三阴性乳腺癌免疫治疗疗效预测标志物CCL19的检测方法

摘要

三阴性乳腺癌免疫治疗疗效预测标志物CCL19的检测方法。本发明提供了CCL19作为标志物在制备乳腺癌免疫治疗疗效和/或预后预测产品中的应用。还提供了包括CCL19蛋白检测试剂和任选地说明书的三阴性乳腺癌免疫治疗疗效和预后预测试剂盒。还提供了CCL19分子联合第二治疗剂在制备抗肿瘤药物中的应用。极大地填补了三阴性乳腺癌免疫治疗疗效预测液体活检的空缺，无创、快速、低成本地实现了精准预测免疫治疗疗效。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及CCL19作为标志物在制备乳腺癌免疫治疗疗效和/或预后预测产品中的应用。

背景技术

三阴性乳腺癌(TNBC)是指一类雌激素(ER)，孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER2)的表达均为阴性的乳腺癌，占到全体乳腺癌的15％-20％。相比于激素受体阳性的乳腺癌患者，TNBC患者往往发病年龄小，较易发生内脏转移，有较高的术后复发风险及较差的预后，是临床治疗的难点。

由于TNBC缺乏关键受体的表达，患者无法从靶向治疗中获益。免疫治疗的出现给TNBC治疗带来了突破性进展。免疫治疗主要包括疫苗、免疫检查点抑制剂(ICI)治疗、过继性免疫细胞治疗、细胞因子治疗等，其中ICI治疗凭借其显著的临床疗效而备受瞩目。IMpassion130试验证明抗PD-L1单克隆抗体阿特珠单抗联合白蛋白紫杉醇一线治疗可显著延长不可切除、局部晚期或转移性TNBC患者的无转移生存期。随后，KERNOTE-355试验也显示抗PD-1单克隆抗体帕博利珠单抗与化疗联用可作为局部复发性不可切除或转移性TNBC患者的一线用药，显着降低了患者疾病进展或死亡的风险。

ICI治疗已使越来越多的患者获益，但只有一部分患者对ICI治疗敏感，筛选出可预测ICI治疗效果的生物标志物是临床中的艰巨挑战。目前比较常用的ICI疗效预测生物标志物包括PD-1/PD-L1表达、微卫星不稳定、错配基因修复缺失、肿瘤突变负荷、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)等。然而，目前提出的免疫治疗疗效生物标志物的预测效果不佳，且大多基于高通量测序，无法在临床中普及。现有的PD-1试剂盒和PD-L1试剂盒方便快速，但准确率低，不能很好地识别免疫治疗获益患者。因此，亟需一种可应用于临床的预测乳腺癌免疫治疗疗效的生物标志物，对任意一位乳腺癌患者，能够简便、高效、准确地进行免疫治疗疗效预测，辅助精准治疗决策。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明第一方面提供了CCL19作为标志物在制备乳腺癌免疫治疗疗效和/或预后预测产品中的应用。

在某些实施方式中，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。

在某些实施方式中，所述疗效和/或预后预测产品通过检测被试者血液或肿瘤组织中的CCL19表达来进行疗效预测。

在某些实施方式中，所述检测为通过ELISA检测血清中CCL19蛋白表达水平；血清中CCL19高水平的患者对免疫治疗敏感，低水平的患者对免疫治疗耐药；优选地，CCL19水平以29.84pg/ml为分界点。当CCL19>29.84pg/ml时，定义为高水平，提示免疫治疗敏感；当CCL19≤29.84pg/ml时，定义为低水平，提示免疫治疗耐药。

在某些实施方式中，所述检测为通过免疫组化检测组织中CCL19蛋白表达水平；CCL19染色阳性时，提示免疫治疗敏感；CCL19染色阴性时，提示免疫治疗耐药。

本发明第二方面提供了一种乳腺癌免疫治疗疗效和/或预后预测试剂盒，所述试剂盒包括CCL19蛋白检测试剂和任选的说明书。优选地，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。

在某些实施方式中，所述检测试剂为CCL19抗体。

本发明第三方面提供了CCL19分子联合第二治疗剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

在某些实施方式中，所述肿瘤为乳腺癌，优选为三阴性乳腺癌。

在某些实施方式中，所述第二治疗剂包括抗PD-1单克隆抗体、抗PD-L1单克隆抗体。

本发明第四方面提供了一种药物组合物，其包括CCL19分子和第二治疗剂。

在某些实施方式中，所述组合物用于肿瘤治疗，优选的所述肿瘤为乳腺癌，进一步优选的所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。

