蔓荆子的指纹图谱构建方法以及多指标含量检测方法

摘要

本发明涉及一种蔓荆子的指纹图谱构建方法及其多指标成分的含量检测方法。所述指纹图谱构建方法包括如下步骤：取原儿茶酸对照品、4‑羟基苯甲酸对照品、香草酸对照品、异荭草苷对照品、蔓荆子黄素对照品、穗花牡荆苷对照品和绿原酸对照品，以溶剂溶解，制备对照品溶液；取蔓荆子对照药材，加入提取溶剂进行提取，提取液滤过，制备对照药材溶液；取蔓荆子样品，加入提取溶剂进行提取，提取液滤过，制备供试品溶液；将所述对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液分别进行高效液相色谱检测，构建蔓荆子的指纹图谱。该方法构建获得的蔓荆子的指纹图谱检测耗时短、特征峰多，特别是黄酮类成分的特征峰多，能够快速、全面反映蔓荆子质量。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种蔓荆子的指纹图谱构建方法以及多指标含量检测方法。

背景技术

《中国药典》2020年版记载，蔓荆子为马鞭草科植物单叶蔓荆Vitex trifoliaL.var.simplicifolia Cham.或蔓荆Vitex trifolia L.的干燥成熟果实。蔓荆子主要分布于江西、山东、安徽、浙江等省；主产于江西省。据《中国药典》2020年版记载，蔓荆子味辛、苦，微寒，归膀胱、肝、胃经，具有疏散风热、清利头目等功效，常用于风热感冒头痛、齿龈肿痛、目赤多泪、目暗不明、头晕目眩等疾病的治疗，为临床上常用的一味中药。

研究发现，蔓荆子的化学成分主要包括挥发油类、双萜类、黄酮类、氨基酸、脂肪酸类等。其中挥发油类包括莰烯和蒎烯等；双萜类包括牡荆内酯、前牡荆内酯、蔓荆呋喃和前蔓荆呋喃等；黄酮类包括有异荭草苷(Isoorientin)、蔓荆子黄素(casticin)、黄艾素、7-去甲基艾黄素、木犀草素等；其他还包括对羟基苯甲酸、香草酸等。其中异荭草苷、蔓荆子黄素是蔓荆子的主要成分。现代药理研究表明，黄酮类成分为蔓荆子的活性成分，因而为了保证蔓荆子的质量，有必要对其黄酮类成分进行研究。

有方法提供一种炒蔓荆子标准汤剂质量检测方法，以蔓荆子黄素作为对照品，以甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相进行液相色谱仪分析，构建炒蔓荆子的特征图谱。但是该方法耗时较长，且特征图谱包含的特征峰仅为6个，不足以全面地反映炒蔓荆子的质量特征。

还有方法提供蔓荆子炮制前后HPLC指纹图谱比较研究，以异荭草苷、蔓荆子黄素、香草酸作为对照品，以乙腈-0.1％磷酸溶液为流动相进行液相色谱仪分析，构建蔓荆子炮制前后HPLC指纹图谱。但是该方法同样耗时较长，且特征峰之间分离度较低，难以准确衡量蔓荆子的质量。

发明内容

基于此，本发明提供一种检测耗时短、特征峰多，特别是黄酮类成分的特征峰多，能够快速、全面反映蔓荆子质量的蔓荆子的指纹图谱构建方法以及多指标含量检测方法。同时方法适用于蔓荆子药材、蔓荆子饮片、蔓荆子标准汤剂、蔓荆子中药配方颗粒的相关检测，涉及范围较广。

本发明的第一方面，提供一种蔓荆子的指纹图谱构建方法，包括如下步骤：

取原儿茶酸对照品、4-羟基苯甲酸对照品、香草酸对照品、异荭草苷对照品、蔓荆子黄素对照品、穗花牡荆苷对照品和绿原酸对照品，以溶剂溶解，制备对照品溶液；

取蔓荆子对照药材，加入提取溶剂进行提取，提取液滤过，制备对照药材溶液；

取蔓荆子样品，加入提取溶剂进行提取，提取液滤过，制备供试品溶液；

将所述对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液分别进行高效液相色谱检测，构建蔓荆子的指纹图谱；

其中所述高效液相色谱检测的条件包括：

色谱柱的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶；

流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.05％～0.15％的磷酸水溶液；

梯度洗脱程序包括：

0min～5min，所述流动相A的体积百分比由5％上升至17％；

5min～14min，所述流动相A的体积百分比由17％上升至25％；

14min～23min，所述流动相A的体积百分比由25％上升至65％；

23min～30min，所述流动相A的体积百分比由65％上升至90％；

30min～32min，所述流动相A的体积百分比保持为90％。

在其中一个实施例中，所述高效液相色谱检测的条件还包括：流速为0.28mL/min～0.32mL/min；和/或，柱温为33℃～37℃；和/或，波长为205nm～215nm。

