一种抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒及其制备方法

摘要

本发明公开了一种抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒，属于体外诊断试剂技术领域。该试剂盒包括以下试剂R1和试剂R2，其中试剂R1的组分包括：Tris缓冲液、NaCl、PEG‑6000、ProClin300；试剂R2的组分包括：CCP致敏胶乳颗粒、ProClin300、MES缓冲液、硼酸‑硼砂缓冲液、封闭剂、蔗糖。相对于传统的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒，本发明的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒具有稳定性高、灵敏度高、线性范围宽、准确度好和稳定性良好，抗干扰性强以及使用方便等优点，完全可以满足临床需要。

说明书

技术领域

本发明属于体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

类风湿关节炎(RA)是一种以侵蚀性关节炎为主要表现的全身性自身免疫病。病理表现为关节滑膜的慢性炎症、血管翳形成，并出现关节的软骨和骨破坏，若不能及时诊断及时正规治疗，最终可导致关节畸形和功能丧失。

抗环瓜氨酸肽抗体的检测对类风湿关节炎的诊断有高度的特异性，并可用于RA的早期诊断。目前认为抗CCP抗体对RA诊断敏感性为50～78％，特异性为96％，早期患者阳性率可达80％。此外，抗CCP抗体不仅是RA早期诊断诊断指标，还是鉴别侵袭性和非侵袭性RA的灵敏指标。其抗体阳性患者比抗体阴性的患者易发展更严重的关节骨质破坏。该抗体可先于疾病的临床表现出现，可以出现在RA典型临床症状的数年前，阳性比类风湿因子(RF)出现早，特异性比RF高，与联合RF检测，可以提高RA的实验室检出率。

目前临床主要的抗环瓜氨酸肽抗体测定方法有酶联免疫吸附法(ELISA)、化学发光法、免疫比浊法等。其中，ELISA法检测一般采用手工操作，操作繁琐效率低，且人为影响因素大，结果只能定性或不精确地定量；化学发光法操作步骤多，测试成本高，且发射强度依赖于各种环境因素，在不同的环境体系中，发射强度和时间的曲线有较大的差别，所以必须严格控制外界的各种因素；免疫比浊法操作简单，抗干扰性更强，且可测线性范围也更宽，能利用普通的生化分析仪进行检测，容易实现自动化，可在各级基层医疗机构普及和应用。

胶乳增强免疫比浊法是将待测物质相对应的抗体或抗原包被在胶乳颗粒上，使抗原抗体结合物的体积增大，光通过之后，透射光和散射光的强度变化更为显著，从而在免疫比浊法的基础上提高试验的敏感性。

目前的胶乳增强免疫比浊法试剂盒测定环瓜氨酸肽抗体还存在以下问题：(1)试剂稳定性较差：由于试剂中封闭剂选用不合理，不能增加胶乳包被抗环瓜氨酸肽抗体的悬浮稳定性，相互聚集成大物质，试剂易产生沉淀；(2)试剂特异性不高，由于CCP抗原尺寸非常小，使得CCP抗体很难识别到，如果胶乳微球粒径选用不合理，导致大多数试剂不能很好的检出抗环瓜氨酸肽抗体。(3)与类风湿关节炎诊断阴阳符合率不高：由于大多试剂特异性不高，导致不能很好与类风湿因子项目的试剂检测结果一致。

基于以上所述的现有技术存在的问题，本发明提供一种特异性高、灵敏度高且稳定性好的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒。

发明内容

针对以上问题，本发明提供一种抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒，该试剂盒稳定性高、灵敏度高、线性范围宽、准确度好和稳定性良好，抗干扰性强，使用方便。

本发明通过以下技术方案实现：

一种抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2；

所述试剂R1的各组分及含量包括：Tris缓冲液5-10g/L、NaCl 5-10g/L、PEG-60000.1-0.5％、ProClin300 0.1％；

所述试剂R2的各组分及含量包括：CCP致敏胶乳颗粒0.1-0.5g/L、ProClin3000.1％、MES缓冲液10-25mM、硼酸-硼砂缓冲液10-150mmol/L、封闭剂1-10ml/L、蔗糖50-100g/L。

试剂R1和试剂R2中的ProClin300作为防腐剂，防止微生物的繁殖对试剂盒的品质的影响，抑制微生物的生长。

作为技术方案的优选，所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2；

所述试剂R1的各组分及含量包括：Tris缓冲液7g/L、NaCl 9g/L、PEG-6000 0.2％、ProClin300 0.1％；

所述试剂R2的各组分及含量包括：CCP致敏胶乳颗粒0.25g/L、ProClin300 0.1％、MES缓冲液15mM、硼酸-硼砂缓冲液20mmol/L、封闭剂8ml/L、蔗糖60g/L。

