通过在用去酸甲醛制备的缓冲福尔马林中固定组织来保存核酸序列

摘要

本发明涉及在组织学组织中保存核酸序列的方法，其包括：用碱性离子交换树脂在水中处理浓缩的甲醛溶液；用pH 7.2‑7.4的磷酸盐缓冲液将获得的去酸甲醛溶液稀释至达2‑4％之间的浓度范围；将由此获得的去酸甲醛溶液与组织样本接触；任选地将固定的样本包埋入石蜡中。

说明书

本发明旨在提出一种设计用于提高用福尔马林固定的有机组织样本的遗传完整性的方法。

现有技术

目前，组织学组织的保存和固定是通过浸入含有甲醛的水溶液中进行的，特别是在水中含有4％甲醛的溶液中进行的，该溶液称为福尔马林。福尔马林的应用非常广泛，不仅用于皮革和生皮的固定，而且在医学领域，用于组织运输、保存(例如在博物馆中)以及在包埋入石蜡、解剖和组织学制备物染色之前必须的固定、用于诊断前的显微镜检查目的(Fox等人,1985)。近来，福尔马林固定且石蜡包埋的(Formalin-Fixed Paraffin-Embedded＝FFPE)活组织检查材料不仅在形态学、苏木精-伊红染色切片和使用免疫组织化学分析上进行了研究，而且还通过分子生物学分析和基因测序进行了研究。确定遗传肿瘤改变以促进治疗选择和预后。因此，在常规临床实践中，靶向测序分析是使用福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPE)进行的。然而，成功的遗传分析仍然困难，因为FFPE活组织检查的DNA在样本制备过程中倾向于片段化。

定期制备福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)组织并用于各种疾病的病理诊断，且大量存档的FFPE组织在病理科室保存和存档(根据意大利法律，组织必须保存至少10-20年，因为可能潜在地需要对患者有用的进一步分析)。 FFPE组织可以容易地在室温长时间储存并进行回顾性分析。虽然福尔马林是一种广泛使用的固定试剂，但它对DNA的完整性有不利影响，并产生 DNA-DNA和/或DNA-蛋白质交联、核苷酸转换和DNA片段化。所述影响可以干扰样本的后续分析，例如下一代测序(NGS)技术。尽管测序也可以用于分析DNA片段，并且已经设计出技术来确定所述片段上是否存在突变，但严重片段化的DNA不能用于制备NGS文库(Amemia等人，2019)。最近，经常对从FFPE组织中提取的DNA进行NGS分析。这些遗传方法阐明了包括肿瘤在内的多种疾病的新分子亚型，并通过建立精确技术改变了临床实践。

大量FFPE组织已储存在全球的诊所、医院和学术机构的档案中。然而，从FFPE组织中提取的DNA通常是片段化的，并表现出胞嘧啶到胸苷的转变和交联修饰。所述变化主要取决于固定时间、福尔马林试剂浓度和储存条件。来自低质量(片段化的)FFPE的DNA不适合进行基因分析，并且可以产生人为构造。许多研究已经检查了DNA质量和由此产生的NGS分析成功率如何受所用固定试剂类型和固定时间的影响。FFPE组织的DNA和RNA的质量(即，片段化程度)主要由在福尔马林中的固定决定，且对于石蜡包埋样本的固定，中性缓冲的福尔马林(PBF)优于酸性福尔马林，从而获得靶向分析测序的高成功率。例如，已知与储存时间相关的pH变化会导致福尔马林氧化为甲酸，从而引起含氮碱基的改变和序列断裂(Groelz等人,2013)。在储存4-6年后，还观察到从同一FFPE块中提取的DNA显著降解。因此，应考虑保存FFPE活组织检查样本的更好存储策略(Guyard等人,2017)。

从存档组织中获得高质量mRNA的可能性可能为比目前可行的更广泛的基因表达谱分析铺平道路(Sccchitano等人,2006；Abramovitz等人,2008)，并使个体恶性肿瘤的临床行为和治疗反应的预测成为可能，从而使定制化治疗成为可能。目前，这种方法需要收获冷冻样本，这是一个并不总是可行的繁琐程序。使用FFPE组织进行基因表达谱分析将使这种分子方法的广泛使用成为可能和容易进行，即使存档组织在石蜡中长期保存也是如此。