在其中一个实施例中，所述对照药材溶液和/或所述供试品溶液的制备过程中，所述提取溶剂为体积浓度为60％～80％的甲醇水溶液。

在其中一个实施例中，所述对照药材溶液和/或所述供试品溶液的制备过程中，提取的方法为加热至回流提取或超声提取，所述超声提取的功率为240W～260W，频率为30KHz～50KHz；和/或，

提取的时间为20min～60min。

在其中一个实施例中，所述蔓荆子样品为蔓荆子药材、蔓荆子饮片、蔓荆子标准汤剂或蔓荆子中药配方颗粒。

在其中一个实施例中，所述蔓荆子的指纹图谱包含20个特征峰，其中，峰1为原儿茶酸、峰2为4-羟基苯甲酸、峰3为绿原酸、峰4为香草酸、峰7为异荭草苷、峰9为穗花牡荆苷、峰17为蔓荆子黄素。

本发明的第二方面，提供一种蔓荆子的多指标成分的含量检测方法，包括如下步骤：

取指标成分的对照品，以溶剂溶解，制备不同浓度的对照品溶液；所述指标成分为原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、香草酸、异荭草苷、蔓荆子黄素、穗花牡荆苷和绿原酸中的一种或多种；

将不同浓度的对照品溶液进行高效液相色谱检测，根据检测获得的峰面积以及浓度构建指标成分的标准曲线；

取待测样品，加入提取溶剂进行提取，提取液滤过，制备待测样品溶液；

将所述待测样品溶液进行高效液相色谱检测，然后将检测获得的峰面积代入构建所述指标成分的标准曲线，计算所述待测样品中指标成分的含量；

其中所述高效液相色谱检测的条件包括：

色谱柱的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶；

流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.05％～0.15％的磷酸水溶液；

梯度洗脱程序包括：

0min～5min，所述流动相A的体积百分比由5％上升至17％；

5min～14min，所述流动相A的体积百分比由17％上升至25％；

14min～23min，所述流动相A的体积百分比由25％上升至65％；

23min～30min，所述流动相A的体积百分比由65％上升至90％；

30min～32min，所述流动相A的体积百分比保持为90％。

在其中一个实施例中，所述高效液相色谱检测的条件还包括：流速为0.28mL/min～0.32mL/min；或/和，柱温为33℃～37℃；或/和，波长为343nm～353nm。

在其中一个实施例中，所述待测样品溶液的制备过程中，所述提取溶剂为体积浓度为60％～80％的甲醇水溶液。

在其中一个实施例中，所述待测样品溶液的制备过程中，提取的方法为加热至回流提取或超声提取，所述超声提取的功率为240W～260W，频率为30KHz～50KHz；和/或，

提取的时间为20min～60min。

在其中一个实施例中，所述待测样品为蔓荆子药材、蔓荆子饮片、蔓荆子标准汤剂或蔓荆子中药配方颗粒。

在其中一个实施例中，所述指标成分为异荭草苷，所述指标成分的标准曲线为y

所述指标成分为蔓荆子黄素，所述指标成分的标准曲线为y

上述蔓荆子的指纹图谱构建方法，采用合适的高效液相色谱检测条件，能够构建获得包含20个特征峰的蔓荆子指纹图谱，且以蔓荆子的黄酮类成分为主，具体包含蔓荆子的主要化学成分原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、绿原酸、香草酸、异荭草苷、穗花牡荆苷和蔓荆子黄素的特征峰，能够为蔓荆子的质量控制提供全面的、可靠的检测依据。

另外，随着中药配方颗粒质量控制要求的日益严格，进行多指标成分同时测定已是必然趋势。上述蔓荆子的多指标成分的含量检测方法，采用合适的高效液相色谱检测条件，能够分别或同时检测蔓荆子中多指标成分的含量，为有效评定蔓荆子的质量优劣提供依据。

