一种鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的SSR分子标记引物组及其应用

摘要

本发明提供一种鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的SSR分子标记引物组及其应用。本发明通过研究得到一组能鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的SSR分子标记：PLWZ‑01、PLWZ‑02、PLWZ‑03、PLWZ‑04、PLWZ‑05、PLWZ‑06，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～6所示，该SSR分子标记具有多态性高，但在广西涠洲岛原生群体中多态性低的特点；通过筛选得到用于扩增SSR分子标记的引物组，其扩增稳定、重复性好；同时建立了鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的方法，解决现有豹纹鳃棘鲈地理种群鉴别不清晰，在增殖放流种种苗的原生种亲本难于判别的问题。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术领域。更具体地，涉及一种鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的SSR分子标记引物组及其应用。

背景技术

豹纹鳃棘鲈(Plectropomus Leopardus)，俗名“东星斑”，隶属鲈形目(Perciformes)、鲈亚目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、石斑鱼亚科(Epinephelinae)、鳃棘鲈属(Plectropomus)，属暖水性岛礁海水鱼，主要分布于西太平洋至印度洋海域，是我国重要南方重要的养殖鱼类。豹纹鳃棘鲈肉质鲜嫩、味道鲜美，具有低脂肪、低胆固醇和高蛋白等特点，属高档食用鱼类，深受广大消费者喜爱，市场前景广阔。

涠洲岛位于广西壮族自治区北海市北部湾海域中部，北临广西北海市，东望雷州半岛，东南与斜阳岛毗邻，南与海南岛隔海相望，西面面向越南。涠洲岛地处热带珊瑚分布的北缘，地域特异性使其具有极高的生态价值。涠洲岛珊瑚礁海域的鱼类以鲈形目为主，鲈形目鱼类占采集物种总数的74.56％。其中豹纹鳃棘鲈是涠洲岛其中一种特色鱼类。但随着广西北部湾经济区建设的推进，以及旅游资源和海洋资源开发等人类活动的加剧，导致该海域豹纹鳃棘鲈资源急剧下降。

通过将人工增殖培育的豹纹鳃棘鲈幼苗投放到涠洲岛海域，是一种对天然种群恢复或增加的有效方法。然而，来自不同海域的豹纹鳃棘鲈在色泽、口味、品相各方面都会有差别，将来自其他海区亲本所培育的豹纹鳃棘鲈投放到涠洲岛海域，会对该海域种质资源造成污染。豹纹鳃棘鲈亲本非常难于获得，无法通过野外捕获的方法获得足够的亲本作为增殖放流育苗培育。同时，通过肉眼非常难判断豹纹鳃棘鲈亲本的原生地。目前有研究豹纹鳃棘鲈种群遗传结构和遗传变异采用微卫星分子标记方法，如现有技术公开了一种豹纹鳃棘鲈微卫星DNA分子标记的构建方法，通过设计微卫星标记的特异性引物，开发豹纹鳃棘鲈多态性丰富的微卫星标记，并应用于豹纹鳃棘鲈的种群遗传结构和遗传育种等研究中。但是，该方法只提供和验证了7对引物，而在豹纹鳃棘鲈中能检测到的14649个位点，如果用于不同的种群遗传结构分析验证，则要设计成千上万个特异性引物，操作复杂且费时费力，同时该方法设计得到的微卫星标记引物并不能鉴定和区分豹纹鳃棘鲈原生种。因此，需要建立一种可靠的分子生物学技术，用于鉴定广西涠洲岛的豹纹鳃棘鲈原生种。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的SSR分子标记引物组及其应用，解决现有豹纹鳃棘鲈地理种群鉴别不清晰，在增殖放流种种苗的原生种亲本难于判别的问题。

本发明的第一个目的是提供一种鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的SSR 分子标记。

本发明的第二个目的是提供一种扩增所述SSR分子标记的引物组。

本发明的第三个目的是提供所述SSR分子标记或所述引物组的应用。

本发明的第四个目的是提供一种鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生的检测试剂盒。

本发明第五个目的是提供一种鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的方法。

本发明第六个目的是提供所述鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种方法的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明通过对纹鳃棘鲈基因组(递交号为PRJDB9369，总长为748.23Mb， GC含量为39.5％，scaffold N50长度为30.01Mb，contig N50长度为1.08Mb。) 进行设计得到SSR分子标记，SSR分子标记为PLWZ-01、PLWZ-02、PLWZ-03、 PLWZ-04、PLWZ-05、PLWZ-06，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～6所示。通过对上述SSR分子标记进行验证，表明本发明提供的6个SSR位点具有多态性高，但在广西涠洲岛原生群体中多态性低的特点；同时，筛选得到能用于扩增上述SSR分子标记的引物组：

