Tobramycin在制备抑制剂或治疗震颤/共济失调综合征的药物中的应用

摘要

本发明涉及Tobramycin在制备抑制剂或治疗震颤/共济失调综合征的药物中的应用。本发明利用果蝇模型筛选到的小分子化合物Tobramycin，通过下调HIF‑1α的蛋白质水平，能够有效拯救脆性X相关的震颤/共济失调综合征果蝇的神经变性，减少色素生成阻滞、细胞死亡和小眼融合，并改善运动缺陷，且在给药过程中未显示明显的毒性。本发明为治疗脆性X相关的震颤/共济失调综合征提供了新的药效物质和作用靶点，扩宽了Tobramycin在医药上的用途。本发明在为脆性X相关的震颤/共济失调综合征治疗提供了一种具有临床应用前景的新型药物。

说明书

技术领域

本发明涉及Tobramycin在制备抑制剂或治疗震颤/共济失调综合征的药物中的应用，属于生物医药领域。

背景技术

脆性X相关的震颤/共济失调综合征(Fragile X associated tremor/ataxiasyndrome,FXTAS)的主要临床表现为目的性的震颤和共济失调，伴随着外周神经病变，植物神经功能紊乱，以及记忆和执行功能缺欠的渐进性认知水平下降。在精神方面主要表现为焦虑、冷漠、抑郁、逃避社交活动等。主要是由于FMR1基因的5’端非翻译区的CGG重复数的多态引起的，当CGG重复数目在55到200之间即前突变，脆性X前突变男性携带者大约有30-40％会在五十岁以后渐进性的发展成脆性X相关的震颤/共济失调综合征，有些女性携带者也会患病。

Neddylation是一种类泛素化蛋白翻译后修饰方式，能够激活Cullin家族E3连接酶活性，影响底物蛋白的稳定性、构象和功能等，调控诸多生物学过程。Neddylation通路已知底物包括Cullins、p53、p73、Mdm2、pVHL、BCA3和核糖体蛋白等。在脆性X相关的震颤/共济失调综合征果蝇模型中存在Neddylation通路水平降低这一现象，引起底物Cul3和Cul2-Vhl的Neddylation修饰水平下降，对HIF-1α的抑制效果减弱，从而导致HIF-1α异常升高。HIF-1α是低氧诱导因子，在低氧情况下，HIF-1α表达上调，稳定性增加，诱导线粒体活性氧产生。在正常情况下，HIF-1α的异常激活也会导致线粒体功能损伤。HIF-1α是诱导脆性X相关的震颤/共济失调综合征发病过程中的关键靶点。寻找或开发一种小分子化合物可以在脆性X相关的震颤/共济失调综合征果蝇模型中有效地抑制HIF-1α异常表达，具有重要实际意义。

Tobramycin(妥布霉素，又称：乃柏欣、托普霉素、妥布接霉素)，是一种氨基糖苷类抗生素，其化学结构式如下，其分子式为C

目前未有该化合物可以抑制HIF-1α，并拯救脆性X相关的震颤/共济失调综合征表型的相关报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供Tobramycin在制备HIF-1α抑制剂或治疗和/或预防脆性X相关的震颤/共济失调综合征的药物中的应用，以期帮助克服当前缺乏有效治疗药物治疗和/或预防脆性X相关的震颤/共济失调综合征的问题。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

Tobramycin在制备治疗和/或预防脆性X相关的震颤/共济失调综合征的药物中的应用。

进一步地，Tobramycin通过调节Neddylation通路缺陷来治疗脆性X相关的震颤/共济失调综合征。

可选地，以Tobramycin作为有效成分或任选与其他治疗和/或预防脆性X相关的震颤/共济失调综合征的药物联合使用。

进一步地，所述的脆性X相关的震颤/共济失调综合征表现为果蝇感光神经细胞色素生成阻滞、细胞死亡和/或小眼融合。

进一步地，所述的脆性X相关的震颤/共济失调综合征表现为果蝇运动速度和运动频率缺陷，寿命缩短。

基于同一发明构思，本发明还提供：Tobramycin在制备HIF-1α抑制剂中的应用。

本发明公开了一种小分子化合物Tobramycin在制备治疗和/或预防脆性X相关的震颤/共济失调综合征药物中的应用，本发明首次提出在脆性X相关的震颤/共济失调综合征果蝇模型中，Tobramycin能显著下调HIF-1α的蛋白水平，从而缓解由于Neddylation水平下降导致的神经变性。给药过程中对野生型果蝇未显示明显的毒性，同时Tobramycin为FDA认证小分子化合物，容易通过血脑屏障到达脑部发挥作用。因此，Tobramycin可被制作成一种新的脆性X相关的震颤/共济失调综合征治疗药物，拥有很好的临床治疗应用前景。