同时，该指纹图谱构建方法和多指标成分的含量检测方法适用于蔓荆子药材、蔓荆子饮片、蔓荆子标准汤剂和蔓荆子中药配方颗粒，适用范围广泛。

附图说明

图1为实施例1的蔓荆子药材指纹图谱构建过程中不同提取溶剂考察色谱图；

图2为实施例1的蔓荆子药材指纹图谱构建过程中不同提取方式考察色谱图；

图3为实施例1的蔓荆子药材指纹图谱构建过程中不同提取时间考察色谱图；

图4为实施例1中蔓荆子对照药材的指纹图谱；

图5为实施例1中构建获得的蔓荆子药材对照指纹图谱；

图6为实施例1中19批蔓荆子药材的色谱图；

图7为实施例1中供试品溶液与对照品溶液的对比图；

图8为实施例1中供试品溶液(左)与原儿茶酸对照品溶液(右)UV图(200nm～400nm)；

图9为实施例1中供试品溶液(左)与4-羟基苯甲酸对照品溶液(右)UV图(200nm～400nm)；

图10为实施例1中供试品溶液(左)与绿原酸对照品溶液(右)UV图(200nm～400nm)；

图11为实施例1中供试品溶液(左)与香草酸对照品溶液(右)UV图(200nm～400nm)；

图12为实施例1中供试品溶液(左)与异荭草苷对照品溶液(右)UV图(200nm～400nm)；

图13为实施例1中供试品溶液(左)与穗花牡荆苷对照品溶液(右)UV图(200nm～400nm)；

图14为实施例1中供试品溶液(左)与蔓荆子黄素苷对照品溶液(右)UV图(200nm～400nm)；

图15为实施例1中蔓荆子供试品溶液总离子流图及紫外吸收色谱图；

图16为实施例1中专属性考察的色谱图；

图17为实施例1中异荭草苷(左)和蔓荆子黄素(右)峰全波长扫描光谱图；

图18为实施例1中异荭草苷(上)和蔓荆子黄素(下)峰纯度考察的色谱图；

图19为实施例1中采用外标法计算19批样品中异荭草苷和蔓荆子黄素的含量汇总图；

图20为实施例2中蔓荆子标准汤剂的对照指纹图谱；

图21为实施例2中蔓荆子中药配方颗粒的对照指纹图谱；

图22为实施例2中蔓荆子3批药材的药材、标准汤剂以及中药配方颗粒的色谱图；

图23为对比例1中不同流动相B的对比考察色谱图；

图24为对比例1中不同浓度的流动相B的对比考察色谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的蔓荆子的指纹图谱构建方法以及多指标含量检测方法作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。

本文中，“一种或多种”指所列项目的任一种、任两种或任两种以上。

本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。

本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。

本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。

本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。

本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。

本发明提供一种蔓荆子的指纹图谱构建方法，包括如下步骤：

取原儿茶酸对照品、4-羟基苯甲酸对照品、香草酸对照品、异荭草苷对照品、蔓荆子黄素对照品、穗花牡荆苷对照品和绿原酸对照品，以溶剂溶解，制备对照品溶液；

取蔓荆子对照药材，加入提取溶剂进行提取，提取液滤过，制备对照药材溶液；

取蔓荆子样品，加入提取溶剂进行提取，提取液滤过，制备供试品溶液；

将所述对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液分别进行高效液相色谱检测，构建蔓荆子的指纹图谱；

其中所述高效液相色谱检测的条件包括：

色谱柱的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶；

流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.05％～0.15％的磷酸水溶液；

梯度洗脱程序包括：

0min～5min，所述流动相A的体积百分比由5％上升至17％；

5min～14min，所述流动相A的体积百分比由17％上升至25％；

14min～23min，所述流动相A的体积百分比由25％上升至65％；

23min～30min，所述流动相A的体积百分比由65％上升至90％；

30min～32min，所述流动相A的体积百分比保持为90％。

在其中一个示例中，流动相B为体积浓度为0.05％～0.15％的磷酸水溶液。具体地，磷酸水溶液的体积浓度包括但不限于：0.05％、0.08％、0.1％、0.12％、0.15％。

在其中一个示例中，色谱柱为T3色谱柱。具体地，色谱柱为Waters CORTECS T3柱。

在其中一个示例中，色谱柱的尺寸为2.1mm×150mm，1.6μm。

在其中一个示例中，所述高效液相色谱检测的流速为0.28mL/min～0.32mL/min。具体地，流速包括但不限于：0.28mL/min、0.30mL/min、0.32mL/min。

在其中一个示例中，所述高效液相色谱检测的柱温为33℃～37℃。具体地，柱温包括但不限于：33℃、34℃、35℃、36℃、37℃。

在其中一个示例中，所述高效液相色谱检测的波长为205nm～215nm。具体地，波长包括但不限于：205nm、208nm、210nm、212nm、215nm。

在其中一个示例中，所述对照药材溶液和/或所述供试品溶液的制备过程中，所述提取溶剂为体积浓度为60％～80％的甲醇水溶液。具体地，甲醇水溶液的体积浓度包括但不限于：60％、65％、70％、75％、80％。

在其中一个示例中，所述对照药材溶液和/或所述供试品溶液的制备过程中，提取的方法为加热至回流提取或超声提取，所述超声提取的功率为240W～260W，频率为30KHz～50KHz。进一步地，提取的方法为加热至回流提取。

在其中一个示例中，提取的时间为20min～60min。具体地，提取的时间包括但不限于：20min、25min、30min、35min、40min、50min、55min、60min。

在其中一个示例中，所述蔓荆子样品为蔓荆子药材、蔓荆子饮片、蔓荆子标准汤剂或蔓荆子中药配方颗粒。

在其中一个示例中，所述对照药材溶液的制备过程中，所述提取溶剂的用量为每0.5g所述对照药材加入15mL～35mL。具体地，所述提取溶剂每0.5g所述对照药材加入的量包括但不限于：15mL、20mL、23mL、25mL、27mL、30mL、35mL。

