一种凡纳滨对虾溶质转运基因LvSLC5A8及其编码蛋白和应用

摘要

本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种凡纳滨对虾溶质转运基因LvSLC5A8及其编码蛋白，还公开了其抑制白斑综合征病毒(WSSV)感染的应用；凡纳滨对虾LvSLC5A8基因的核苷酸序列为SEQIDNO:1所示的序列，其编码蛋白的氨基酸序列是SEQIDNO:2中所示的序列，实验证明WSSV感染能抑制LvSLC5A8基因的表达；而干扰WSSV极早期基因WSV056后，病毒对LvSLC5A8转录抑制作用显著降低；制备LvSLC5A8重组蛋白rLvSLC5A8注射对虾，能降低WSSV病毒在对虾体内的复制水平；而WSSV能够抑制对虾LvSLC5A8以逃逸宿主抗病毒免疫反应。重组蛋白rLvSLC5A8可以用于增强对虾的免疫力，在白斑综合征病毒的防治上有较大的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种凡纳滨对虾溶质转运基因SLC5A8及其编码蛋白和其在抗白斑综合征病毒(WSSV)方面的应用。

背景技术

白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)是一种双链DNA病毒，严重危害以对虾为主的多种经济甲壳动物养殖产业，是2017年农业部规定的国家水生动物疫病监测计划的重要监测对象之一，目前尚无有效的治疗手段；现阶段抗生素等传统药物的使用仍然是控制病害的主要手段，但是长期使用抗生素药物不仅造成细菌耐药株的出现频率不断增加，还造成了养殖环境恶化和沿海环境污染。抗生素等药物残留不仅损害国民健康，也严重影响水产品的出口创汇。因此，深入了解病毒入侵宿主的途径和宿主免疫系统的互作方式，增强养殖动物的抗病毒能力，研发安全、高效的病害防治手段已经成为海水养殖业可持续发展的重要突破方向。

针对上述问题，本申请人在前期研究中利用转基因果蝇系分析WSSV极早期基因所影响的果蝇免疫相关基因，发现WSSV极早期蛋白WSV056过表达果蝇系中，CG9657基因的转录水平显著下调。

CG9657是溶质转运基因(Solute Carrier,SLC)超家族第5亚家族(SLC5)成员。溶质转运基因(Solute Carrier,SLC)超家族编码一组细胞膜上的膜转运蛋白，介导细胞与外界环境间或细胞内部各类溶质的跨膜运输，参与机体活动的营养与代谢、神经递质转运与信号传导等重要功能，此外该超家族所转运的底物还涉及心血管系统、免疫系统等方面。SLC超家族成员广泛存在于在原核和真核生物中，人类超过400个，有四分之一与人类疾病直接相关。SLC5亚家族成员编码一组Na

对虾中存在CG9657的同源基因。该基因与人类SLC超家族第5亚家族第8成员(SLC5A8)相似度最高，因此命名为LvSLC5A8。人类的SLC5A8基因编码蛋白也被称为钠耦联单羧酸转运蛋白(SMCT1)。该基因在多种肿瘤组织中表达下调或者缺失，其启动子区域的甲基化可以导致多种肿瘤的发生。目前关于SLC5A8功能研究多数集中在抑制肿瘤生长的机制上，而在抗病毒方面的功能还未有相关报道。

本发明发现凡纳滨对虾LvSLC5A8基因的转录水平在WSSV感染过程中发生显著下调，而对虾体内干扰WSV056的表达则能减轻WSSV病毒对LvSLC5A8的抑制水平，提示对虾LvSLC5A8基因的表达可能受病毒基因WSV056的调控。制备LvSLC5A8重组蛋白注射对虾后进行感染实验，发现LvSLC5A8的过表达显著降低感染对虾体内WSSV拷贝数，说明LvSLC5A8具有抗病毒免疫功能。而LvSLC5A8在WSSV感染中发生下调，可能是病毒进化出抑制LvSLC5A8表达蛋白抗病毒功能的机制。