在具有0.1M磷酸盐缓冲液pH 7.2的水中的4％甲醛(福尔马林)中处理组织(活组织检查和用于组织病理学诊断的手术样本)是已知的。全世界已有数百万个标本以这种方式处理。这种固定通常通过将组织样本在福尔马林中浸泡数小时至24小时的期间来进行。这通常在室温进行。已报道了使用冷福尔马林处理，这引起更好地保存DNA和RNA(Bussolati等，2011)。近年来，核酸测序对来自福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPE)的需求大大增加，因为利用庞大的组织存档将包括评估基因表达谱，目的是产生新的和可靠的诊断和预后参数，尤其是对癌症产生新的和可靠的诊断和预后参数(Madeiros 等人,2007；Lewis等人,2001)。已经对FFPE组织中核酸的保存状态进行了大量研究，但人们基本上普遍认为RNA被强烈降解和片段化，因此只有相当短的序列(大约100-200个核苷酸)可以被识别和放大(Chung等人,2006；Dotti, 2010；van Maldeghem,2008；Paska,2004；Masuda)。这种影响的原因目前尚不清楚。为建立个体患者病理病变的预后和治疗前景对基因表达谱分析的需求迫在眉睫，因为前景非常有希望，尤其是在乳腺癌、肺癌和结肠癌中。目前，唯一可能的方法是收获(在组织库中的)冷冻样本并储存所述材料，以便对其进行加工用于基因表达分析。已经观察到，如通常推荐和实践的那样，在室温浸泡在福尔马林中24小时或至少几个小时(Goldstein等人,2003: Goldstein等人,2007)导致最佳的形态和抗原保存；因此，将FFPE组织也用于基因测序将开辟巨大的前景，并允许利用全球现有的庞大存档(参见Chen等人，2007；Scicchitano等人,2006；Abramovitz等人,2008)。基因测序技术，如从组织中获得的DNA微阵列和二维凝胶电泳，已成功地用于提供与特定病理疾病相关的基因、蛋白质、代谢物和其他分子特征的信息。通过筛选存档组织样本，即FFPV组织，已在人类肿瘤中鉴定出几种新基因及其产物。在某些临床条件下最常需要进行诊断性分子检测，例如早期皮肤淋巴瘤中的T或 B细胞的克隆性检测，且可以预计对分子病理学检测的检查以达到明确的临床诊断的需求将来会增加(Srinivasan等人,2002).

由于核酸的保存是保证它们的分子检测有效性的必要条件，因此活组织检查样本的固定和保存条件是关键因素。因此醛固定剂的特性至关重要。酸固定剂，如甲酸的存在，引起DNA和RNA链的片段化(Koshiba等人,1993； Srinivasan等人,2002)。因此，目前建议应将组织固定在4％甲醛溶液中，该溶液是通过在pH 7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中以1:10稀释40％饱和的商业甲醛获得的(磷酸盐缓冲的福尔马林＝PBF)。商业40％甲醛溶液是强酸的(pH 2-3)，因为存在甲酸(Fox等人,1985)，其是核酸片段化的原因(Srinivasan等人,2002)。

在一些商业制品中，将碳酸钙添加到40％的甲醛溶液中。甲酸存在于PBF 溶液中，但注定会被中和为甲酸钠的形式。

发明描述

因此，本发明的目的是提出一种方法，该方法是设计为旨在提高用福尔马林固定的有机组织样本的遗传完整性，因为如上所述，目前使用的用PFB 固定产生令人失望的结果。

现在已经发现，当商业甲醛溶液使用离子交换树脂去除酸时，由此消除了甲酸钠的形成；在所得的无酸试剂(酸去除的磷酸盐缓冲的福尔马林＝ AD-PBF)中固定与使用商业的磷酸盐缓冲的福尔马林固定组织(PBF)的情况相比，引起更好地保存核酸，尤其是DNA，并降低片段化。该改善是非常显著的，使得AD-PBF固定的石蜡包埋组织长期保存。

因此，本发明的主题是组织学组织和细胞学样本中的核酸序列的保存方法，包括：

a.用碱性离子交换树脂在水中处理浓缩的甲醛溶液；

b.用pH 7.2-7.4的磷酸盐缓冲液将获自步骤a)的去酸甲醛溶液稀释至2 －4％之间的浓度范围，优选地稀释至4％的浓度；

c.将获自步骤b)的去酸甲醛溶液与组织样本接触；

d.任选地将来自步骤c)的固定样本包埋入石蜡中。

步骤a)中使用的浓缩甲醛溶液是商业可获得的，其具有30-40重量％之间的浓度范围。

任何能够中和甲醛溶液中存在的酸并防止酸形成的碱性树脂都可以用作离子交换树脂。适用于所述目的的树脂的一个实例是Amberlyst

组织学和细胞学样本通常用去酸甲醛溶液处理3到72小时之间的时间范围。

以下实施例更详细地说明了本发明。

实施例1

商业上(米兰，Sigma-Aldrich；米兰，Carlo Erba)获得40％甲醛溶液。所述溶液的pH范围在2.6和2.9之间。将一种碱性离子交换树脂Amberlyst树脂A21(米兰，DowChemicals)用H

将新鲜的人组织(肾、肝、结肠、结肠癌和乳腺癌)用于固定，所述新鲜的人组织由于对诊断需求是多余的，因此注定是要处理掉的。将组织碎片的相邻部分固定在AD-PBF(见上文)和商业缓冲的福尔马林(DiaPath, Bergamo)中。将组织在室温保持在它们各自的固定剂中20小时，然后加工以包埋入石蜡(Leica包埋装置：Leica ASP 300S)。