在其中一个示例中，所述供试品溶液的制备过程中，所述蔓荆子样品为蔓荆子药材，所述提取溶剂的用量为每0.5g所述蔓荆子药材加入15mL～35mL。具体地，所述提取溶剂每0.5g所述蔓荆子药材加入的量包括但不限于：15mL、20mL、23mL、25mL、27mL、30mL、35mL。

在其中一个示例中，所述供试品溶液的制备过程中，所述蔓荆子样品为蔓荆子饮片，所述提取溶剂的用量为每0.5g所述蔓荆子饮片加入15mL～35mL。具体地，所述提取溶剂每0.5g所述蔓荆子饮片加入的量包括但不限于：15mL、20mL、23mL、25mL、27mL、30mL、35mL。

在其中一个示例中，所述供试品溶液的制备过程中，所述蔓荆子样品为蔓荆子标准汤剂，所述提取溶剂的用量为每0.1g所述蔓荆子标准汤剂加入15mL～35mL。具体地，所述提取溶剂每0.1g所述蔓荆子标准汤剂加入的量包括但不限于：15mL、20mL、23mL、25mL、27mL、30mL、35mL。

在其中一个示例中，所述供试品溶液的制备过程中，所述蔓荆子样品为蔓荆子中药配方颗粒，所述提取溶剂的用量为每0.2g所述蔓荆子中药配方颗粒加入15mL～35mL。具体地，所述提取溶剂每0.2g所述蔓荆子中药配方颗粒加入的量包括但不限于：15mL、20mL、23mL、25mL、27mL、30mL、35mL。

在其中一个示例中，所述蔓荆子的指纹图谱包含20个特征峰，其中，峰1为原儿茶酸、峰2为4-羟基苯甲酸、峰3为绿原酸、峰4为香草酸、峰7为异荭草苷、峰9为穗花牡荆苷、峰17为蔓荆子黄素。

本发明还提供一种蔓荆子的多指标成分的含量检测方法，包括如下步骤：

取指标成分的对照品，以溶剂溶解，制备不同浓度的对照品溶液；所述指标成分为原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、香草酸、异荭草苷、蔓荆子黄素、穗花牡荆苷和绿原酸中的一种或多种；

将不同浓度的对照品溶液进行高效液相色谱检测，根据检测获得的峰面积以及浓度构建指标成分的标准曲线；

取待测样品，加入提取溶剂进行提取，提取液滤过，制备待测样品溶液；

将所述待测样品溶液进行高效液相色谱检测，然后将检测获得的峰面积代入构建所述指标成分的标准曲线，计算所述待测样品中指标成分的含量；

其中所述高效液相色谱检测的条件包括：

色谱柱的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶；

流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.05％～0.15％的磷酸水溶液；

梯度洗脱程序包括：

0min～5min，所述流动相A的体积百分比由5％上升至17％；

5min～14min，所述流动相A的体积百分比由17％上升至25％；

14min～23min，所述流动相A的体积百分比由25％上升至65％；

23min～30min，所述流动相A的体积百分比由65％上升至90％；

30min～32min，所述流动相A的体积百分比保持为90％。

可以理解的是，含量检测方法采用的方法包括但不限于外标法。

在其中一个示例中，流动相B为体积浓度为0.05％～0.15％的磷酸水溶液。具体地，磷酸水溶液的体积浓度包括但不限于：0.05％、0.08％、0.1％、0.12％、0.15％。

在其中一个示例中，色谱柱为T3色谱柱。具体地，色谱柱为Waters CORTECS T3柱。

在其中一个示例中，色谱柱的尺寸为2.1mm×150mm，1.6μm。

在其中一个示例中，所述高效液相色谱检测的流速为0.28mL/min～0.32mL/min。具体地，流速包括但不限于：0.28mL/min、0.30mL/min、0.32mL/min。

在其中一个示例中，所述高效液相色谱检测的柱温为33℃～37℃。具体地，柱温包括但不限于：33℃、34℃、35℃、36℃、37℃。

在其中一个示例中，所述高效液相色谱检测的波长为343nm～353nmnm。具体地，波长包括但不限于：343nm、346nm、348nm、350nm、353nmnm。

在其中一个示例中，所述待测样品溶液的制备过程中，所述提取溶剂为体积浓度为60％～80％的甲醇水溶液。具体地，甲醇水溶液的体积浓度包括但不限于：60％、65％、70％、75％、80％。

在其中一个示例中，所述待测样品溶液的制备过程中，提取的方法为加热至回流提取或超声提取，所述超声提取的功率为240W～260W，频率为30KHz～50KHz。进一步地，提取的方法为加热至回流提取。

在其中一个示例中，提取的时间为20min～60min。具体地，提取的时间包括但不限于：20min、25min、30min、35min、40min、50min、55min、60min。

在其中一个示例中，所述待测样品为蔓荆子药材、蔓荆子饮片、蔓荆子标准汤剂或蔓荆子中药配方颗粒。

在其中一个示例中，所述待测样品溶液的制备过程中，所述待测样品为蔓荆子药材，所述提取溶剂的用量为每0.5g所述蔓荆子药材加入15mL～35mL。具体地，所述提取溶剂每0.5g所述蔓荆子药材加入的量包括但不限于：15mL、20mL、23mL、25mL、27mL、30mL、35mL。

