香蕉枯萎病菌4号生理小种chitin synthase 6基因的用途

摘要

本发明公开了香蕉枯萎病菌4号生理小种chitin synthase 6基因的用途。具体提出香蕉枯萎病菌4号生理小种CHS6基因在病原菌抗药性、致病性及厚垣孢子形成过程中的应用。CHS6基因可以提高病原菌致病力，以及调控厚垣孢子的形成。本发明研究成果可为香蕉枯萎病菌对氰烯菌酯类杀菌剂的抗药性及其致病机制的研究提供依据。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及香蕉枯萎病菌4号生理小种chitinsynthase 6基因的用途。

背景技术

香蕉枯萎病是破坏香蕉维管束导致植株死亡的毁灭性土传病害，其病原菌为尖孢镰刀菌古巴转化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense，Foc)，其中4号生理小种(Foc4)是致病力最强的小种；Foc4腐生能力很强，在土壤中可长期存活，属于典型的潜伏性侵染。香蕉枯萎病对全球香蕉产业和香蕉种植者造成严重危害和巨大的经济损失，具有广泛影响并引起普遍关注，但目前尚无有效的防治措施。

几丁质广泛存在于致病真菌的细胞壁，是真菌细胞壁的必需成分。几丁质合成酶(chitin synthase,CHS)是几丁质生物合成中的关键酶。CHS数量很多，不同种类的CHS可能在不同的真菌中起不同的作用。CHS相关生物学功能研究主要集中在稻瘟病菌和玉米黑粉病菌等模式菌株中，香蕉枯萎病菌还缺乏相关的研究。关于香蕉枯萎病菌CHS6基因对杀菌剂敏感性以及在枯萎菌致病过程中的作用尚无相关文献报道。

香蕉枯萎病菌可产生3种类型的孢子，包括厚垣孢子、小型分生孢子和大型分生孢子，其中厚垣孢子是寄主植物发病的最初侵染源，在病害循环中起着关键作用。尖孢镰刀菌古巴专化型厚垣孢子的形成机制尚无报道，甚至丝状真菌中厚垣孢子形成机制的报道也较少，仅Ohara&Tsuge报道尖孢镰刀菌甜瓜专化型(F.oxysporum f.sp.melonis)的FoSTUA基因在一定程度上能抑制厚垣孢子的形成。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明利用同源重组的方法获得Δchs6敲除突变体，通过与原始菌株在氰烯菌酯敏感性、致病力以及厚垣孢子数量等方面进行比较，明确了香蕉枯萎病菌4号生理小种CHS6基因(FOIG_06735)在抗药性、病原菌致病性及厚垣孢子形成过程中的作用。基于本发明的研究成果，本申请提出一种香蕉枯萎病菌4号生理小种chitinsynthase 6基因的用途。

本发明主要涉及以下几个方面的内容：

一方面，本发明提供一种香蕉枯萎病菌4号生理小种chitin synthase 6基因在调控病原菌致病力方面的用途。

进一步的，所述调控指的是正调控。

进一步的，本发明提供所述chitin synthase 6基因在调控厚垣孢子的形成以提高病原菌的致病力方面的用途。

另一方面，本发明还构建了香蕉枯萎病菌4号生理小种chitin synthase 6基因敲除突变体，并提供所述突变体在负调控病原菌致病力方面的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明明确了香蕉枯萎病菌4号生理小种CHS6基因在抗药性、病原菌致病性及厚垣孢子形成过程中的作用。研究结果显示，CHS6基因可以提高病原菌致病力，以及调控厚垣孢子的形成。

本发明研究成果可为香蕉枯萎病菌对氰烯菌酯类杀菌剂的抗药性及其致病机制的研究提供依据。

附图说明

图1-A：香蕉枯萎病菌CHS6的蛋白功能结构域分析结果图。

图1-B：Split-marker同源重组敲除CHS6基因示意图。

图1-C：Δchs6突变体分别通过扩增上下游重组片段、内源基因以及载体HYG基因验证阳性转化子电泳图。上图标示PCR扩增上下游重组片段验证Δchs6敲除突变体：1，上游重组片段扩增，3500bp；2，下游重组片段扩增，2492bp；以Foc4和H

图1-D：Southern blot印记分析结果图。

图1-E：pYF11回补载体pYF11-CHS6构建过程示意图。

图1-F：原生质体转化后的回补菌株PCR检测图。Crossover是启动子区引物crossover-2648F与CHS6的inside-R交叉PCR检测，inside检测CHS6内源基因，GFP检测pYF11载体上GFP序列，NEO检测回补抗性基因。