在某些实施方式中，所述第二治疗剂包括PD-1单克隆抗体、PD-L1单克隆抗体。

在某些实施方式中，所述CCL19和第二治疗剂可以同时或先后施用。

本发明的有益效果是：

本发明首次发现了新型ICI治疗生物标志物CCL19；通过血清水平检测和免疫组化检测两种方式表征CCL19水平，并在多个维度和多个外部队列中进行了验证；极大地填补了TNBC免疫治疗疗效预测液体活检的空缺，无创、快速、低成本地实现了精准预测免疫治疗疗效。本发明为TNBC免疫治疗的进一步发展和深入提供了临床基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1显示通过乳腺癌树突状细胞(dendritic cell，DC)单细胞图谱鉴定DC细胞亚群的结果。图1A，基于Biokey乳腺癌免疫治疗队列单细胞数据，将DC细胞分为4个主要亚群；图1B，DC亚群聚类热图及分子标志物，其中亚群1主要标记为CLEC9A，亚群2主要标记为CLEC10A，亚群3主要标记为CCL19，亚群4主要标记为LILRA4。

图2显示通过单细胞图谱揭示与免疫治疗反应高度相关的DC亚群的结果。图2A，各DC亚群浸润比例高低与患者治疗反应的关系；图2B，DC亚群3浸润与既往研究发现提示免疫治疗获益的CD8

图3显示外部独立队列验证CCL19

图4显示通过Biokey队列单细胞分析验证CCL19

图5GSE169246队列单细胞分析验证CCL19

图6显示CCL19

图7显示通过TNBC组织芯片双重免疫组化染色展示CCL19

图8显示Kaplan-Meier生存分析提示CCL19

图9显示Cox分析提示CCL19

图10显示CCL19

图11显示CCL19

图12显示通过基因集富集分析CCL19

图13CCL19与不同免疫细胞的相关性和在不同免疫细胞中的表达比例。图13A，使用FUSCC队列RNA-seq队列，通过CIBERSORTx算法计算22种免疫细胞浸润情况，相关性分析提示CCL19分子与CCL19

图14显示CCL19高表达患者生存分析。图14A，FUSCC队列中，CCL19高表达提示患者较好的总体生存、无复发生存；图14B，PostgreSQL队列中，CCL19高表达提示患者更好的总体生存、无复发生存。

图15显示通过Cox分析提示CCL19是TNBC患者的独立预后因素。使用186例TNBC组织芯片，免疫组织化学染色评估CCL19表达情况，使用单因素、多因素Cox回归分析，纳入年龄、肿瘤大小、转移淋巴结个数、Ki67增殖指数、CCL19表达情况，发现CCL19提示患者较好的无复发生存，是TNBC患者独立的预后因素。

图16显示CCL19表达与免疫治疗标志物正相关，并且提示小鼠乳腺癌原位成瘤模型免疫治疗敏感。图16A，FUSCC队列中，CCL19与sTIL、PD-1、PD-L1、CD8A、CXCL9、CD68的相关性，数值表示相关性分析R值；图16B，GSE124821队列中，体内实验使用免疫治疗，治疗敏感的组别相较于不敏感的组别中Ccl19水平显著较高。

图17显示小鼠乳腺癌原位成瘤模型使用CCL19增敏PD-1抗体疗效。使用4T1小鼠TNBC细胞系对BALB/c小鼠原位成瘤，共分为4组，分别使用对照、抗PD-1单克隆抗体、CCL19、联合治疗，观察肿瘤生长曲线，结束实验后统计肿瘤重量。

图18显示小鼠模型各实验组免疫细胞占比对比。使用流式细胞分析各组肿瘤中CD4

图19显示患者CCL19血清水平较高提示免疫治疗获益。在FUTURE临床试验中，纳入18例接受免疫治疗的患者，并且同时有检测基线状态血清CCL19浓度与疗效数据的患者，CCL19浓度以29.84pg/ml为界，比较临床缓解与临床未缓解患者的CCL19基线水平、CCL19基线水平与患者客观缓解率、免疫治疗前后血清CCL19的浓度变化。

图20显示患者血清CCL19临界值浓度选取预测免疫治疗疗效的准确程度。图20A，FUTURE队列中，不同血清CCL19水平作为阈值预测免疫治疗疗效的灵敏度、特异度和约登指数；图20B，利用血清CCL19水平预测免疫治疗疗效的受试者工作特征曲线曲线及对应的曲线下面积(AUC)，提示疗效预测的准确程度。

图21显示患者CCL19组织表达较高提示免疫治疗获益。在FUTURE-C-Plus临床试验中，纳入29例接受免疫治疗，并且同时有CCL19免疫组织化学染色结果与疗效数据的患者，比较CCL19与客观缓解率、肿瘤退缩比例、PD-L1表达、无进展生存的关联。