切割石蜡包埋的组织块以获得用苏木精-伊红染色的切片。对于DNA和 RNA的提取、定量和质量评估，从在AD-PBF和PBF中平行固定的10个组织(见上文)的石蜡包埋组织块中获得9个切片(厚度5μm)。将切片用1ml 二甲苯脱石蜡。在56℃与蛋白酶K孵育过夜后，根据制造商的方案，使用MagCore自动提取仪(RBC Bioscience，中国台湾)上的MagCoreGenomic DNA FFPE试剂盒从五个切片分离DNA。使用剩余的四个切片，根据制造商的方案，使用对FFPE的RecoverAll总核酸分离试剂盒(ThermoFisher Scientific, USA)获得RNA。DNA和RNA提取物均通过Qubit荧光计(Invitrogen， Carlsbad，CA，USA)和NanoDrop分光光度计(ThermoFisher Scientific)上的Qubit BR测定法进行定量。使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies，USA)评估DNA和RNA的完整性。

使用高灵敏性DNA分析试剂盒(Agilent Technologies，Santa Clara，CA) 在DNAHS芯片上评估DNA完整性。将样本稀释至2ng/μL，并根据制造商的说明书进行DNA长度分析。使用5000nt作为最长DNA片段(>5000nt)的阈值，评估AD-PBF和PBF样本的DNA片段的平均大小。它们相对于所述阈值的分布用卡方检验进行统计学比较。

使用Agilent RNA 6000nano试剂盒评估RNA完整性。使用阈值为200nt 的涂片分析(smear analysis)，自Agilent 2100生物分析仪的读数计算DNA 片段的大小分布；记录大小>200nt的(DV200度量的)DNA片段的百分比。

图1比较了从固定在PBF或AD-PBF中的组织提取的DNA。从相同的结肠癌(左)和乳腺癌(右)样本平行获得的活组织检查样本被固定在PBF或 AD-PBF中，并用Agilent生物分析仪分析提取的DNA。该图像显示了按降序可获得的DNA片段的大小(颜色强度标度如侧栏中所示)。在用AD-PBF 固定的活组织检查样本中明显存在大尺寸的DNA，因此较少片段化。

如图1所示，在固定于PBF中的组织中，可获得的绝大多数DNA片段的大小(与文献中描述的发现类似)的范围在1000到5000bp之间，表明强烈的片段化。相反地，在AD-PBF中并因此从固定液中去除酸基团的固定产生的片段保存得更好，高达20000bp。

实施例2

在AD-PBF中固定组织，平行地在PBF中固定组织，并包埋在石蜡中，在室温保存12个月，然后重复实施例1的分析程序。

用Agilent生物分析仪分析从组织中提取的DNA。

图2显示了从固定在PBF或AD-PBF中、包埋在石蜡中并储存一年的相同结肠癌样本中提取的DNA。使用Agilent生物分析仪分析该提取的DNA。曲线显示随着大小的增加可获得的DNA片段的大小。显然，用AD-PBF(B) 固定的活组织检查样本中存在比用PBF(A)固定的活组织检查样本更长的 DNA片段这一事实。

实施例3

为了检查在磷酸盐缓冲的福尔马林和在AD福尔马林中备选固定的组织中核酸、特别是DNA的保存情况，对27例人类癌症(结肠癌、乳腺癌和肺癌)进行了研究。从组织中采集新鲜标本(大约大小：1x 2x 0.3cm)并平行固定在用0.1M磷酸盐缓冲液pH 7.2缓冲的去酸(A-D)福尔马林中和在来自商业的磷酸盐缓冲福尔马林(PBF)中(Roti-Histofix 4.5％无酸(pH 7)磷酸盐缓冲的甲醛溶液；意大利米兰Prodotti Gianni)。将标本在室温浸入备选的固定液中 24小时，然后常规加工以进行石蜡包埋。

加工来自石蜡块(paraffin block)的切片(10个切片，5微米厚)用于 DNA提取，然后分析以评估片段的大小，在每种情况下匹配碱基对片段的大小。直接比较用线条表示(匹配大小vs.频率)并使用科摩哥洛夫-史密诺夫 (Kolmogorv-smirnoff)检验来评估线条趋势，或者备选地用表征在3个不同的碱基对片段家族(0-5000、5000-20000、>20000)的箱线图(见图3-5)来表示。数据采用配对检验进行统计分析。

结果清楚地表明，在PBF中的组织固定导致DNA的更高片段化，因为在AD福尔马林中固定的组织中存在更多数量超过5000bp长的片段。数据表明，在AD福尔马林中固定的组织更适合对肿瘤组织进行成功的DNA分析，允许更准确地定义治疗诊断(theragnostic)特征。

参考文献

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