图2-A：Foc4野生型菌株、Δchs6和Δchs6-C在MM平板上的菌落生长图；

图2-B：Foc4野生型菌株、Δchs6和Δchs6-C生长变化曲线图。

图3-A：Foc4野生型菌株和Δchs6氰烯菌酯处理下的菌丝形态显微图。

图3-B：CHS6基因在氰烯菌酯处理后基因下调表达情况统计图。

图4-A：Foc4野生型菌株和Δchs6在不同浓度氰烯菌酯的MM平板上的菌落生长图。

图4-B：Foc4野生型菌株和Δchs6对氰烯菌酯的剂量反应曲线；

图4-C：Foc4和Δchs6对氰烯菌酯的抑制中EC50浓度测定。

图5：Δchs6突变体在不同胁迫因子的MM平板上生长7天的菌落生长图。

图6-A：Foc4野生型菌株、Δchs6和Δchs6-C菌株侵染巴西蕉的球茎症状图。

图6-B：Foc4野生型菌株、Δchs6和Δchs6-C菌株侵染巴西蕉苗的病情指数统计图。

图7-A：野生型Foc4和Δchs6突变体诱导产生的厚垣孢子显微观察图。在two-salt诱导培养基中培养4天后出现大量厚垣孢子，大部分菌丝顶端产生厚垣孢子；通过超声波破碎菌丝纯化厚垣孢子，Δchs6突变体的诱导的厚垣孢子数量和形态上都出现明显差异。

图7-B：Foc4和Δchs6突变体诱导产生的厚垣孢子数量对比图。

图7-C：Foc4和Δchs6突变体诱导产生的厚垣孢子直径差异对比图。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

实施例:

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验菌株，载体及香蕉品种

香蕉枯萎病菌4号生理小种(F.oxysporum f.sp.cubense race 4,Foc4)，由实验室鉴定保存。基因回补载体pYF11及酵母XK125菌株由南京农业大学张海峰教授提供，实验接种的香蕉品种为巴西蕉(Cavendish,AAA)。

1.1.2实验试剂

用二甲基亚砜(DMSO)将94.9％氰烯菌酯原药(中国农业大学刘西莉教授惠赠)配成100mg/mL的母液。荧光增白剂(Calcofluor white,CFW)购于Sigma-aldrich(北京)，刚果红(Gongo Red,CR)，MgCO

1.1.3培养基

PDB培养基(葡萄糖20g/L，土豆200g/L)，SR液体培养基(342g/L蔗糖,1g/L酵母浸膏,1g/L酪素酶解物),SR固体培养基(蔗糖342g/L,酵母浸膏1g/L,酪素酶解物1g/L，琼脂20g/L)，MM培养基(磷酸氢二钾2.28g/L,磷酸二氢钾1.36g/L，硫酸铵0.53g/L，氯化钠0.15g/L，七水硫酸镁0.49g/L，二水氯化钙0.07g/L，七水硫酸铁0.0025g/L，葡萄糖1.98g/L)STC溶液(218.6g山梨醇,100mL 100mol/L Tris-Hcl(pH 7.5),6g CaCl

1.2方法

1.2.1真菌DNA的制备

采用CTAB方法提取真菌的基因组DNA。将实验室保存的Foc4野生型菌株接种到PDA平板上，28℃培养3-5天后，刮取新鲜的菌丝，按照CTAB方法提取菌丝DNA。其他突变体的DNA提取按照Foc4的操作进行。

1.2.2CHS6基因敲除片段扩增及蛋白结构域分析

利用在线蛋白功能域预测分析软件SMART(Simple Modular ArchitectureResearch Tool)(http://smart.embl.de)分析CHS6基因的功能域。

参考CHS6的基因序列(FOIG_06735)和已发布的Foc4野生株基因组序列(JH658279.1)，设计引物Foc4CHS6-LBCK和Foc4CHS6-HPH-LB-R，Foc4CHS6-HPH-LB-F和Foc4CHS6-RBCK(表1)扩增CHS6基因的上下游片段；设计HYG-F和HYG-R引物(表1)扩增验证潮霉素片段；重组上下游片段则分别通过引物Foc4CHS6-LB-F、HYG-R1和HYG-F1、Foc4CHS6-LB-R(表1)来扩增。