扩增PLWZ-01的引物序列分别如SEQ ID NO.7～8所示；

扩增PLWZ-02的引物序列分别如SEQ ID NO.9～10所示；

扩增PLWZ-03的引物序列分别如SEQ ID NO.11～12所示；

扩增PLWZ-04的引物序列分别如SEQ ID NO.13～14所示；

扩增PLWZ-05的引物序列分别如SEQ ID NO.15～16所示；

扩增PLWZ-06的引物序列分别如SEQ ID NO.17～18所示。

本发明研究表明，采用上述引物组能够鉴定广西涠洲岛海域豹纹鳃棘鲈原生种，该引物扩增稳定、重复性好；同时建立能鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的方法，能够通过广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的特有等位基因，以及进行 UPGMA聚类分析，构建聚类树，能直接鉴别豹纹鳃棘鲈地理种群是否属于广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种。

因此，本发明提供所述SSR分子标记或所述引物组在鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种或制备鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的检测试剂盒中的应用。

本发明提供一种鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生的检测试剂盒，含有所述 SSR分子标记或所述引物组。

本发明提供一种鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的方法，包括以下步骤：

S1.收集待鉴定豹纹鳃棘鲈群体样本，提取样本DNA；

S2.以步骤S1提取的DNA为模板，分别利用上述引物组进行PCR扩增；

S3.对步骤S2扩增后的PCR产物进行毛细管电泳分型；

S4.对步骤S3获得的分型结果进行峰图判读和构建等位基因矩阵；

S5.通过步骤S4得到的待检测豹纹鳃棘鲈等位基因，并与已知广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的等位基因进行比较，计算样品之间的遗传距离；

S6.对步骤S5得到的遗传距离，进行聚类分析，构建聚类树，并通过聚类树判断待检测豹纹鳃棘鲈是否为涠洲岛原生种。

优选地，步骤S2中PCR扩增的反应体系为：不含Mg

优选地，步骤S2中PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃再延伸6分钟。

优选地，步骤S3中毛细管电泳分型将步骤S2中采用的引物组中的5’端标记FAM荧光基团，并利用ABI 3730XL基因型分型测序仪进行毛细管电泳分型。

优选地，步骤S5中已知广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的等位基因包括：

PLWZ-01位点为：258、261、267；

PLWZ-02位点为：195、279、282、288；

PLWZ-03位点为：238、251、256、279；

PLWZ-04位点为：237、252、255、258；

PLWZ-05位点为：257、272、291；

PLWZ-06位点为：178、199、215、219。

本发明还提供所述方法在鉴别豹纹鳃棘鲈地理种群或鉴别增殖放流种种苗的原生种亲本中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明设计得到一种鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的SSR分子标记： PLWZ-01、PLWZ-02、PLWZ-03、PLWZ-04、PLWZ-05、PLWZ-06，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～6所示，该SSR分子标记具有多态性高，但在广西涠洲岛原生群体中多态性低的特点:，可以有效区分广西涠洲岛海域豹纹鳃棘鲈原生群体与其他群体。还筛选得到能用于扩增上述SSR分子标记的引物组，该引物组扩增稳定、重复性好；同时建立了能鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的方法，通过特有等位基因和聚类树判断待鉴定豹纹鳃棘鲈是否为原生种，解决现有豹纹鳃棘鲈地理种群鉴别不清晰，在增殖放流种种苗的原生种亲本难于判别的问题。

附图说明

图1为173尾豹纹鳃棘鲈的遗传关系图，其中包括来自广西涠洲岛海域 (GX-WZ)的36尾豹纹鳃棘鲈，灰色标记区域表示为广西涠洲原生种分支，豹纹鳃棘鲈来源包括：我国广西涠洲(GX-WZ)、海南东方(HN-DF)、海南三亚(HN-SY)、海南文昌(HN-WC)、广东湛江(GD-ZJ)以及马来西亚(GW-Ma)、印度尼西亚(GW-In)、菲律宾(GW-Ph)、澳大利亚(GW-Au)；