综上所述，凡纳滨对虾的LvSLC5A8可以提高凡纳滨对虾的抗病毒免疫能力，其重组蛋白可以用于制备抗WSSV免疫制剂，在生产实践中亦具有广泛应用前景；且目前缺乏有效的WSSV控制药物，而发明人通过实验发现凡纳滨对虾LvSLC5A8基因及其编码蛋白能抑制WSSV的感染，为WSSV防治的开发提供一种新的思路。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明提供了一种凡纳滨对虾溶质转运基因LvSLC5A8，所述凡纳滨对虾溶质转运基因LvSLC5A8的核苷酸序列为SEQ ID NO:1中所示的序列，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2中所示的序列。

为解决以上技术问题，本发明还提供了凡纳滨对虾溶质转运基因LvSLC5A8及其编码蛋白在抑制WSSV感染中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明发现凡纳滨对虾的LvSLC5A8基因可以提高凡纳滨对虾的抗病毒免疫能力，实验表明通过注射重组蛋白rLvSLC5A8能抑制WSSV在对虾体内的复制水平，可以用于制备抗WSSV免疫制剂。本发明的研究结果为对虾白斑综合征病毒的防治提供了有益的保护途径，其使用可以减少或消除常规抗生素和消毒药物的使用，降低化学药物带来的污染和抗生素带来的抗药性安全风险，在对虾健康养殖上有较大的应用前景。

附图说明

图1为本发明凡纳滨对虾LvSLC5A8与最相近的预测蛋白PjSMCT-1的序列比对图；

图2为本发明WSV056在对虾感染WSSV病毒过程中对LvSLC5A8的调控作用。**表示p<0.01；

图3为本发明凡纳滨对虾LvSLC5A8-His重组融合蛋白的纯化；

图4为本发明LvSLC5A8-His蛋白抑制凡纳滨对虾体内WSSV病毒的复制。**表示p<0.01。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施条例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

如表1所示，所有引物均由上海生物工程有限公司合成，除非特别说明，所有引物的浓度为10mM。

表1实施例1-4中对应所用的引物序列

实施例1.凡纳滨对虾溶质转运基因LvSLC5A8的克隆和测序

材料准备：大肠杆菌DH5α感受态细胞(上海生物工程有限公司)、大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(北京天根生化)、pMD18-T载体(TaKaRa，中国)、原核表达载体pET30A(索莱宝，中国)、基因组提取试剂盒(TaKaRa，中国)、PrimeScript RT Reagent Kit with gDNAEraser(TaKaRa，中国)、SYBR Premix Ex Taq TM II(TaKaRa，中国)、T7 Ribo-MAX

1.总RNA的提取：凡纳滨对虾的肠道组织约0.5g用无菌生理盐水冲洗后，马上放入液氮预冷研钵中，在液氮中迅速研磨成粉末，加入1mL Trizol提取液，按照Invitrogen说明书提取总RNA。紫外分光光度计检测RNA的质量。

2.RACE扩增和克隆鉴定：

根据实验室转录组数据库中LvSLC5A8基因序列片段，设计两个上游引物以及两个下游引物(见表1)，使用TaKaRa的3′-Full RACE Core Set和5′-Full RACE试剂盒分别用于3'和5'末端扩增。按试剂盒说明书对PCR产物进行纯化，采用pMD18-T载体对LvSLC5A8基因的3'和5'末端片段进行TA克隆，然后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布带有氨苄青霉素(Amp)抗性的LB平板。挑取白色菌落送交测序(上海生物工程有限公司)。测序结果拼接后，获得全长cDNA。分析表明，该序列含有一个全长为2115bp的开放阅读框(ORF)，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该ORF编码蛋白具有704个氨基酸，其序列如SEQ ID NO.2所示。

将凡纳滨对虾LvSLC5A8基因编码蛋白经BlastP(http://www.ncbi.nim.nih.gov/)与NCBI数据库进行比对，发现与其相似度最高的是根据日本对虾基因组预测的基因PjSMCT-1编码蛋白，序列一致性达到77.66％，其结果如图1所示，揭示凡纳滨对虾LvSLC5A8序列不与任何先前已公布的蛋白序列一致，说明其是一个新发现的蛋白，其编码基因LvSLC5A8也是一个新发现的基因。利用CD Search(https://ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)搜索目标蛋白的保守域，发现LvSLC5A8基因编码蛋白具有SLC5基因亚家族的保守结构域，说明LvSLC5A8具有溶质转运蛋白的结构特征。