表1.引物序列一览表

1.2.3原生质体制备及转化

香蕉枯萎病菌原生质体制备参照王飞燕等的方法进行。PEG介导的原生质体转化参照徐齐君等的方法。以培养3天的Foc4野生株为原始菌株制备浓度为1×10

1.2.4Δchs6敲除突变体的鉴定分析

PCR鉴定分析：

分别采用Foc4CHS6-LBCK/HPT-LBCK和Foc4CHS6-RBCK/HPT-RBCK引物对CHS6上下游片段进行验证；HYG-F1/HYG-R1引物对敲除体中的潮霉素片段进行验证；Foc4CHS6-CKF/Foc4CHS6-CKR引物对敲除体内源基因进行验证(引物信息见表1)。

Southern blot分析：

取大约5μg香蕉枯萎病菌基因组DNA Hind III完全酶切后异丙醇沉淀回收后0.8％琼脂糖凝胶电泳检测转膜杂交等Southern blot杂交参照吴昊等的方法进行。Foc4CHS6-CKF/Foc4CHS6-CKR扩增Foc4基因组DNA的片段回收后地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记探针，具体的杂交步骤按照Roche DIG High Prime DNALabeling and DetectionStarter Kit I(Cat#11745832910)操作说明进行。

1.2.5敲除突变体回补实验

突变体的回补实验利用醋酸锂转化法转化酵母，具体步骤按照Alkali-Cation

参照李新瑞等的方法，取5μg pYF11质粒Xho I完全酶切后切胶回收获得。CHS6回补基因组片段由引物pYF11-CHS6-Com-1F/pYF11-CHS6-Com-6637R从Foc4基因组DNA PCR扩增后切胶回收获得，条带大小为6636bp。

在YPD平板上挑1个XK-125单菌落酵母接种于100mL YPD肉汤培养基中，摇床30℃250r/min条件下过夜培养，收集菌体后TE重悬酵母细胞，离心洗涤酵母细胞后醋酸锂溶液重悬菌体，30℃30min轻轻震荡制备酵母感受态细胞。在100μL酵母感受态细胞中依次加入5μL Carrier DNA，5μL Histamine solution，1μL pYF11 Xho I回收产物，9μL CHS6回补片段，混合后室温静置15min，然后加入0.8mL PEG and 0.2mL TE/Cation MIXX，吸打混匀后静置10min，42℃热激10min后冷却到30℃，14000rpm瞬时离心30s，吸干上清液，加入100-200μL SOS重悬细胞后均匀涂布在Trp缺陷型筛选平板(SD/-Trp)上，于30℃培养2-4天。

随后，在SD/-Trp平板上挑取单菌落菌液PCR验证后提取酵母质粒(索莱宝酵母质粒提取试剂盒，D1160)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后提取质粒，取5μg质粒转化Δchs6原生质体获取回补菌株Δchs6-C，原生质体制备以及转化筛选方法见1.2.3。

后续对Δchs6-C回补菌株的生长曲线及致病力进行分析。

1.2.6Δchs6突变体表型分析

生长特性分析：

挑选3个培养3-5天的新鲜稳定转化子和Foc4野生株，分别取5mm菌饼分别接种到无抗性的MM平板上，28℃培养，并分别在培养1、3、5、7天测量菌落直径并拍表型图。第7天观察结束后从MM平板上取少量菌丝，制成载玻片进行显微观察形态。

平板产孢量分析：

分别用10mL灭菌水将在MM板培养7天的Δchs6突变体和Foc4野生株的孢子洗到离心管中，血球计数板显微镜观察计数。摇培产孢量：取Δchs6突变体和Foc4野生株的5mm新鲜菌饼分别加入到无抗性PDB中，28℃摇床摇培7天，三层滤纸过滤后借助血球显微镜观察计数。

胁迫分析：

分别接种到含有Calcofluor White(荧光增白剂，100μg/mL)、Congo Red(刚果红，100μg/mL)、H

1.2.7Δchs6突变体对氰烯菌酯的敏感性分析

取Δchs6突变体的5mm新鲜菌饼接种到氰烯菌酯浓度为2.0μg/mL、4.0μg/mL、8.0μg/mL、15.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL、200.0μg/mL的7种MM平板上，并以Foc4野生株为对照，每个处理重复3皿，实验设3个重复，28℃培养7天，测量菌落直径分析对氰烯菌酯的敏感性。

1.2.8Δchs6突变体致病力分析

取Δchs6突变体和Foc4野生株的5mm新鲜菌饼分别接种到100mL PDB(无抗性)中，摇床28℃、150r/min摇培五天，用三层滤纸将菌丝过滤，收集分生孢子液，用无菌水将分生孢子液浓度调节到2×10