图2为对广西北海海域捕获豹纹鳃棘鲈1尾是否涠洲岛原生种进行鉴定，其中T为检测样品，其余参照样品包括：广西涠洲(GX-WZ)、海南东方(HN-DF)、海南三亚(HN-SY)、海南文昌(HN-WC)、广东湛江(GD-ZJ)。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。引物合成和测序由武汉天一辉远有限公司完成。

实施例1豹纹鳃棘鲈原生种的SSR标记的筛选

在Genbank下载豹纹鳃棘鲈基因组，递交号为PRJDB9369，总长为748.23 Mb，GC含量为39.5％，scaffold N50长度为30.01Mb，contig N50长度为1.08Mb。使用misa软件对SSR序列进行预测，选取3～4个重复单元的SSR，并计算出预期杂合度最高的SSR位点。

其筛选出的SSR位点标记编号为：PLWZ-01、PLWZ-02、PLWZ-03、 PLWZ-04、PLWZ-05、PLWZ-06，均在豹纹鳃棘鲈样本中成功扩增出，具有良好多态性，并能清晰分辨等位基因。

利用primer3软件，对筛选后的SSR批量设计PCR扩增产物长度为200～300 bp的引物。对引物进行过滤，要求自由能大于30(无发夹结构)。使用过滤好的引物，进行基因组Blast比对，挑选出特异性引物，在非SSR区域理论上没有序列扩增出，并且在SSR区域可以扩增出来。对SSR扩增片段选择多态性高、扩增良好稳定、杂合度高、扩增片段大小有差异且具有相同或接近的退火温度 (58～60℃)、GC值控制在50％～60％之间。

其筛选得到的引物如下表1所示，经过PCR扩增检测，PCR反应体系为25 μL，包括：不含Mg

表1SSR标记位点的引物组序列表

经PCR验证结果表明，采用表1中的引物均能在豹纹鳃棘鲈样本中成功扩增，并且条带清晰、扩增稳定、重复性好。

实施例2SSR标记位点多态性的验证

采集来自中国南海、菲律宾、马来西亚、印度尼西亚、澳大利亚海域的豹纹鳃棘鲈合计173尾，具体包括我国广西涠洲(GX-WZ)、海南东方(HN-DF)、海南三亚(HN-SY)、海南文昌(HN-WC)、广东湛江(GD-ZJ)以及马来西亚(GW-Ma)、印度尼西亚(GW-In)、菲律宾(GW-Ph)、澳大利亚(GW-Au)。其中，包括采集自广西涠洲岛海域豹纹鳃棘鲈36尾。采用天根海洋动物组织基因组DNA 提取试剂盒提取豹纹鳃棘鲈样本DNA；以提取的基因组DNA为模板，使用实施例1中表1所示6对引物分别对173个样品进行PCR扩增，其反应体系为25μL，包括：不含Mg

采用PCR扩增的反应程序优选为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒， 60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃再延伸6分钟。

PCR扩增结束后，进行毛细管电泳分型，将表1中6对多态性SSR标记引物的5’端标记FAM荧光基团，并利用ABI 3730XL基因型分型测序仪进行毛细管电泳分型。

对173个样品的毛细管电泳结果使用GeneMarker4.0进行峰图判读和等位基因矩阵构建，使用GenALEx进行遗传距离计算，并使用MEGA6.0以UPGMA 方法进行聚类树构建。结果如图1所示，表明包括采集自广西涠洲36个样品在内的一共39个样品聚在一个进化枝，表明这一支为涠洲岛原生种群。

SSR标记位点多态性的验证结果如下表2所示，表明本发明采用的6个SSR 位点具有多态性高，但在广西涠洲岛原生群体中多态性低的特点。其中，广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种群36个样品的PLWZ-01位点等位基因为258/261/267； PLWZ-02位点等位基因为195/279/282/288；PLWZ-03位点等位基因为 238/251/256/279；PLWZ-04位点等位基因为237/252/255/258；PLWZ-05位点等位基因为257/272/291；PLWZ-06位点等位基因为178/199/215/219。