在其中一个示例中，所述待测样品溶液的制备过程中，所述待测样品为蔓荆子饮片，所述提取溶剂的用量为每0.5g所述蔓荆子饮片加入15mL～35mL。具体地，所述提取溶剂每0.5g所述蔓荆子饮片加入的量包括但不限于：15mL、20mL、23mL、25mL、27mL、30mL、35mL。

在其中一个示例中，所述待测样品溶液的制备过程中，所述待测样品为蔓荆子标准汤剂，所述提取溶剂的用量为每0.1g所述蔓荆子标准汤剂加入15mL～35mL。具体地，所述提取溶剂每0.1g所述蔓荆子标准汤剂加入的量包括但不限于：15mL、20mL、23mL、25mL、27mL、30mL、35mL。

在其中一个示例中，所述待测样品溶液的制备过程中，所述待测样品为蔓荆子中药配方颗粒，所述提取溶剂的用量为每0.2g所述蔓荆子中药配方颗粒加入15mL～35mL。具体地，所述提取溶剂每0.2g所述蔓荆子中药配方颗粒加入的量包括但不限于：15mL、20mL、23mL、25mL、27mL、30mL、35mL。

在其中一个示例中，所述指标成分为异荭草苷和/或蔓荆子黄素。

在其中一个示例中，所述指标成分为异荭草苷，所述指标成分的标准曲线为y

在其中一个示例中，所述指标成分为蔓荆子黄素，所述指标成分的标准曲线为y

需要说明的是，本发明的上述方法中所涉步骤没有顺序限制。

以下为具体的实施例，实施例中所述试验方法，如无特别说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特别说明，均可从商业途径获得。

实施例1

1.仪器和试药

1.1仪器：Waters高效液相色谱仪(Waters H-Class，Waters公司)；WatersCORTECS T3柱(150mm×2.1mm，1.6μm)；万分之一分析天平(ME204E，梅特勒-托利多公司)；百万分之一分析天平(XP26，梅特勒-托利多公司)；数控超声波清洗器(KQ500DE，昆山市超声仪器有限公司)；恒温水浴锅(HWS28型，上海一恒科技有限公司)；超纯水系统(Milli-QDirect，默克股份有限公司)。

1.2试剂：乙醇(西陇科学股份有限公司，分析纯)、甲醇(西陇科学股份有限公司，分析纯)；磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯)、乙腈(默克股份有限公司，色谱纯)、水为超纯水(实验室自制)。

1.3试药：异荭草苷(批号：111974-201401；含量：94.0％；中国食品药品检定研究院)；蔓荆子黄素(批号：111554-201705；含量：98.3％；中国食品药品检定研究院)；4-羟基苯甲酸(批号：101149-201903；含量：100％；中国食品药品检定研究院)；绿原酸(批号：110753-202018；含量：96.1％；中国食品药品检定研究院)；香草酸(批号：110776-201503；含量：99.8％；中国食品药品检定研究院)；原儿茶酸(批号：110809-201906；含量：97.7％；中国食品药品检定研究院)；穗花牡荆苷(批号：CFN99203；含量：98％；ChemFaces)；蔓荆子(单叶蔓荆)对照药材(批号：G161037，广东一方制药有限公司)；19批蔓荆子(单叶蔓荆)药材详细信息见表1。

中国药典2020版一部规定蔓荆子为马鞭草科植物单叶蔓荆Vitex trifoliaL.var.simplicifolia Cham.或蔓荆Vitex trifolia L.的干燥成熟果实。本发明研究所用药材经广东一方制药有限公司质量中心鉴定为马鞭草科植物单叶蔓荆Vitex trifoliaL.var.simplicifolia Cham.的干燥成熟果实，具体信息见表1。

表1、19批蔓荆子药材产地信息表

2 方法与结果

2.1 色谱条件

选择Waters CORTECS T3(150mm×2.1mm，1.6μm)色谱柱；以乙腈为流动相A，以体积浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相B，按下表2中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3mL；柱温为35℃；指纹图谱检测波长为210nm，含量测定检测波长为348nm；进样体积为2μL。理论板数按蔓荆子黄素计算应不低于8000。

表2、梯度洗脱表

2.2参照物溶液的制备

取原儿茶酸对照品1.742mg，置20mL量瓶中，加体积浓度为10％的甲醇水溶液制成每1mL含85.097μg的对照品母液，备用。

取4-羟基苯甲酸对照品2.735mg，置10mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含273.500μg的对照品母液，备用。

取香草酸对照品2.874mg，置20mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含143.413μg的对照品母液，备用。

取异荭草苷对照品2.743mg，置10mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含257.842μg的对照品母液，备用。

取蔓荆子黄素对照品3.392mg，置20mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含166.717μg的对照品母液，备用。

取穗花牡荆苷对照品1.658mg，置20mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含81.242μg的对照品母液，备用。

