一种双菌发酵生淀粉生产乙醇的方法

摘要

本发明公开了一种双菌发酵生淀粉生产乙醇的方法，采用叶际类芽孢杆菌

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种双菌发酵生淀粉生产乙醇的方法。

背景技术

随着社会的发展，煤、石油等能源的枯竭和环境污染问题日益严重，利用可替代、环保的可再生生物质进行燃料（燃料乙醇和生物柴油等）生产已经受到人们的广泛关注。其中，燃料乙醇已发展成为全球最常用的液体生物燃料，与化石燃料相比，它可以减少30%~85%的温室气体排放，且有助于降低大气中颗粒物的形成。虽然燃料乙醇生产技术已得到快速发展，但是目前乙醇的发酵生产主要还是以玉米、木薯、高粱等淀粉质为原料。燃料乙醇以淀粉质作物为原料生产时，其工艺流程一般分为五个阶段，即淀粉质原料的糊化、液化和糖化、发酵、蒸馏、脱水。然而，用传统的发酵法生产燃料乙醇能耗高、成本高，目前价格还无法与汽油竞争。造成传统方法成本高的原因主要在蒸煮糊化工序和蒸馏工序，要消耗大量的能源。尤其是蒸煮糊化过程，其所需的热能大概占全部生产所需能耗的30%-40%，若能有效降低蒸煮糊化工序的能耗，将能极大地增强生物质燃料乙醇的竞争能力。

生料发酵是解决上述问题的最佳选择之一。生料发酵就是微生物直接利用未经过糊化的生淀粉生长繁殖及代谢的过程。利用生淀粉进行酒精发酵可以将传统工艺中的糊化、液化和糖化合并为一步直接进行糖化，省去了高温蒸煮糊化工艺，避免了高温条件下可发酵性糖的损失，同时不需要蒸煮和糖化设备，因而具有降低能耗、简化操作工序、降低生产成本等优点，具有巨大的节能前景。在当前酒精行业竞争日益激烈的情况下，采用无蒸煮酒精发酵新工艺是降低生产成本，增强竞争力的有效途径。

发明内容

本发明目的在于提供一株能水解生淀粉的叶际类芽孢杆菌与休哈塔假丝酵母共同发酵生淀粉生产乙醇的方法，首先利用叶际类芽孢杆菌

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种双菌发酵生淀粉生产乙醇的方法，采用叶际类芽孢杆菌

S1. 将

S2. 将休哈塔假丝酵母接种至固体平板培养基上，将固体平板培养基置于28-32℃恒温培养箱中培养2-4天，用接种环从固体平板培养基上挑取单菌落至液体种子培养基中，于28-32℃，100-200rpm下摇床培养22-26小时作为种子液备用；

S3. 将S1中培养好的叶际类芽孢杆菌种子液接入生淀粉发酵培养基中得发酵液，所述发酵液中的种子液按体积比为1-10%。

S4. 待S3中的发酵过程进行2-4天后，接入S2中培养好的休哈塔假丝酵母种子液得发酵液，所述发酵液中的种子液按体积比为5-10%，接入后继续发酵2-4天，对发酵液进行蒸馏即可获得乙醇。

进一步地，所述S1中固体平板培养基组分和质量含量为：蛋白胨9-11g/L，酵母浸粉4.5-5.5g/L，氯化钠4.5-5.5g/L，可溶性淀粉9-11g/L，琼脂19-21g/L。

进一步地，所述S1中液体种子培养基组分和质量含量为：蛋白胨9-11g/L，酵母浸粉4.5-5.5g/L，氯化钠4.5-5.5g/L，可溶性淀粉9-11g/L。

进一步地，所述S2中固体平板培养基组分和质量含量为：蛋白胨9-11g/L，酵母浸粉4.5-5.5g/L，氯化钠4.5-5.5g/L，葡萄糖9-11g/L，琼脂19-21g/L。

进一步地，所述S2中种子液体培养基组分和质量含量为：蛋白胨9-11g/L，酵母浸粉4.5-5.5g/L，氯化钠4.5-5.5g/L，葡萄糖9-11g/L。

进一步地，所述S3中生淀粉发酵培养基的组分和质量含量为：生淀粉10-100g/L，硫酸铵1.5-2.5g/L，蛋白胨2-10g/L，磷酸氢二钾1-3g/L，七水硫酸镁0.4-0.6g/L，氯化钙0.5-1.5g/L，七水硫酸亚铁0.008-0.012g/L，培养基的pH值为6.5-7.5。

进一步地，在所述S3的发酵条件中，摇床速度为100-200r/min，发酵温度为28-32℃。

进一步地，在所述S4的发酵条件中，摇床速度为80-120r/min，发酵温度为26-30℃。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供一株能水解生淀粉的叶际类芽孢杆菌并利用其与休哈塔假丝酵母进行共发酵生产乙醇，具有成本低，不受地域、季节等条件限制，适合工业化大规模生产等优点。同时本发明利用生淀粉直接进行酒精发酵，不需要传统的酒精发酵制糖工序中高温蒸煮糊化和糖化冷却工序，极大地降低了能量的消耗，简化了工序，降低了生产成本，符合环保和可持续发展的要求。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段与功效易于理解，结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