表2广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种群与其他种群遗传多样性比较

注：N：样品个数、Na：等位基因数、Ne：有效等位基因数、I：香农信息指数、Ho：观测杂合度、He：期望杂合度、F：固定指数、Pop：种群、Mean：平均值、SE：标准误。

实施例3一种鉴定广西涠洲岛海域豹纹鳃棘鲈原生种的方法

采集广东湛江徐闻一个豹纹鳃棘鲈养殖场中的豹纹鳃棘鲈亲鱼5尾，进行编号，取样部位为背鳍或尾鳍，取样时对鱼不造成明显损伤，采用天根海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取豹纹鳃棘鲈样本DNA；以提取的基因组DNA为模板，分别利用实施例1中表所示针对不同SSR标记位点PLWZ-01、PLWZ-02、 PLWZ-03、PLWZ-04、PLWZ-05、PLWZ-06的引物对PLWZ-01-F/R、PLWZ-02-F/R、 PLWZ-03-F/R、PLWZ-04-F/R、PLWZ-05-F/R以及PLWZ-06-F/R进行PCR扩增。

PCR扩增的反应体系为25μL，包括：不含Mg

PCR扩增的反应程序优选为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃再延伸6分钟。

PCR扩增结束后，进行毛细管电泳分型，将表1中6对多态性SSR标记引物的5’端标记FAM荧光基团，并利用ABI 3730XL基因型分型测序仪进行毛细管电泳分型。

将毛细管电泳结果使用GeneMarker4.0进行峰图判读和等位基因矩阵构建，使用GenALEx进行遗传距离计算，并使用MEGA6.0以UPGMA方法进行聚类树构建，对获得的分型结果进行峰图判读。

分型和鉴别结果如下表3所示，与实施例2中广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生群体特有等位基因对比，表明其中1、3号亲鱼为广西涠洲岛原生种，2、4、5号亲鱼非广西涠洲岛原生种。因此，1、3号亲鱼可用作广西涠洲岛人工增殖放流鱼苗培育父母本。

表3徐闻养殖场豹纹鳃棘鲈与涠洲岛原生种SSR位点特征比较

实施例4广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的鉴定

在广西北海海域捕获豹纹鳃棘鲈1尾，未知其种群来源，提取豹纹鳃棘鲈样本DNA，以提取的基因组DNA为模板，分别利用实施例1中表所示针对不同 SSR标记位点PLWZ-01、PLWZ-02、PLWZ-03、PLWZ-04、PLWZ-05、PLWZ-06 的引物对PLWZ-01-F/R、PLWZ-02-F/R、PLWZ-03-F/R、PLWZ-04-F/R、PLWZ-05-F/R以及PLWZ-06-F/R进行PCR扩增。

PCR扩增的反应体系为25μL，包括：不含Mg

PCR扩增的反应程序优选为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃再延伸6分钟。

PCR扩增结束后，进行毛细管电泳分型，将表1中6对多态性SSR标记引物的5’端标记FAM荧光基团，并利用ABI 3730XL基因型分型测序仪进行毛细管电泳分型，与已知种群来源的广西涠洲岛样品5尾、广东湛江样品5尾、海南文昌样品10尾、海南东方样品5尾、海南三亚样品5尾、海南文昌样品5尾数据合并分析，使用GenALEx进行遗传距离计算，并使用MEGA6.0以UPGMA 方法进行聚类树构建，对获得的分型结果进行峰图判读。

其结果如图2所示，该豹纹鳃棘鲈样品与广西涠洲岛样品聚类，鉴定该样品为广西涠洲岛原生种。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东海洋大学

中国科学院南海海洋研究所

<120> 一种鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的SSR分子标记引物组及其应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 300

<212> DNA

<213> PLWZ-01(SIPOSequenceListing 1.0)

<400> 1

gctgaccggt gagtctcaac ttttgttctc aacttttatt tatttattta taataataat 60

aataataata ataataataa taataataat aataataata ataataataa taataataat 120

aataattgtg aataattaat ttacataaca ataataataa atattattat tattaattaa 180

tgtattaatg ttgtttggtg actacactaa agtttaaagt ctcagttcgg gttataaagg 240

ttgttttttt gtttttctca cagcggtcag gccgtggccg ccatcatctt cgtgctcggt 300

<210> 2

<211> 233

<212> DNA

<213> PLWZ-02(SIPOSequenceListing 1.0)