本发明使用小分子化合物Tobramycin配置成药物培养基，饲养HIF-1α过表达果蝇与脆性X相关的震颤/共济失调综合征果蝇模型。发现Tobramycin可以抑制HIF-1α过表达果蝇与脆性X相关的震颤/共济失调综合征果蝇的HIF-1α蛋白水平，可以用作HIF-1α的有效抑制剂。通过HIF-1α的小分子化合物抑制剂抑制神经变性，改善运动缺陷，用于治疗脆性X相关的震颤/共济失调综合征。

本发明的有益效果在于：本发明利用果蝇模型筛选到的小分子化合物Tobramycin，通过下调HIF-1α的蛋白质水平，能够有效拯救脆性X相关的震颤/共济失调综合征果蝇的神经变性，减少色素生成阻滞、细胞死亡和小眼融合，并改善运动缺陷，且在给药过程中未显示明显的毒性。本发明为治疗脆性X相关的震颤/共济失调综合征提供了新的药效物质和作用靶点，扩宽了Tobramycin在医药上的用途。本发明在为脆性X相关的震颤/共济失调综合征治疗提供了一种具有临床应用前景的新型药物。

附图说明

图1为是HIF-1α过表达果蝇中，Tobramycin对HIF-1α的影响的Western Blot结果图。

图2是Tobramycin影响HIF-1α过表达果蝇复眼的神经变性情况图。

图3为是脆性X相关的震颤/共济失调综合征果蝇模型中，Tobramycin对HIF-1α的影响的Western Blot结果图。

图4是Tobramycin影响脆性X相关的震颤/共济失调综合征果蝇复眼的神经变性情况图。

图5是Tobramycin影响脆性X相关的震颤/共济失调综合征果蝇的运动情况图，其中，图5A为Nrv2组和Nrv2>CGG

图6是Tobramycin影响脆性X相关的震颤/共济失调综合征果蝇的寿命情况图。

具体实施方式

以下将结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

果蝇品系：

elav-GAL4工具果蝇、GMR-GAL4工具果蝇、Nrv2-GAL4工具果蝇和DA-GAL4工具果蝇与HIF-1α过表达果蝇购自美国Bloomington Drosophila Stock Center。

脆性X相关的震颤/共济失调综合征果蝇模型：提取脆性X相关的震颤/共济失调综合征患者淋巴细胞DNA，通过高GC-PCR扩增CGG

果蝇使用根据中国科学院标准配方制备的玉米粉-酵母培养基喂养，在25℃的恒温条件下培养和杂交。

杂交方案：

收集羽化8小时内的相应GAL4工具果蝇(雌蝇[处女蝇])，与HIF-1α过表达雄蝇或CGG

实验试剂：

药物培养基制备：取500μL玉米粉-酵母培养基，1μL药物(药物中Tobramycin的浓度为10mM，溶剂为DMSO)，2μL苹果绿色素(用于指示药物是否混匀)加至5mL离心管中，涡旋混匀器混匀，冷却后4℃保存。药物终浓度为20μM。

非药物培养基制备：取500μL玉米粉-酵母培养基，1μLDMSO，2μL苹果绿色素(指示药物是否混匀)加至5mL离心管中，涡旋混匀器混匀，冷却后4℃保存。

DMSO购买自Sigma-Aldrich公司，货号D2438。

HIF-1α抗体(一抗)购买自Sigma-Aldrich公司，货号PLA0081。

α-Tubulin抗体(内参)购买自Abcam公司，货号ab18251。

HRP抗兔二抗购买自Abcam，货号ab6721。

SDS裂解液购买自碧云天公司，货号P0013G。

BCA蛋白定量试剂盒购买自Thermo Fisher Scientific公司，货号23225。

ECL化学发光试剂盒购买自Abbkine公司，货号BMU101-CN。

仪器设备如表1所示：

表1

实施例1：HIF-1α过表达果蝇通过Western Blot(蛋白质印迹法)筛选抑制剂

elav组：在所述非药物培养基饲养elav-GAL4工具果蝇；

elav+Tobramycin组：在所述药物培养基饲养elav-GAL4工具果蝇；

elav>HIF-1α组：在所述非药物培养基饲养elav>HIF-1α在神经系统过表达HIF-1α的果蝇(通过上述杂交方案获得，下同)；

elav>HIF-1α+Tobramycin组：在所述药物培养基饲养elav>HIF-1α在神经系统过表达HIF-1α的果蝇。

采用SDS蛋白裂解液提取相应果蝇脑部总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒定量，取20ug蛋白上清液经SDS-PAGE、转膜和封闭后进行抗体孵育。其中，一抗HIF-1α抗体和α-Tubulin抗体(内参)的稀释浓度分别为1:2500和1:10000；HRP抗兔二抗稀释浓度为1:10000。蛋白条带经ECL化学发光试剂盒发光，Bio-Rad多功能成像分析仪采集图像。