一、菌株的分离、筛选与鉴定

从淀粉制品厂周围取土样，然后将样品用无菌水制成菌悬液，梯度稀释后涂布于淀粉为唯一碳源的分离平板中，平板培养基为生淀粉20 g/L，硫酸铵2 g/L，蛋白胨5 g/L，磷酸氢二钾1 g/L，七水硫酸镁0.5 g/L，氯化钙1 g/L，七水硫酸亚铁0.01 g/L，琼脂20 g/L，其中生淀粉为干热灭菌，其它成分配置好后湿热灭菌。经培养后挑选透明圈直径比较大的菌落并进一步划线分离培养获得纯培养物，获得叶际类芽孢杆菌

按照生工EZ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取总DNA。以上述提取的总DNA为模板，采用引物27F/1492R进行PCR扩增。PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，由电泳结果切割所需DNA目的条带，按UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒说明书进行纯化回收。PCR产物由上海生工生物工程有限公司测序。测序结果如下：

GACTACACCTTCGGGTGTGGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCTGTAAGACCGGGATAACATTCGGAAACGAATGCTAATACCGGATATGCGGTTTGCTCGCATGAGCGAATCGGGAAAGACGGTGCAAGCTGTCACTTACAGATGGACCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGCCAGGGAAGAACGAGTGGGAGAGTAACTGCTCCTGCTATGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTTGTAAGTCAGGTGTTTAAGCTCGGGGCTCAACCCCGATTCGCATCTGAAACTGCAAGACTTGAGTGCAGAAGAGGGAAAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATACCCTTGGTGCCGAAGTTAACACATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTTTGAATCCTCTAGAGATAGAGGCGGCCCTTCGGGGACAGAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATTTTAGTTGCCAGCACTTTAAGGTGGGCACTCTAGAATGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTACTACAATGGCCGTTACAACGGGAAGCGAAGGAGCGATCTGGAGCGAATCCTAAAAAGGCGGTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGTCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTACAACACCCGAAGCCGGTGGGGT

将测得菌株的16S rDNA序列与GenBank数据库中序列进行BLAST分析，经BLAST序列比对及系统进化树分析，结果表明：本发明的菌株位于系统发育树与叶际类芽孢杆菌（

本发明提供的

二、利用叶际类芽孢杆菌

实施例1

叶际类芽孢杆菌与休哈塔假丝酵母共发酵生产乙醇，包括以下步骤：

S1. 将叶际类芽孢杆菌

S2. 将休哈塔假丝酵母接种至固体平板培养基上，固体平板培养基的组分和质量含量为蛋白胨9g/L，酵母浸粉4.5g/L，氯化钠4.5g/L，葡萄糖9g/L，琼脂19g/L，将固体平板培养基置于28℃恒温培养箱中培养2天，用接种环从固体平板培养基上挑取单菌落至液体种子培养基中，液体种子培养基的组分和质量含量为蛋白胨9g/L，酵母浸粉4.5g/L，氯化钠4.5g/L，葡萄糖9g/L，于28℃，150rpm下摇床培养22小时作为种子液备用；

S3. 将S1中培养好的叶际类芽孢杆菌种子液按体积比为1%接入生淀粉发酵培养基中发酵，生淀粉发酵培养基的组分和质量含量为：生淀粉10g/L，硫酸铵1.5g/L，蛋白胨2g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水硫酸镁0.4g/L，氯化钙0.5g/L，七水硫酸亚铁0.008g/L。培养基的pH值为6.5。摇床速度为150r/min，发酵温度为28℃，发酵时间为2天。

S4. 将S2中培养好的休哈塔假丝酵母种子液按体积比为5%接入S3中所得的发酵液中，接种后的摇床速度为100r/min，发酵温度为28℃，发酵时间为2天，发酵液中乙醇含量为3.6g/L，将最终得到的发酵液进行蒸馏即可获得乙醇。

实施例2

叶际类芽孢杆菌与休哈塔假丝酵母共发酵生产乙醇，包括以下步骤：

S1. 将

S2. 将休哈塔假丝酵母接种至固体平板培养基上，固体平板培养基的组分和质量含量为：蛋白胨11g/L，酵母浸粉5.5g/L，氯化钠5.5g/L，葡萄糖11g/L，琼脂21g/L，将固体平板培养基置于32℃恒温培养箱中培养4天，用接种环从固体平板培养基上挑取单菌落至液体种子培养基中，液体种子培养基的组分和质量含量为：蛋白胨11g/L，酵母浸粉5.5g/L，氯化钠5.5g/L，葡萄糖11g/L，于32℃，150rpm下摇床培养26小时作为种子液备用；