<400> 2

gtgctttgct cagcttgctt accccacaac ccgactccgg caaagtggat gaaatggatg 60

gctggatgga tggatggata aaaataataa taataataat aataataata ataataataa 120

taataataat aataataata ataataataa taataataag catacacagt tagaaagtac 180

acactcacac tcacacaccc aagtaacgat aagtgtgtcc ctgagcaaag gtc 233

<210> 3

<211> 258

<212> DNA

<213> PLWZ-03(SIPOSequenceListing 1.0)

<400> 3

gctgtgtttg agcaaagcca aaataaaatt tccactgagc tggacaataa agtctatcta 60

tctatctatc tatctatcta tctatctaat aacaataata ataataataa taataataat 120

aataataata ataataataa taataataat aataataata ataataatag taataataat 180

gatgataata ataataataa taataataat aataataata aattctattt attagcgcct 240

ttccggacac cagaggtc 258

<210> 4

<211> 288

<212> DNA

<213> PLWZ-04(SIPOSequenceListing 1.0)

<400> 4

ggtgaccttg agtgtcctga aaggtgccaa taaataacat tttataataa taataataat 60

aataataata ataataataa taataataat aataataatt attattatta ttattattgt 120

tgttgttgtt gttgttattg ttgttattgt taatattatt attattatta ttattattat 180

tattattatt attattatta ttattattat tattattata aatagggata caatgaaggt 240

atattggttt gcatgataat aattgacagt gtgtacaaca gctggagc 288

<210> 5

<211> 296

<212> DNA

<213> PLWZ-05(SIPOSequenceListing 1.0)

<400> 5

tggctttggc tcaaatgaca tttttctaca gctaatgaac tgatgcacct gcaatgctaa 60

taataataat aataataata ataataataa taataataat aataataata ataataataa 120

taataataat aataataata ataacaacaa taaagttgtt tctttttttt taaaaaagtc 180

cagttgctat ttatatttcg ttaaccacaa tgttgtgggg ttttttcttt taccacaaat 240

agaaagaaga ttcagaattt tacttccctc atttattccc tgtcagtttc cttcca 296

<210> 6

<211> 217

<212> DNA

<213> PLWZ-06(SIPOSequenceListing 1.0)

<400> 6

gccctacatt ctcatcgcag agttaataaa ttgcatatta ttattattat tattattatt 60

attattatta ttattattat tattattatt attattatta tctctgacat gaagactggg 120

cagctgaaac ccgatctctg tcaacccaaa catttccaag gcatttgttt ttctggatag 180

tatttgattt ccccacattc cctgaacgta gcagcag 217

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> PLWZ-01-F(SIPOSequenceListing 1.0)

<400> 7

gctgaccggt gagtctcaac 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> PLWZ-01-R(SIPOSequenceListing 1.0)

<400> 8

accgagcacg aagatgatgg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> PLWZ-02-F(SIPOSequenceListing 1.0)

<400> 9

gtgctttgct cagcttgctt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> PLWZ-02-R(SIPOSequenceListing 1.0)

<400> 10

gacctttgct cagggacaca 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> PLWZ-03-F(SIPOSequenceListing 1.0)

<400> 11

gctgtgtttg agcaaagcca 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> PLWZ-03-R(SIPOSequenceListing 1.0)

<400> 12

gacctctggt gtccggaaag 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> PLWZ-04-F(SIPOSequenceListing 1.0)

<400> 13

gcattgagca tcctggcaag 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> PLWZ-04-R(SIPOSequenceListing 1.0)

<400> 14

cagatcagga cagcactccg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> PLWZ-05-F(SIPOSequenceListing 1.0)

<400> 15

tggctttggc tcaaatgaca 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> PLWZ-05-R(SIPOSequenceListing 1.0)

<400> 16

tggaaggaaa ctgacaggga 20

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> PLWZ-06-F(SIPOSequenceListing 1.0)

<400> 17

gccctacatt ctcatcgcag a 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> PLWZ-06-R(SIPOSequenceListing 1.0)

<400> 18

ctgctgctac gttcagggaa 20