1.2.9Δchs6突变体对厚垣孢子形成的影响

参照Stevenson&Becker的方法诱导产生尖孢镰刀菌古巴专化型厚垣孢子，并稍作修改。将备用的尖孢镰刀菌古巴专化型10

2结果与分析

2.1 CHS6蛋白结构域分析及基因敲除

利用在线SMART(Simple Modular Architecture Research Tool)软件分析CHS6基因蛋白功能域，结果显示，香蕉枯萎病菌CHS6除了含有典型的几丁质合成酶功能域CSD(chitin synthase domain)外，还含有MMD功能域(myosin motor domain)、细胞色素b5结合域(cytochrome b5-like heme/steroid binding domain,Cyt-b5)和多个跨膜结构域TM(transmembrane domains)(图1-A)。

突变体的PCR验证，用Foc4CHS6-LBCK/HPT-LBCK、Foc4CHS6-RBCK/HPT-RBCK两对引物扩增检测，阳性敲除转化子扩增出3500bp的上游重组片段和2492bp的下游重组片段，而空白对照ddH

随后，内源基因检测引物Foc4CHS6-CKF/Foc4CHS6-CKR扩增的PCR条带回收变性后标记成DIG-DNA探针用于DNA杂交分析。利用Hind III分别将野生型Foc4和Δchs6敲除突变体基因组DNA进行酶切后电泳转膜后Southern blot分析，结果显示Foc4中可以杂交出CHS6特异性条带，而Δchs6敲除突变体则无杂交条带，说明CHS6基因被敲除了(图1-D)。

综合以上结果说明，转化子中CHS6基因被证实敲除，并随机选其中的Δchs6-1完成后续表型分析试验。

2.2Δchs6敲除突变体生长特性分析

将Foc4野生型和Δchs6突变体菌株接种于MM培养基上，经过七天的定期测量菌落直径大小，结果显示，Δchs6突变体的菌丝变粗，节间缩短，气生菌丝减少，菌落平滑，而野生菌株气生菌丝多，菌落绒毛状(图2-A，图3-A)。Δchs6突变体生长速度略慢于野生株的生长速度(图2-B)。

2.3Δchs6突变体菌丝形态及产孢量分析

在光学显微镜下对比观察结果显示，与野生株对比，Δchs6突变体的菌丝呈现不规则扭曲，不规则分支增多，且分支处呈现的弧状，而不是Foc4典型的角状；氰烯菌酯处理后的Δchs6突变体菌丝分叉多，节间缩短，菌丝膨大皱缩，出现典型的膨大球状体结构，而野生株则无明显差异(图3-A)。随着氰烯菌酯处理浓度的增加，CHS6的表达量逐步下调，说明CHS6响应氰烯菌酯的胁迫，表达量出现显著差异(图3-B)。

分别通过两种方式评估对比野生株和突变体的产孢量。平板菌落产孢量结果显示Δchs6突变体为5.59×10

2.4Δchs6敲除突变体对氰烯菌酯的敏感性测定分析

将Foc4野生型菌株和Δchs6突变体菌株分别接种到含有不同浓度氰烯菌酯的MM平板中，测定Δchs6突变体菌株对氰烯菌酯敏感性，分析菌落在不同浓度下的生长抑制率，计算抑制中浓度EC

2.5Δchs6突变体对胁迫因子的敏感性分析

在含有5mmol/L H

2.6Δchs6突变体致病力分析

将Foc4野生株和Δchs6突变体的孢子悬液分别接种到健康巴西苗，60天后观察接种的巴西苗的叶片症状以及球茎褐化情况。以H

统计发病植株的病情指数结果显示，Foc4野生株为53.75，Δchs6突变体为20.42，虽然Δchs6突变体的致病力显著下降，但是突变体仍然能够致病且球茎轻微褐化，并未完全丧失致病力；回补菌株Δchs6-C的致病力与野生型基本一致(图6-B)。

2.7Δchs6突变体对厚垣孢子形成的影响

Foc4野生株和Δchs6突变体菌丝在two-salt培养基中诱导厚垣孢子的形成。28℃黑暗静置条件培养4d后，Foc4野生菌株几乎所有的菌丝顶端产生了圆形和椭圆形的厚垣孢子，厚垣孢子大小平均直径4.74μm，厚垣孢子数量为8×10

与Foc4相比较，Δchs6突变体的菌丝诱导4天后部分菌丝顶端产生了厚垣孢子，菌丝稀疏，厚垣孢子顶端膨大，平均直径为7.23μm，厚垣孢子数量为6×10

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。