取绿原酸对照品1.938mg，置20mL量瓶中，加体积浓度为50％的甲醇水溶液制成每1mL含93.121μg的对照品母液，备用。

精密吸取上述原儿茶酸对照品母液3.0mL，置10mL量瓶中，加体积浓度为10％的甲醇水溶液制成每1mL含25.529μg的溶液，即得。

精密吸取上述4-羟基苯甲酸对照品母液、香草酸对照品母液、异荭草苷对照品母液、蔓荆子黄素对照品母液、穗花牡荆苷对照品母液各1mL，置10mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含4-羟基苯甲酸27.350μg、香草酸14.341μg、异荭草苷25.784μg、蔓荆子黄素16.672μg、穗花牡荆苷8.124μg的混合对照品溶液，即得。

精密吸取上述绿原酸对照品母液2.0mL，置10mL量瓶中，加体积浓度为50％的甲醇水溶液制成每1mL含18.624μg的溶液，即得。

取蔓荆子对照药材约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为70％的甲醇水溶液25mL，密塞，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用体积浓度为70％的甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3供试品溶液制备方法考察

(1)提取溶剂考察

本次实验研究主要考察了不同溶剂对蔓荆子药材指纹图谱的影响，选取甲醇、70％甲醇、50％甲醇、乙醇、50％乙醇作为提取溶剂(均为体积浓度，以水为基质)，计算20个特征峰的“总峰面积/称样量”来比较不同提取溶剂对蔓荆子药材指纹图谱的影响，选择最佳提取溶剂。

取蔓荆子药材粉末(G036)(过三号筛)适量，取约0.5g，精密称定，平行6份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、70％甲醇、50％甲醇、乙醇、50％乙醇25mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，分别用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按照2.1项中的色谱条件进样测定，实验结果见表3、图1：

表3蔓荆子药材指纹图谱峰结果(不同提取溶剂考察)

实验结果：不同提取溶剂对蔓荆子药材特征峰的个数及峰型影响较大，当使用70％甲醇为提取溶剂时，色谱图中各特征峰的峰型较好，且响应值较高，“总峰面积/称样量”较大，因此，最终选取70％甲醇作为提取溶剂。

(2)提取方式考察

本次实验研究主要考察了不同提取方式对蔓荆子药材指纹图谱的影响，主要考察加热回流和超声处理两种提取方式，计算20个特征峰的“总峰面积/称样量”来比较不同提取方式对蔓荆子药材指纹图谱的影响。

取蔓荆子药材粉末(G036)(过三号筛)适量，取约0.5g，精密称定，平行2份，置具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为70％的甲醇水溶液25mL，称定重量，分别超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟、加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用体积浓度为70％的甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

按照2.1项中的色谱条件进样测定，实验结果见表4、图2：

表4蔓荆子药材指纹图谱峰结果(不同提取方式考察)

实验结果：比较超声处理与加热回流两种提取方式，结果显示加热回流提取效率较佳，20个特征峰的“总峰面积/称样量”较大；因此，选择采用加热回流作为提取方式。

(3)提取时间考察

本次实验研究主要考察了不同回流时间对蔓荆子药材指纹图谱的影响，计算20个特征峰的“总峰面积/称样量”来比较不同回流时间对蔓荆子药材指纹图谱的影响。

取蔓荆子药材(G036)粉末(过三号筛)适量，取约0.5g，精密称定，平行3份，置具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为70％的甲醇水溶液25mL，称定重量，分别加热回流15分钟、30分钟、60分钟，放冷，再称定重量，用体积浓度为70％的甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按照2.1项中的色谱条件进样测定，实验结果见表5、图3：

表5蔓荆子药材指纹图谱峰结果(不同提取时间考察)

实验结果表明，不同提取时间“总峰面积/称样量”有一定差异，30分钟与60分钟提取效率相当且较佳，说明30分钟时已经提取完全，故选择提取时间为30分钟。

(4)供试品溶液制备方法的确定

取蔓荆子药材粉末(过三号筛)适量，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为70％的甲醇水溶液25mL，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用体积浓度为70％的甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4指纹图谱测定

2.4.1特征峰的确定

取蔓荆子对照药材及19批蔓荆子药材，按2.1项中的色谱条件与2.3项中的供试品溶液制备方法，进样测定，得到蔓荆子对照药材指纹图谱如图4所示，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》，按平均数法(或中位数法)生成对照图谱，建立蔓荆子药材对照指纹图谱，如图5。对19批蔓荆子药材进行共有峰标识，选择与蔓荆子对照药材保留时间相一致的20个共有峰作为蔓荆子药材指纹图谱的特征峰，如图6所示，并与蔓荆子药材对照指纹图谱中的20个特征峰保留时间相对应。