实施例2.WSV056在对虾感染过程中对LvSLC5A8的调控作用

用T7 Ribo-MAX

实施例3.凡纳滨对虾LvSLC5A8基因重组蛋白的表达

1.构建原核重组表达载体pET30A-LvSLC5A8

以cDNA作为模板，利用PCR扩增LvSLC5A8开放读码框(引物见表1)。PCR产物进行纯化后，采用pMD18-T载体对LvSLC5A8基因的开放阅读框进行TA克隆。然后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布带有Amp抗性的LB平板。挑取白色菌落为模板，采用重组表达引物(表1)扩增后进行PCR产物纯化。

将pET30A载体和纯化后的LvSLC5A8 PCR产物KpnI和HindIII双酶切，电泳检测并分别胶回收纯化，连接后转化到大肠杆菌DH5α，涂布带有Amp抗性的LB平板。挑取白色菌落做PCR鉴定，选阳性克隆送上海生物工程有限公司测序验证。

2.rLvSLC5A8融合蛋白的诱导表达

将测序正确的重组质粒pET30A-LvSLC5A8转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，同时转化pET30A空质粒作为对照。分别挑取单克隆菌落，于含有100μg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃培养至OD 600为0.6时，加入终浓度为1mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，16℃诱导表达过夜，收集菌体；用PBS重悬菌体，4℃，超声波破碎6min，超声破碎后菌液4℃以10000r/min离心20min，分离上清和沉淀，采用Ni-NTA纯化介质纯化重组蛋白rLvSLC5A8，电泳结果显示在82kDa左右处有明显条带(图3)，除去约5kDa由载体添加的His-Tag标签融合蛋白，与预测凡纳滨对虾LvSLC5A8为77kDa的结果一致。

实施例4.凡纳滨对虾rLvSLC5A8重组蛋白在凡纳滨对虾活体中的抗病毒功能

利用凡纳滨对虾对rLvSLC5A8重组蛋白的抗WSSV病毒活性进行活体分析。对虾随机分成三组，每组25只。两组实验组分别注射50μL含有10μg rLvSLC5A8蛋白或His-Tag蛋白与5×10

如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 闽江学院

<120> 一种凡纳滨对虾溶质转运基因LvSLC5A8及其编码蛋白和应用

<130> 2022

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2115

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 1

<210> 2

<211> 704

<212> PRT

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 2

Met Ser Leu Asn Thr Gln Glu Leu Val Asp Arg Phe Thr Trp Val Asp

1 5 10 15

Tyr Thr Val Phe Gly Leu Met Leu Ala Val Ser Ala Ala Ile Gly Ile

20 25 30

Phe Tyr Gly Leu Cys Ser Arg Lys Lys Gln Asp Thr Lys Glu Phe Leu

35 40 45

Met Ala Gly Lys Ser Met Thr Thr Phe Pro Val Ala Met Ser Leu Ile

50 55 60

Ala Ser Phe Met Ser Ala Ile Thr Leu Leu Gly Thr Pro Ala Glu Val

65 70 75 80

Tyr Gln Phe Gly Phe Leu Tyr Trp Leu Ile Gly Trp Ser Tyr Ile Leu

85 90 95

Val Met Pro Ser Ala Ala Tyr Leu Tyr Phe Pro Val Phe His Lys Leu

100 105 110

Gln Val Thr Ser Ala Tyr Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Phe Asn Arg Lys