如图1所示，Western Blot检测发现Tobramycin可以抑制HIF-1α过表达果蝇的HIF-1α蛋白水平，为HIF-1α的有效抑制剂。

实施例2：Tobramycin对HIF-1α过表达果蝇复眼表型的影响

GMR组：在所述非药物培养基饲养GMR-GAL4工具果蝇，收集雄性果蝇，于CO

GMR+Tobramycin组：在所述药物培养基饲养GMR-GAL4工具果蝇，收集雄性果蝇，于CO

GMR>HIF-1α组：在所述非药物培养基饲养GMR>HIF-1α过表达果蝇(通过上述杂交方案获得，下同)，收集雄性果蝇，于CO

GMR>HIF-1α+Tobramycin组：在所述药物培养基饲养GMR>HIF-1α过表达果蝇，收集雄性果蝇，于CO

如图2所示，在GMR>HIF-1α过表达果蝇模型中，Tobramycin可减少复眼的色素生成阻滞和小眼融合，有效缓解神经退行性表型。而Tobramycin对正常果蝇无影响。

实施例3：Tobramycin在脆性X相关的震颤/共济失调综合征果蝇模型中对HIF-1α的影响

在果蝇中过表达人FMR1基因5’UTR中的CGG100在果蝇中诱导出一系列神经退行性症状，能够模拟脆性X相关的震颤/共济失调综合征患者临床表现。

elav组：在所述非药物培养基饲养elav-GAL4工具果蝇；

elav>CGG100组：在所述非药物培养基饲养elav>CGG100果蝇(通过上述杂交方案获得，下同)；

elav>CGG100+Tobramycin组：在所述药物培养基饲养elav>CGG100果蝇(通过上述杂交方案获得，下同)。

采用实施例1方法，分别提取elav，elav>CGG100，elav>CGG100+Tobramycin组果蝇的脑部总蛋白进行Western Blot，结果如图3所示，在elav>CGG100果蝇中HIF-1α的表达量显著升高，Tobramycin饲养elav>CGG100果蝇抑制HIF-1α异常升高。

实施例4：Tobramycin对脆性X相关的震颤/共济失调综合征果蝇复眼感光神经元神经变性的影响

GMR组：在所述非药物培养基饲养GMR-GAL4工具果蝇，收集雄性果蝇。

GMR>CGG100组：在所述非药物培养基饲养GMR>CGG100果蝇(通过上述杂交方案获得，下同)，收集雄性果蝇。

GMR>CGG100+Tobramycin组：在所述药物培养基饲养GMR>CGG100果蝇，收集雄性果蝇。

采用实施例2方法，分别观察GMR，GMR>CGG100，GMR>CGG100+Tobramycin果蝇复眼表型，结果如图4所示，Tobramycin明显拯救脆性X相关的震颤/共济失调综合征果蝇的视网膜变性，有效恢复色素生成，减少细胞坏死。

实施例5：Tobramycin对脆性X相关的震颤/共济失调综合征果蝇运动活性的影响

在果蝇运动能力检测系统中放入相应果蝇后，由系统自动监测果蝇活动行为，用于果蝇运动能力、活跃频率以及昼夜节律的检测。具体地，收集羽化第20天目的基因型子代雄性果蝇(n≥30)，每支装有20μM药物培养基或非药物培养基的玻璃小管中装入1只果蝇，通过果蝇运动能力检测系统监测运动能力，每30min记录一次运动数据，从羽化后第20天监测至第26天及以后。其中，目的基因型包括Nrv2-GAL4型和Nrv2>CGG100过表达型(通过上述杂交方案获得，下同)，分为三组，即：Nrv2组(用非药物培养基培养)、Nrv2>CGG100过表达组(用非药物培养基培养)、Nrv2>CGG100过表达+Tobramycin组(用药物培养基培养)，每组进行三次以上重复实验。

如图5所示，Tobramycin可显著改善Nrv2>CGG100在神经系统表达CGG100导致的爬行障碍。

实施例6：Tobramycin对脆性X相关的震颤/共济失调综合征果蝇寿命的影响

收集羽化1天内的目的基因型雄性果蝇(n≥100)，每20只放入一培养管。在25℃、相对湿度50-70％的环境下培养，每3天更换一次培养基，每天定时记录果蝇死亡数量直至全部死亡。

其中，目的基因型包括DA-GAL4型和DA>CGG100过表达型(通过上述杂交方案获得，下同)，分为三组，即：DA组(用非药物培养基培养)、DA>CGG100过表达组(用非药物培养基培养)、DA>CGG100过表达+Tobramycin组(用药物培养基培养)，每组进行三次以上重复实验。

如图6所示，Tobramycin可显著拯救DA>CGG100在全身广泛表达CGG100导致的寿命缩短。

从上述实施例中可以看出，本发明提供小分子药物Tobramycin作为用于制备治疗或预防脆性X相关的震颤/共济失调综合征的药物中的用途。

上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落入本申请所附权利要求所限定的范围。