2.4.2指纹图谱的对照品指认和3D光谱确认

采用对照品保留时间比对和紫外-可见光3D光谱对蔓荆子中的部分特征峰进行指认和确证，结果见图7～图14所示。

由实验结果可看出，在蔓荆子指纹图谱中能找到与原儿茶酸对照品、4-羟基苯甲酸对照品、绿原酸对照品、香草酸对照品、异牡荆苷对照品、穗花牡荆苷对照品和蔓荆子黄素对照品保留时间一致的特征峰，且UV吸收光谱一致，确定峰1为原儿茶酸，峰2为4-羟基苯甲酸、峰3为绿原酸、峰4为香草酸、峰7为异牡荆苷、峰9为穗花牡荆苷、峰17为蔓荆子黄素。

2.4.3特征峰的质谱指认

按照2.1项的液相色谱条件，采用高分辨质谱指认法对蔓荆子的指纹图谱中各色谱峰进行指认研究。

仪器：Thermo Vanquish Flex超高效液相-Thermo Fisher QE高分辨质谱联用仪(赛默飞公司)；超纯水系统(Milli-Q Direct，默克股份有限公司)；万分之一天平(ME204E，梅特勒-托利多公司)；数控超声波清洗器(KQ-500DE，昆山市超声仪器有限公司)。

试剂、试药：甲醇(色谱纯，默克股份有限公司)；乙腈(色谱纯，默克股份有限公司)；甲酸(LC-MS级，≥98.0％，批号：A8310050，CNW)；水为自制超纯水；其它试剂均为分析纯。

液相-质谱色谱条件：采用Waters CORTECS T3 C18柱(150mm×2.1mm，1.6μm)；以乙腈为流动相A，以体积浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相B，按表6中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3mL；柱温为35℃；检测波长为210nm。按表7中的规定进行质谱检测。

表6梯度洗脱表

表7质谱参数表

化合物的指认：采用上述液相色谱和质谱分析条件，对供试品溶液进行检测。其中通过对照品液相色谱保留时间比对以及质谱精确分子量、碎片离子对比分析，确认了蔓荆子指纹图谱中原儿茶酸(峰1)、4-羟基苯甲酸(峰2)、绿原酸(峰3)、香草酸(峰4)、异荭草苷(峰7)、穗花牡荆苷(峰9)及蔓荆子黄素(峰17)，供试品溶液总离子流图及紫外吸收色谱图见图15，化合物信息见表8。

表8蔓荆子中化合物质谱指认结果

2.4.4专属性考察

精密吸取蔓荆子药材(G036)供试品溶液、对照品溶液与空白溶剂(即体积浓度为70％的甲醇水溶液)各2μL，注入液相色谱仪，按照2.1项中的色谱条件进行分析，结果见图16。

2.4.5峰纯度考察

精密吸取蔓荆子药材(G036)供试品溶液2μL，注入液相色谱仪，按照2.1项中的色谱条件以PDA检测器进行200nm～400nm扫描检测，计算峰纯度。结果见图17、图18。峰纯度因子在计算出的阈值限值内，说明在该色谱条件下，异荭草苷和蔓荆子黄素峰纯度符合要求。

2.4.6精密度考察

精密吸取蔓荆子药材(G036)供试品溶液，按照2.1项中的色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，各主要成分相对峰面积的RSD为0.16％～0.85％，相对保留时间的RSD为0.03％～0.26％，表明该方法精密度良好。

2.4.7稳定性考察

精密吸取蔓荆子药材(G036)供试品溶液，按照2.1项中的色谱条件分别在0、2、4、6、8、10、12小时进样测定，记录峰面积。结果，各主要成分相对峰面积的RSD为0.13％～1.58％，相对保留时间的RSD为0.02％～0.17％，表明该方法精密度良好。

2.4.8重复性考察

取同一批蔓荆子样品(G036)6份，每份约0.5g，分别2.3项中确定的方法制备供试品溶液，再2.1项中的色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，各主要成分相对峰面积的RSD为0.36％～1.68％，相对保留时间的RSD为0.03％～0.22％，表明该方法重复性良好。

2.4.9指纹图谱测定结果

分别将19批蔓荆子药材UPLC指纹图谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)选择时间窗宽度为0.1，平均数法生成对照指纹图谱，计算指纹图谱的相似度。结果见表9。结果显示，蔓荆子药材相似度均大于0.900。

表9、19批蔓荆子药材指纹图谱相似度评价结果

2.5多指标含量测定

蔓荆子的化学成分主要包括挥发油类、双萜类化合物、黄酮类、氨基酸、脂肪酸类等，其中异荭草苷、蔓荆子黄素是蔓荆子的主要成分，且中国药典以蔓荆子黄素为蔓荆子的含量测定指标，基于此，对异荭草苷、蔓荆子黄素进行多指标含量测定，以实现评价蔓荆子的质量的目的。

2.5.1线性关系考察

精密称定异荭草苷对照品7.686mg、蔓荆子黄素对照品10.224mg于25mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每1mL含异荭草苷288.9936μg、蔓荆子黄素407.7331μg的贮备液。