作为技术方案的优选，所述试剂R2中的封闭剂由三乙醇胺、甘氨酸和酪蛋白按照质量比0.5-2:1:1-4复配而成。

作为技术方案的优选，所述试剂R2中的封闭剂由三乙醇胺、甘氨酸和酪蛋白按照质量比1.5:1:2复配而成。

作为技术方案的优选，所述试剂R2中的CCP致敏胶乳颗粒为粒径为68nm、123nm和273nm的羧基胶乳颗粒。

作为技术方案的优选，所述试剂R2中的68nm羧基胶乳颗粒、123nm羧基胶乳颗粒和273nm羧基胶乳颗粒的体积比为3:2:1。

一种如上所述的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

试剂R1的配制：

(1)取纯化水，加入试剂R1的配制容器中，在搅拌条件下依次加入NaCl、Tris、PEG-6000和ProClin300，搅拌至完全溶解；

(2)测步骤(1)完全溶解后的溶液的pH值，用盐酸或氢氧化钠调节PH值至7.50±0.30；

(3)定容：加入纯化水至规定配制量后，进行搅拌，搅拌时避免产生泡沫；

(4)过滤：将步骤(3)定容后的溶液用滤膜过滤至另一清洁可密封加盖的贮存容器；试剂R2的配制：

(1)在试剂R2的配制容器内加入CCP致敏胶乳颗粒与MES缓冲液，混匀；

(2)在搅拌条件下加入NHS缓冲液与EDC缓冲液，在37℃环境下搅拌活化15-20min；

(3)在步骤(2)活化后的溶液中加入硼酸-硼砂缓冲液，以及硼酸-硼砂缓冲液与CCP抗原的混合液，在37℃环境下，于400-500r/min的速度下搅拌标记3-4h；

(4)在步骤(3)标记后的溶液中依次加入MES缓冲液、封闭剂、蔗糖和ProClin300，于400-500r/min的速度下搅拌1-2h；

(5)将步骤(4)搅拌结束后得到的溶液置于37℃环境下封闭23-25h。

作为技术方案的优选，所述试剂R1的配制中的步骤(1)的搅拌为于400-500r/min的速度下搅拌30-40min至完全溶解。

作为技术方案的优选，所述试剂R2的配制中的步骤(1)的混匀为在37℃环境下混匀5-10min。

作为技术方案的优选，所述试剂R1的配制中所用滤膜的孔径为0.22μm。

与现有技术相比，本发明的优点及有益效果为：

1、本发明的检测试剂盒操作简便快速，适用于自动化分析，是一种更加稳定、更加灵敏、线性范围宽的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒，试剂盒的准确度和稳定性良好，抗干扰性强，使用方便，完全可以满足临床需要。

2、本发明采用胶乳增强免疫比浊法，通过试剂R1和试剂R2采用复合缓冲液，并优化各组分的配比，显著改善了试剂的稳定性。

3、本发明通过优化环瓜氨酸抗原包被胶乳颗粒的制备方法，并且采用68nm、123nm、273nm三种不同粒径的羧基胶乳微球联用，使得试剂的重复性更好，抗干扰能力更强。

4、本发明采用三乙醇胺、甘氨酸和酪蛋白按照质量比复配而成的封闭剂，可以促进并维持系统稳定，防止体系浑浊，显著增强了试剂的稳定性和抗干扰能力。

附图说明

图1为实施例1的待检测系统测量数据与比对检测系统测量数据的线性关系图。

图2为实施例2的待检测系统测量数据与比对检测系统测量数据的线性关系图。

图3为实施例3的待检测系统测量数据与比对检测系统测量数据的线性关系图。

图4为对比例1的待检测系统测量数据与比对检测系统测量数据的线性关系图。

图5为对比例2的待检测系统测量数据与比对检测系统测量数据的线性关系图。

图6为对比例3的待检测系统测量数据与比对检测系统测量数据的线性关系图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步地详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的保护范围。

实施例1

试剂R1的配制：(以配制1L为例)

(1)用1000mL量筒准确量取800mL的纯化水加入到试剂1配制容器中，备用；

(2)在搅拌下依次加入NaCl(有助于张力，相对于细胞等渗或高渗取决于NaCl浓度)、Tris、PEG-6000、ProClin300，加入物料后，400r/min搅拌30分钟至完全溶解；

(3)以上完全溶解后测pH值，边搅拌边用盐酸或氢氧化钠调节pH值至7.50±0.30；

(4)定容：加纯化水至规定配制量后，400r/min搅拌30分钟，搅拌时避免产生泡沫；

(5)过滤：用孔径0.22μm的滤膜过滤至另一清洁可密封加盖的贮存容器。

试剂R2的配制：(以配制1L为例)

