瑶药白背三七中吡咯里西啶生物碱的含量测定方法

摘要

本发明公开了一种瑶药白背三七中吡咯里西啶生物碱的含量测定方法，具体包括：混合对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、用高效液相色谱‑质谱联用仪在限定的色谱质谱条件下进样测定，然后依据外标法计算7种吡咯里西啶生物碱的含量等步骤。采用本发明方法可同时测定白背三七中芝麻菜叶千里光碱氮氧化物、春千里光碱、春千里光碱氮氧化物、倒千里光碱、千里光菲灵碱、千里光宁碱和野百合碱7种吡咯里西啶生物碱的含量，该检测方法简单、稳定性好、分析速度快、检测结果准确，采用该方法能够科学、合理地对白背三七中吡咯里西啶生物碱的风险进行评估，提高用药安全性；为白背三七中吡咯里西啶生物碱质量控制和安全性评价提供科学依据。

说明书

技术领域

本发明属于中药材检测技术领域，具体涉及瑶药白背三七中吡咯里西啶生物碱的含量测定方法。

背景技术

白背三七

吡咯里西啶生物碱(Pyrrolizidine Alkaloids，PAs)是有花植物为防御食草性动物而产生的一种次生代谢产物，世界上约3％的有花植物(6000多种)含有吡咯里西啶生物碱，且以游离的吡咯里西啶生物碱及其氮氧化物两种形式存在；迄今为止，PAs已在13个科的植物中检出。据报道，吡咯里西啶生物碱（Pyrrolizidine Alkaloids，PAs）及其N-氧化物广泛存在于菊科、紫草科、夹竹桃科等植物中，在吡咯啶环的1，2位为双键的PAs成分，具有较强肝脏毒性，称为肝毒性吡咯里西啶生物碱(Hepatotoxic pyrrolizidine alkaloids，HPAs)，HPAs可引起不可逆的肝细胞损伤，并导致肝窦阻塞综合征(Hepatic sinusoidalobstruction syndrome，HSOS)、肝巨细胞症，过量或长期摄入，严重可造成肝硬化和肝纤维化等不良后果。国内因服用含有HPAs的中药，如菊三七(又名土三七)、千里光等引起HSOS的病例每年都有报道。除肝毒性，PAs还对肺、心、肾、胰、脑等具有毒性及明显的致癌、致突变、致畸胎作用；如长期服用该药材存在较大安全风险。

白背三七中除主要含有黄酮、三萜、甾醇及核苷类化学成分外, 还含有肝毒性吡咯里西啶生物碱，存在一定的用药风险，因此，建立白背三七中吡咯里西啶生物碱检测方法，全面且准确地测定白背三七中吡咯里西啶生物碱的含量，对于评估白背三七的食品安全性及加强对白背三七中吡咯里西啶生物碱含量的监管具有重要作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种瑶药白背三七中吡咯里西啶生物碱的含量测定方法，采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）法同时测定白背三七中芝麻菜叶千里光碱氮氧化物、春千里光碱、春千里光碱氮氧化物、倒千里光碱、千里光菲灵碱、千里光宁碱和野百合碱7种吡咯里西啶生物碱（结构式见图1）的含量。该方法稳定可行，采用该方法能够科学、合理地对白背三七中吡咯里西啶生物碱的风险进行评估，提高用药安全性；为白背三七中吡咯里西啶生物碱质量控制和安全性评价提供科学依据。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种瑶药白背三七中吡咯里西啶生物碱的含量测定方法，采用UPLC-MS/MS法进行同时测定白背三七中芝麻菜叶千里光碱氮氧化物、春千里光碱、春千里光碱氮氧化物、倒千里光碱、千里光菲灵碱、千里光宁碱和野百合碱7吡咯里西啶生物碱的含量，具体包括如下步骤：

（1）混合对照品溶液的制备

精密称取芝麻菜叶千里光碱的氮氧化物、春千里光碱、春千里光碱氮氧化物、倒千里光碱、千里光菲灵碱、千里光宁碱、野百合碱对照品适量，分别加甲醇配成质量浓度为10.256、10.368、10.154、9.985、10.280、9.887、10.065μg·mL

（2）供试品溶液的制备

取白背三七粉末，过四号筛，2.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入0.05mol·L

（3）色谱质谱条件

色谱柱：Agilent Poroshell 120 SB-C18色谱柱，150 mm×3.0 mm，2.7μm；柱温：40℃；流动相：0.1% 甲酸和5.0mmol·L

质谱离子源采用ESI源，正离子，多反应监测模式（MRM），气帘气（CUR）流速20L/min，喷雾电压（IS）5500V，离子源温度（TEM）450℃；

（4）测定

分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各2μL，注入超高效液相色谱与质谱联用仪，在上述色谱质谱条件下进样测定，记录色谱图，依据外标法计算芝麻菜叶千里光碱的氮氧化物、春千里光碱、春千里光碱氮氧化物、倒千里光碱、千里光菲灵碱、千里光宁碱和野百合碱的含量。

