ile Gly Tyr Thr Phe Pro Ala Ala Leu Gly Ser Gln Ile

405 410 415

Ala Asp Lys Glu Ser Arg His Leu Leu Phe Ile Gly Asp Gly Ser Leu

420 425 430

Gln Leu Thr Val Gln Glu Leu Gly Leu Ala Ile Arg Glu Lys Ile Asn

435 440 445

Pro Ile Cys Phe Ile Ile Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Val Glu Arg Glu

450 455 460

Ile His Gly Pro Asn Gln Ser Tyr Asn Asp Ile Pro Met Trp Asn Tyr

465 470 475 480

Ser Lys Leu Pro Glu Ser Phe Gly Ala Thr Glu Glu Arg Val Val Ser

485 490 495

Lys Ile Val Arg Thr Glu Asn Glu Phe Val Ser Val Met Lys Glu Ala

500 505 510

Gln Ala Asp Pro Asn Arg Met Tyr Trp Ile Glu Leu Val Leu Ala Lys

515 520 525

Glu Asp Ala Pro Lys Val Leu Lys Lys Met Gly Lys Leu Phe Ala Glu

530 535 540

Gln Asn Lys Ser

545

<210> 89

<211> 1647

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 89