(1)配制容器内将68nm羧基胶乳颗粒、123nm羧基胶乳颗粒、273nm羧基胶乳颗粒按体积比为3:2:1的比例与MES缓冲液混合，37℃环境下混匀5min；

(2)在搅拌条件下加入NHS缓冲液与EDC缓冲液，37℃环境下搅拌活化15min；

(3)活化后加入硼酸-硼砂缓冲液，以及硼酸-硼砂缓冲液与CCP抗原的混合液，37℃环境下，400r/min搅拌标记3h；

(4)以上结束后依次加入MES缓冲液、封闭剂(由三乙醇胺、甘氨酸和酪蛋白按照质量比1.5:1:2复配而成)、蔗糖、ProClin300，400r/min搅拌1h；

(5)搅拌结束后置于37℃环境下封闭24h。

全自动生化分析仪参数设置：如下表

操作如下表所示：

计算：抗环瓜氨酸肽抗体含量(U/mL)＝(ΔA测定÷ΔA标准)×C标准

实施例2

实施例2与实施例1的的区别在于，实施例2中的封闭剂由三乙醇胺、甘氨酸和酪蛋白按照质量比0.5:1:1复配而成，其余条件均与实施例1的相同。

实施例3

实施例3与实施例1的的区别在于，实施例3中的封闭剂由三乙醇胺、甘氨酸和酪蛋白按照质量比2:1:4复配而成，其余条件均与实施例1的相同。

对比例1

对比例1与实施例1的的区别在于，对比例1中环瓜氨酸抗原包被乳胶颗粒在制备时，只采用68nm羧基胶乳颗粒，其余条件均与实施例1的相同。

对比例2

对比例2与实施例1的的区别在于，对比例2中环瓜氨酸抗原包被乳胶颗粒在制备时，只采用123nm羧基胶乳颗粒，其余条件均与实施例1的相同。

对比例3

对比例3与实施例1的的区别在于，对比例3中环瓜氨酸抗原包被乳胶颗粒在制备时，只采用273nm羧基胶乳颗粒，其余条件均与实施例1的相同。

实验结果及数据分析

(一)精密度评价

1、实验方法

在重复性条件下，用2个浓度的质控物测试试剂盒，测试10次，分别计算测量值的平均值

2、实验结果

3、结果分析

从上表可以看出，实施例1-3对应的试剂盒检测的数值标准偏差和变异系数明显小于对比例1-3对应的试剂盒，具有更高的批内精密度，这说明本发明通过优化环瓜氨酸抗原包被胶乳颗粒的制备方法，采用68nm、123nm、273nm三种不同粒径的羧基胶乳微球联用；并且使用三乙醇胺、甘氨酸和酪蛋白复配而成的封闭剂，优化了反应体系，极大的提高了试剂盒的批内精密度。

(二)稳定性评价

1、实验方法

将实施例1-3及对比例1-3试剂分别置于以下环境：(1)2～8℃条件下保存至有效期12个月后两个月即第14个月；(2)在2～8℃条件下开瓶保存至35天；(3)在37℃下存放条件下保存7天。在重复性条件下，用浓度在参考区间附近的样本(血清：≤35U/mL)测试试剂，测试10次，分别计算测量值的平均值

2、实验结果

3、结果分析

从上表可以看出，实施例1-3对应的试剂盒检测的数值标准偏差和变异系数明显小于对比例1-3对应的试剂盒，具有更好的稳定性，这说明本发明通过优化环瓜氨酸抗原包被胶乳颗粒的制备方法，采用68nm、123nm、273nm三种不同粒径的羧基胶乳微球联用；并且使用三乙醇胺、甘氨酸和酪蛋白复配而成的封闭剂，优化了反应体系，极大的提高了试剂盒的稳定性。

(三)正确度评价

1、实验方法

收集病人样本，选择在具有临床意义范围内的样本。分析浓度尽可能覆盖异常高值、中值、临界值、低值，并且应均匀分布。实验系统和比对系统都有质控程序控制的情况下，用二种分析系统分别分析40例病人样本。记录试验数据。以待检测系统测量数据为自变量，比对检测系统测量数据为因变量，先剔除离群值，再计算线性相关系数的平方(r

2、实验结果

实施例1-3以及对比例1-3的结果如图1-6所示，线性相关系数的平方(r

3、结果分析

从上表可以看出，实施例1-3对应的试剂盒与比对系统进行比对，其线性相关系数的平方(r

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。