进一步的，上述的瑶药白背三七中吡咯里西啶生物碱的含量测定方法，步骤（2）供试品溶液的制备中，所述超声提取的功率为320 W，超声波频率为45 kHz；所述的SPE-MCX固相萃取小柱使用前先用甲醇5mL活化，0.05mol·L

进一步的，上述的瑶药白背三七中吡咯里西啶生物碱的含量测定方法，步骤（3）色谱质谱条件中，芝麻菜叶千里光碱氮氧化物、春千里光碱、春千里光碱氮氧化物、倒千里光碱、千里光菲灵碱、千里光宁碱和野百合碱7种吡咯里西啶生物碱的质谱条件如下表所示：

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种瑶药白背三七中吡咯里西啶生物碱的含量测定方法，采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）法同时测定白背三七中芝麻菜叶千里光碱氮氧化物、春千里光碱、春千里光碱氮氧化物、倒千里光碱、千里光菲灵碱、千里光宁碱和野百合碱7种吡咯里西啶生物碱（结构式见图1） 的含量。该方法稳定可行，采用该方法能够科学、合理地对白背三七中吡咯里西啶生物碱的风险进行评估，提高用药安全性；为白背三七中吡咯里西啶生物碱质量控制和安全性评价提供科学依据。

本发明提供的瑶药白背三七中吡咯里西啶生物碱的含量测定方法，能全面且准确地测定白背三七中吡咯里西啶生物碱的含量，检测方法简单、精确度高，稳定性好、专属性强、分析速度快、检测结果准确，并可根据测定结果进行初步的风险评估。通过该方法检测发现5批白背三七药材的MOE均小于10000，如长期使用，存在一定的用药风险。因此有必要进一步在药材标准中增加PAs限量规定以及服用的风险提示，降低用药风险，保障人民的用药安全。本发明提供的方法对于评估白背三七的食品安全性及加强对白背三七中吡咯里西啶生物碱含量的监管具有重要作用。

附图说明

图1 7种吡咯里西啶生物碱的分子结构式，图中，1、芝麻菜叶千里光碱氮氧化物，2、春千里光碱，3、春千里光碱氮氧化物，4、倒千里光碱，5、千里光菲灵碱，6、千里光宁碱，7、野百合碱；

图2混合对照品提取离子流图，图中，1、芝麻菜叶千里光碱氮氧化物，2、春千里光碱，3、春千里光碱氮氧化物，4、倒千里光碱，5、千里光菲灵碱，6、千里光宁碱，7、野百合碱；

图3 S1号样品提取离子流图，图中，4、倒千里光碱；

图4 7种吡咯里西啶生物碱过不同萃取小柱回收率。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的阐述。

1 仪器与材料

Exion LC超高效液相色谱-联用TRIPLE QUAD 6500

对照品：芝麻菜叶千里光碱的氮氧化物（批号12642）、春千里光碱（批号14139）、春千里光碱氮氧化物（批号14845），均购于PhytoLab GmbH公司。倒千里光碱（批号PF190423-03）、千里光宁碱（批号PF190717-06）、野百合碱（批号RF190526-08），均购于StanfordChemicals公司。千里光菲灵碱（批号DST1908125），购于成都德思特生物技术有限公司，以上对照品纯度均大于98%。MCX混合型阳离子交换固相萃取小柱（美国沃特斯有限公司）。

白背三七样品共5批（编号分别为S1～S5），分别采自广西壮族自治区东兴市，钦州市，北海市，防城港市，柳州市等地，经广西壮族自治区食品药品检验所黄清泉主管中药师鉴定为白背三七的全草。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液

精密称取芝麻菜叶千里光碱的氮氧化物、春千里光碱、春千里光碱氮氧化物、倒千里光碱、千里光菲灵碱、千里光宁碱、野百合碱对照品的适量，分别加甲醇配成质量浓度为10.256、10.368、10.154、9.985、10.280、9.887、10.065μg·mL

2.1.2 供试品溶液

取白背三七粉末（过四号筛）2.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入0.05mol·L

2.2 色谱质谱条件

色谱柱：Agilent Poroshell 120 SB-C18色谱柱（150 mm×3.0 mm，2.7μm）；柱温：40℃；流动相：0.1% 甲酸和5.0mmol·L

2.3方法学考察

2.3.1 线性关系考察和检测限、定量限测定

精密吸取混合对照品溶液0.05、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0mL，置于10mL量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，即得各系列浓度的对照品混合溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，进样。按照 2.2项下的条件进行测定。以对照品的峰面积Y为纵坐标，对应的浓度X为横坐标，进行线性回归。以定量离子的色谱峰信噪比S/N≥3对应的最低浓度为检测限(LOD)，以定量离子色谱峰信噪比S/N≥10对应的最低浓度为定量限(LOQ)，结果见表 2。

2.3.2 精密度试验

精密吸取2.1.1项的混合对照品溶液2μL，连续进样6次，记录峰面积。结果各对照品峰面积的RSD（n=6）为1.6%～2.5%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验