分别精密量取上述对照品混标贮备液0.1mL，0.2mL，0.5mL，1mL，2mL，5mL于10mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密吸取上述对照品溶液及对照品贮备液10μL，按照2.1项中色谱条件进样测定，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标(y)，对照品进样浓度为横坐标(x)，见表10。

表10、2个化合物的回归方程及线性范围

2.5.2重复性考察

取蔓荆子药材粉末(G036)(过三号筛)适量，取约0.5g，平行6份，精密称定，按2.3项确定的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，按2.1项的色谱条件测定，测定供试品溶液中异荭草苷、蔓荆子黄素含量，测定结果见表11。

表11重复性考察结果

实验结果，同一批样品重复测定6次，异荭草苷含量RSD值为2.50％，蔓荆子黄素含量RSD值为0.92％，RSD小于3.0％，表明该分析方法的重复性良好。

2.5.3加样回收率考察

取已测定含量的蔓荆子药材粉末(G036)(过三号筛)约0.25g，精密称定，平行称定3组，每组3份，按蔓荆子黄素或异荭草苷对照品与样品含量比例为1:0.5，1:1，1:1.5加入蔓荆子黄素或异荭草苷对照品，按2.3项确定的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液9份，按2.1项的色谱条件进样测定，计算回收率。实验结果表明，蔓荆子黄素平均加样回收率为97.66％，RSD值为2.00％；异荭草苷平均加样回收率为99.62％，RSD值为2.65％，准确度良好。结果见表12。

表12、蔓荆子药材蔓荆子黄素和异荭草苷加样回收率考察结果表(n＝9)

2.5.4含量测定结果

取蔓荆子药材粉末(过三号筛)，按照2.3项确定的供试品制备方法制备供试品溶液，按2.1项的色谱条件进行测定分析，采用外标法计算异荭草苷和蔓荆子黄素的含量(见表13、图19)。结果如下：

表13、19批蔓荆子药材含量测定结果

结果分析与讨论：结果显示，异荭草苷平均含量为1.336mg/g，蔓荆子黄素平均含量为1.457mg/g。数据显示，不同产地间蔓荆子药材的含量存在一定差异，异荭草苷含量波动范围为0.661mg/g～2.269mg/g，蔓荆子黄素含量波动范围为0.449mg/g～2.431mg/g。

实施例2

实施例1构建的指纹图谱以及蔓荆子药材中黄酮类成分的含量检测方法也适用于蔓荆子标准汤剂和蔓荆子配方颗粒。具体如下：

蔓荆子标准汤剂供试品溶液，其制备方法包括如下步骤：取本品适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为70％的甲醇水溶液25mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，用体积浓度为70％的甲醇水溶液补足减失的重量，放冷摇匀，滤过，取续滤液，即得。

蔓荆子中药配方颗粒供试品溶液，其制备方法包括如下步骤：取本品适量，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为70％的甲醇水溶液25mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用体积浓度为70％的甲醇水溶液补足减失的重量，过滤，取续滤液，即得。

(1)含量测定：色谱条件同实施例1中2.1项，测得对应药材批次(YG008、YG009和YG010)所得的标准汤剂的含量如下表14所示，中药配方颗粒的含量如下表15所示：

表14、3批蔓荆子药材对应标准汤剂含量测定结果表

表15、3批蔓荆子药材对应配方颗粒含量测定结果表

(2)指纹图谱：

色谱条件同实施例1中的2.1”，测得YG008、YG009、YG010药材制得的标准汤剂、中药配方颗粒的指纹图谱如图20和21所示。将YG008、YG009、YG010药材的指纹图谱、YG008、YG009、YG010药材制得的标准汤剂、中药配方颗粒的指纹图谱汇总如图22可知，标准汤剂和中药配方颗粒色谱峰与待测药材一致，量值传递过程均一致。说明中药配方颗粒、标准汤剂与药材物质基础一致，与药材“形不同，但质相同”，其相似度见表16，结果显示，相似度均大于0.900。

表16、蔓荆子药材-标准汤剂-配方颗粒相似度评价结果

对比例1

(1)不同流动相B的对比考察

按照实施例1中2.3项下制备供试品溶液，除流动相B分别选取0.1％甲酸溶液、0.1％乙酸溶液、0.1％磷酸溶液三种流动相(均为体积浓度，以水为基质)进行比较外，其余条件均按实施例1中2.1项下色谱条件进行测定分析，对比不同类型的流动相。结果如图23，发现选取0.1％磷酸溶液作为水相时，峰的信息较完整，分离度较好，基线平稳，响应值较高。

(2)不同浓度流动相B的对比

按照实施例1中2.3项下制备供试品溶液，除流动相B分别选取水、0.05％磷酸溶液、0.1％磷酸溶液、0.2％磷酸溶液三种流动相(均为体积浓度，以水为基质)进行比较外，其余条件均按实施例1中2.1项下色谱条件进行测定分析，对比不同类型的流动相。结果如图24，发现选取0.1％磷酸溶液作为水相时，峰的信息较完整，分离度较好，基线平稳，响应值较高。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。