115 120 125

Ile Arg Trp Met Gly Ser Phe Thr Phe Ile Ile Gln Met Cys Leu Tyr

130 135 140

Met Ala Ile Val Val Tyr Ala Pro Ala Leu Ala Leu Ser Gln Val Thr

145 150 155 160

Gly Met Asn Val Tyr Phe Ser Val Ser Leu Ile Ser Phe Val Cys Ile

165 170 175

Phe Tyr Thr Thr Leu Gly Gly Met Lys Ala Val Leu Trp Thr Asp Ala

180 185 190

Ile Gln Val Ile Ile Met Phe Gly Ser Val Leu Phe Val Ile Ile Lys

195 200 205

Gly Thr Ile Asp Met Gly Gly Phe Glu Tyr Val Trp Ala Lys Asn Lys

210 215 220

Glu Trp Asp Arg Ile Glu Leu Val Asn Phe Asp Pro Asn Pro Thr Thr

225 230 235 240

Arg His Ser Ile Trp Ser Leu Ile Ile Gly Gly Tyr Phe Thr Trp Ile

245 250 255

Ala Asn Tyr Gly Val Asn Gln Ala Gln Val Gln Arg Tyr Leu Cys Val

260 265 270

Arg Thr Lys Ala Met Val Glu Arg Ala Leu Trp Ile Asn Met Ala Gly

275 280 285

Leu Phe Val Leu Met Ile Ser Cys Ala Phe Gly Gly Leu Val Ile Phe

290 295 300

Ala Arg Tyr Trp Asp Cys Asp Pro Ile Ser Ala Gly Val Val Ser Ser

305 310 315 320

Ala Asp Gln Leu Met Pro Leu Phe Val Met Asp Ile Leu Gly Gly Trp

325 330 335

Arg Gly Leu Pro Gly Leu Phe Val Ala Gly Ile Phe Ala Gly Ala Leu

340 345 350

Ser Thr Val Ser Ser Gly Met Asn Ser Leu Ala Ala Ile Val Leu Glu

355 360 365

Asp Phe Leu Lys Asn Gly Cys Tyr Lys Thr Ile Ser Glu Arg Ala Ser

370 375 380

Thr Val Ala Ser Lys Leu Leu Ser Leu Leu Phe Gly Leu Leu Thr Phe

385 390 395 400

Ala Leu Val Phe Val Ala Glu Gln Leu Gly Gly Val Leu Ser Ala Ala

405 410 415

Leu Ser Ile Phe Gly Met Val Gly Gly Pro Leu Leu Gly Leu Phe Ser

420 425 430

Leu Gly Met Phe Phe Pro Trp Ala Asn Ser Val Gly Ala Ala Val Gly

435 440 445

His Val Cys Gly Leu Ala Phe Met Phe Trp Ile Gly Val Gly Thr Gln

450 455 460

Val Gly Leu Ala Thr Gly Asp Val Thr Tyr Pro Lys Lys Pro Leu Ser

465 470 475 480

Val Ser Gly Cys Asn Phe Thr Glu Thr Thr Ala Gly Phe Ser Ser Thr

485 490 495

Glu Ala Ala Phe Leu Thr Ser Ser Glu Thr Ser Phe Val Pro Thr Glu

500 505 510

Pro Pro Ser Gly Ile Leu Gly Leu Tyr Asn Leu Ser Tyr Met Trp Tyr

515 520 525

Ser Ala Thr Gly Cys Phe Thr Val Ile Val Val Gly Leu Val Val Ser

530 535 540

Leu Leu Thr Gly Gly Arg Asp Leu Gly Ser Leu Asp Pro Arg Thr Leu

545 550 555 560

Ser Pro Pro Leu Leu Trp Leu Arg Lys Trp Val Pro Ala Leu Arg Ala

565 570 575

Val Gly Glu Asn Leu Asn Asp Glu Leu Asp Glu Leu Arg Glu Thr Ser

580 585 590

Thr Ser Glu Lys Asp Gly Gly Asp Leu Thr Ser Gly Asp Leu Thr Ser

595 600 605

Ile Ile Ser Lys Leu Pro Pro Arg Thr Leu Asp Gly Ser Leu Lys Glu

610 615 620

Ala Lys Thr Asp Lys Leu Pro Val Val Leu Asp Ala Pro Ala Leu Pro

625 630 635 640

Arg Glu Asp Pro Ala Lys Leu Lys Ser Ser Met Ser Asp Ser Ala Phe

645 650 655

Glu Asp Gly Ser Ser Ser Leu Gly Ile Leu Glu Glu Glu Lys Glu Glu

660 665 670

Asp Gly Arg Ser Glu Asp Leu Gly Leu Glu Asn Ser Ala Met Ser Val

675 680 685

Asp Asp Glu Asp Gly Ser Thr Ser Leu Thr Ile Pro Thr Thr His Leu

690 695 700