具体实施方式

下面进一步描述本发明，本描述中介绍的实施案例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成限制。本专业技术人员应该理解的是，在不偏离本发明原理和方法的情况下，对本发明技术方案的细节和形式进行部分修改或替换，但基于此修改或替换均属于本发明的保护范围内。

术语定义

如本文中所用，术语“三阴性乳腺癌”是指雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及人表皮生长因子受体2(HER2)均阴性的乳腺癌，临床上ER、PR统称为激素受体(HR)。

如本文中所用，术语“免疫检查点阻断剂(ICI)”的基本原理是基于免疫细胞T细胞的激活机制。程序性死亡受体表达在T细胞表面，其配体表达在肿瘤细胞和髓源性抑制细胞表面。程序性死亡受体与其配体结合可使T细胞衰竭而无法正常杀伤肿瘤细胞，肿瘤细胞便可逃脱宿主的免疫监视。因此，程序性死亡受体及其配体被称为“免疫检查点”。基于程序性死亡受体及其配体的免疫检查点阻断剂通过抑制二者的结合，从而提高宿主免疫系统对肿瘤细胞的攻击性。

下面结合附图和具体实验进一步详细说明本专利。除非特别说明，本专利所用试剂、仪器、设备和方法均为本技术领域的常规市购试剂、仪器、设备和方法。

实施例1CCL19分子的发现及功能验证

树突状细胞(DC)是最主要的抗原提呈细胞，能够启动T细胞介导的免疫反应，但其在肿瘤免疫治疗中的作用尚未明确。基于单细胞测序、多组学分析、体内实验与临床试验验证，本发明鉴定了可以预测TNBC免疫治疗反应的关键DC亚群，即CCL19

1.1乳腺癌患者免疫治疗队列DC单细胞图谱分析

为了系统地揭示人类乳腺癌中DC亚群和ICI反应之间的关系，我们收集了29例经帕博利珠单抗(PD-1单克隆抗体)方案治疗的乳腺癌患者单细胞测序(scRNA-seq)数据(Biokey临床试验队列，https://ega-archive.org/studies/EGAS00001004809)，其中共包括1021个DC。通过R语言中的Seurat、PCA算法进行细胞降维聚类，使用t-SNE算法呈现，可将DC分为四个主要的亚群，并使用MAST算法中“FindAll Markers”函数定义每个亚群的特征性标记，以最显著的标记作为命名规则，分别为CLEC9A

1.2CCL19

出现T细胞克隆扩增的患者被认为可以从免疫治疗中获益，在该队列公开发表的数据中，同样包含该29例患者T细胞克隆扩增数据。实施例1.1的单细胞聚类显示，尽管总体DC和CLEC9A

治疗反应亦可通过临床评估定义。完全缓解(CR)指所有靶病灶消失，无新病灶出现，且肿瘤标志物正常，至少维持4周。部分缓解(PR)指靶病灶最大径之和减少≥30％，至少维持4周。疾病进展(PD)指靶病灶最大径之和至少增加≥20％，或出现新病灶。疾病稳定(SD)指靶病灶最大径之和缩小未达PR，或增大未达PD。为了验证CCL19

综上，CCL19

1.3乳腺癌中CCL19

为了进一步证实CCL19

进一步，我们通过流式细胞术(图6A)、组学分析(图6B-C)和免疫组织化学染色(图7)验证了CCL19

1.4CCL19

在上述87个新鲜乳腺癌样本(图6A)以及TCGA队列(图6B)中，我们均观察到CCL19

表1 CCL19

我们进一步发现，CCL19

综上，我们发现CCL19

1.5CCL19提示TNBC患者较好预后以及ICI治疗获益

在揭示了CCL19

进一步，我们在患者水平探索CCL19水平与TNBC临床特征的关系，高表达CCL19的患者肿瘤更小、具有更高的TIL浸润(表2)。与此同时，CCL19高表达提示TNBC患者较好的总生存率和无复发生存(图14)。通过多变量Cox分析排除年龄、肿瘤大小、淋巴结状态和Ki67分数的混杂变量后，发现CCL19

表2 CCL19表达水平与乳腺癌患者临床病理特征的关系

为了更好地探索CCL19对免疫治疗疗效的预测能力，我们使用FUSCC队列中的RNA-seq数据(共360例)与免疫组织化学染色(共186例)对CCL19与已有报道证实有效的ICI疗效预测标志物进行Spearman相关性分析，发现无论是在mRNA还是蛋白水平，CCL19与包括瘤间TIL(sTIL)、PD-1、PD-L1、CD8A、CXCL9、CD68在内的指标均呈现明显的正相关(图16A)。此外，我们收集了47个使用免疫治疗的TNBC体内模型RNA-seq数据(GSE124821，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc＝GSE124821)，发现CCL19在免疫治疗敏感样本中的表达明显高于免疫治疗不敏感样本(图16B)。