取S1号样品的供试品溶液6份，分别加5.0mL混合对照品溶液，按照“2.1.2”项下方法制备，进样测定。结果各对照品的RSD为2.2%～3.5%，表明该方法的重复性良好。

2.3.4 稳定性试验

取同一份重复性试验的供试品溶液，分别于0、4、8、12、24 h进样测定。结果各对照品峰面积的RSD（n=6）为1.3%～2.6%，表明供试品在24h内稳定。

2.3.5 加样回收试验

取已知含量的S4号样品的粉末6份，每份约1.0 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入“2.1.1”项下的混合对照品溶液1.0mL，按 2.1.2 项下方法平行制备供试品溶液，按2.2 项下条件测定，计算回收率，芝麻菜叶千里光碱的氮氧化物、春千里光碱、春千里光碱氮氧化物、倒千里光碱、千里光菲灵碱、千里光宁碱、野百合碱平均加样回收率分别为90.2%，88.6%，91.4%，89.7%，92.1%，90.8%和 89.3%，RSD 分别为2.0%，2.5%，3.1%，2.6%，3.4%和 2.9%。

2.4 含量测定

准确称取不同产地的白背三七药材2.0 g，分别按照“2.1.2”项方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样测定，依据外标法计算芝麻菜叶千里光碱的氮氧化物、春千里光碱、春千里光碱氮氧化物、倒千里光碱、千里光菲灵碱、千里光宁碱、野百合碱的含量，结果5批样品中均检出倒千里光碱，其余成分尚未检出。数据见表3。

3 含量测定结果分析及风险评估

3.1 含量测定结果分析

5批白背三七中均检出倒千里光碱，其质量分数为158.76～1714.89μg·kg

3.2 风险评估

本研究所测5批白背三七样品中吡咯里西啶生物碱的含量为158.76～1714.89μg·kg

目前世界各国权威机构对吡咯里西啶生物碱的风险评估均采用暴露限制（MOE）计算得出。若MOE＞10000，健康风险较低；反之，风险高。根据文献报道，采用公式（1）～（2）计算白背三七中吡咯里西啶生物碱的MOE，结果见表4。

EDI=C×M/（BW×1000） （1）

MOE=BMDL

式中，EDI为估计每日摄入量（μg·kg

5批白背三七药材的MOE均小于10000，如长期使用，存在一定的用药风险。因此有必要进一步在药材标准中增加PAs限量规定以及服用的风险提示，降低用药风险，保障人民的用药安全。

4 讨论

4.1 色谱柱的选择

本研究考察了Agilent Poroshell 120 SB-C18（150 mm×3.0 mm，2.7μm），WatersACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1mm，1.8μm），Thermo Hypersil GOLD（100 mm×2.1mm，1.9μm）等3种不同型号的色谱柱在相同浓度的标准溶液进行扫描分析，考察其分离效果与保留时间。Waters ACQUITY UPLC HSS T3春千里光碱和千里光宁碱分不开，ThermoHypersil GOLD色谱峰型不够尖锐，Agilent Poroshell 120 SB-C18分离效果最好，能使春千里光碱和千里光宁碱这对同分异构体达到基线分离，且峰型更尖锐对称，响应值高，因此采用Agilent Poroshell 120 SB-C18作为本研究色谱柱。

4.2 流动相的选择

本研究分别考察了甲醇-水，乙腈-水，0.1% 甲酸-乙腈，0.1% 甲酸乙腈-5.0mmol·L

4.3 质谱条件优化

将1μg·mL

4.4 样品前处理方法的选择

4.4.1 提取溶剂的选择

PAs提取一般采用极性较大的溶剂如甲醇或水等，加入少量的酸，可以提高PAs的水溶性。本研究考察了甲醇、甲醇-水、0.05mol·L

4.4.2 固相萃取小柱的选择

采用固相萃取、液-液萃取等方式可以降低背景干扰，提高结果的准确性。本实验选择了C

4.4.3 洗脱溶剂的优化

因被测成分均为生物碱类，在碱性条件下易洗脱，故选择氨化甲醇作为洗脱溶剂。分别考察了2%、5%、10%三种不同浓度的氨化甲醇和5、10、15mL三种不同体积氨化甲醇对被测成分的影响，综合考虑被测成分的洗脱效果等因素，最后选择10mL5%氨化甲醇作为洗脱溶剂，能够达到最佳洗脱效果。

5 小结

本研究建立的UPLC-MS/MS专属性强，可在20 min内快速分析芝麻菜叶千里光碱的氮氧化物、春千里光碱、春千里光碱氮氧化物、倒千里光碱、千里光菲灵碱、千里光宁碱和野百合碱等7个PAs的含量。民间常用白背三七治疗胃病、高血压病、高血脂症及糖尿病等，风险评估显示白背三七存在一定的用药风险，因此有必要建立白背三七中吡咯里西啶生物碱检测方法及加强对白背三七中吡咯里西啶生物碱含量的监管。