S3. 将培养好的种子液按体积比为10%接入生淀粉发酵培养基中发酵，生淀粉发酵培养基的组分和质量含量为：生淀粉100g/L，硫酸铵2.5g/L，蛋白胨10g/L，磷酸氢二钾3g/L，七水硫酸镁0.6g/L，氯化钙1.5g/L，七水硫酸亚铁0.012g/L。培养基的pH值为7.5。摇床速度为150r/min，发酵温度为32℃，发酵时间为4天。

S4. 将S2中培养好的休哈塔假丝酵母种子液按体积比为10%接入S3中所得的发酵液中，接种后摇床速度为100r/min，发酵温度为30℃，发酵时间为4天，发酵液中乙醇含量为31.3g/L，将最终得到的发酵液进行蒸馏即可获得乙醇。

实施例3

叶际类芽孢杆菌与休哈塔假丝酵母共发酵生产乙醇，包括以下步骤：

S1. 将

S2. 将休哈塔假丝酵母接种至固体平板培养基上，固体平板培养基的组分和质量含量为：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，将固体平板培养基置于30℃恒温培养箱中培养3天，用接种环从固体平板培养基上挑取单菌落至液体种子培养基中，液体种子培养基组分和质量含量为：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖10 g/L，于30℃，150rpm下摇床培养24小时作为种子液备用；

S3. 将培养好的种子液按体积比为5%接入生淀粉发酵培养基中发酵，生淀粉发酵培养基的组分和质量含量为：生淀粉50g/L，硫酸铵2g/L，蛋白胨10g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，氯化钙1g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L。培养基的pH值为7.0。摇床速度为150r/min，发酵温度为30℃，发酵时间为3天。

S4. 将S2中培养好的休哈塔假丝酵母种子液按体积比为8%接入S3中所得的发酵液中，接种后摇床速度为100r/min，发酵温度为28℃，发酵时间为4天，发酵液中乙醇含量为14.9g/L，将得到的发酵液进行蒸馏即可获得乙醇。

实施例4

S3. 将培养好的种子液按体积比为10%接入生淀粉发酵培养基中发酵，发酵培养基组分和质量含量为：生淀粉100g/L，硫酸铵2 g/L，蛋白胨10 g/L，磷酸氢二钾1 g/L，七水硫酸镁0.5 g/L，氯化钙1 g/L，七水硫酸亚铁0.01 g/L。培养基的pH值为7.0。摇床速度为150r/min，培养温度为30℃，培养时间为3天。

S4. 将S2中培养好的休哈塔假丝酵母种子液按体积比为8%接入S3发酵液中，接种后摇床速度为100r/min，培养温度为28℃，培养时间为3天，发酵液中乙醇含量为32.1g/L，将得到的发酵液进行蒸馏即可获得乙醇。

其余实施如实施例3。

实施例5

S3. 将培养好的种子液按体积比为5 %接入培养基中发酵，发酵培养基组分和质量含量为：生淀粉50 g/L，硫酸铵2 g/L，蛋白胨10 g/L，磷酸氢二钾1 g/L，七水硫酸镁0.5g/L，氯化钙1 g/L，七水硫酸亚铁0.01 g/L。培养基的pH值为7.0。摇床速度为150r/min，培养温度为30℃，培养时间为3天。

S4. 将S2中培养好的休哈塔假丝酵母种子液按体积比为8%接入S3发酵液中，接种后摇床速度为100r/min，培养温度为28℃，培养时间为4天，发酵液中乙醇含量为33.8g/L，将得到的发酵液进行蒸馏即可获得乙醇。

其余实施如实施例3。.

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 淮阴师范学院

<120> 一种双菌发酵生淀粉生产乙醇的方法

<130> 2022

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 1381

<212> DNA

<213> 叶际类芽孢杆菌(Paenibacillus phyllosphaerae HYNU-YU148)

<400> 2

gactacacct tcgggtgtgg ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtagg taacctgcct 60

gtaagaccgg gataacattc ggaaacgaat gctaataccg gatatgcggt ttgctcgcat 120

gagcgaatcg ggaaagacgg tgcaagctgt cacttacaga tggacctgcg gcgcattagc 180

tagttggtgg ggtaacggct caccaaggcg acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc 240

ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt 300

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aggcgacttt ctgggctgta actgacgctg aggcgcgaaa gcgtggggag caaacaggat 720

tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgaatgcta ggtgttaggg gtttcgatac 780

ccttggtgcc gaagttaaca cattaagcat tccgcctggg gagtacgctc gcaagagtga 840

aactcaaagg aattgacggg gacccgcaca agcagtggag tatgtggttt aattcgaagc 900

aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat ccctttgaat cctctagaga tagaggcggc 960

ccttcgggga cagaggagac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt 1020

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agcgatctgg agcgaatcct aaaaaggcgg tctcagttcg gattgcaggc tgcaactcgc 1260

ctgcatgaag tcggaattgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc 1320

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t 1381