综上，CCL19分子可作为CCL19

1.6CCL19可以作为TNBC患者联合免疫治疗靶点

为进一步证实CCL19的免疫激活作用，我们检测了对小鼠TNBC原位成瘤模型给予CCL19联合免疫检查点抑制剂的治疗效果。动物实验按照FUSCC研究伦理委员会批准的实验方案进行，实验小鼠购自上海吉辉实验动物有限公司，在保证动物伦理的条件下进行后续实验。我们将3×10

实验证实，联合治疗可显著提高TNBC免疫治疗疗效。单独注射CCL19即可显著抑制肿瘤生长，而联合使用CCL19和PD-1单克隆抗体可进一步抑制肿瘤生长(图17)。此外，鼠源CCL19和PD-1单克隆抗体联合治疗显著诱导了免疫应答，促进CD4

综上，补充CCL19可以有效增敏PD-1单克隆抗体疗效。

实施例2 TNBC患者治疗前外周血血清CCL19水平作为ICI疗效预测标志物

用ELISA试剂盒检测转移性TNBC患者接受免疫治疗前血清的CCL19水平，发现治疗前血清CCL19表达水平可以预测患者免疫治疗获益。具体的验证流程包括以下几个步骤：

1)研究队列

我们收集了在FUTURE临床试验(国际注册号NCT03805399)中共18例接受含卡瑞利珠单抗(PD-1单克隆抗体)方案治疗的转移性TNBC患者治疗前后的血清，利用ELISA试剂盒(Abcam，货号ab100601)检测了患者血清CCL19水平(图19)。免疫反应评估可分为临床缓解(CR与PR之和)和临床未缓解(PD与SD之和)。获得临床缓解的患者治疗前的血清CCL19浓度明显高于临床未缓解的患者，并且，治疗前CCL19血清水平较高的患者获得临床缓解的概率更高。同时，我们也发现在经过免疫治疗后，患者血清CCL19的水平明显升高，证明其免疫激活表型。值得注意的是，在经过更多前期治疗的患者其CCL19水平具有更高的趋势，说明其也可以应用于转移性乳腺癌患者中，具有广泛应用潜力。

2)定义血清CCL19的界值

我们统计了血清CCL19其预测免疫治疗疗效的约登指数(敏感度+特异度-1)，从而选取最优的CCL19界值。敏感度越高，漏诊病例越少；而1-特异度越低，误诊率越少。因此，约登指数最大时的取值即为最佳临界值(图20A)。在受试者工作曲线中，最佳临界点即为最靠近左上角的一点。计算得出，CCL19以29.84pg/ml为分界点时预测效果最佳(图20B)。当CCL19>29.84pg/ml时，定义为高水平，免疫治疗敏感；当CCL19≤29.84pg/ml时，定义为低水平，免疫治疗耐药。在FUTURE临床试验中，CCL19<29.84pg/ml时，患者均未达到缓解；CCL19＞29.84pg/ml时，93.3％的患者达到疾病缓解，预测效果良好(图19)。

这些结果验证了外周血CCL19水平可以作为生物标志物，预测转移性TNBC患者ICI疗效，具有临床应用价值。

实施例3 TNBC患者治疗前肿瘤组织石蜡切片免疫组织化学染色检测CCL19作为ICI疗效预测标志物

用免疫组织化学检测转移性TNBC患者接受免疫治疗前组织的CCL19水平，发现治疗前肿瘤组织CCL19表达水平可以预测患者免疫治疗获益。

我们收集了FUTURE-C-Plus临床试验(国际注册号NCT04129996)中30例以卡瑞利珠单抗为基础方案治疗的晚期TNBC患者的治疗前石蜡切片，使用CCL19抗体(Sigma，货号HPA067758，稀释倍数1：200)，进行免疫组织化学染色(实验平台为Ventana BenchmarkULTRA检测系统)，定义CCL19阳性细胞/全体细胞≥1％为CCL19阳性，评估其与患者疗效的关系。在29例有反应数据的患者中，我们观察到CCL19阳性患者有更多的疾病缓解、更高的PD-L1比例和更长的疾病无进展生存期(图21)。CCL19阴性时，仅73.3％的患者达到疾病缓解；CCL19阳性时，所有患者均达到疾病缓解(图21)。

这些结果验证了肿瘤组织的CCL19水平可以作为生物标志物，预测转移性TNBC患者ICI疗效，具有临床应用价值。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。