一种鲁米诺衍生物及其制备方法与应用

摘要

本发明属于化学合成技术领域，具体涉及一种鲁米诺衍生物及其制备方法与应用。本发明制备得到的鲁米诺衍生物具有发射波长较长(能发出绿色的光)、发光效率高、发光时间长的优点，在血迹检测、蛋白免疫印迹杂交、酶联免疫吸附、过氧化氢生成酶定量分析方面都能较好地应用，其中，在蛋白免疫印迹杂交中，在HRP标二抗稀释至500万倍之后，仍具有较高的信噪比。同时，该衍生物的制备方法简单，条件温和，产率高，适合大规模生产。

说明书

技术领域

本发明属于化学合成技术领域。更具体地，涉及一种鲁米诺衍生物及其制备方法与应用。

背景技术

鲁米诺(Luminol，3-氨基-邻苯二甲酰肼)作为人工合成的化学发光化合物，是生化分析中最常用的化学发光物质之一。以鲁米诺作为核心发光物质制备的各类发光试剂已经被广泛应用于科研以及临床生化分析中。如在法医取证中，常利用鲁米诺的化学发光特性，在复杂的现场环境中对极微量的血液进行鉴别和成像。此外，鲁米诺作为体外诊断用辣根过氧化物酶(HRP)底物，广泛用于酶促化学发光免疫分析(CLELA)。鲁米诺试剂尽管被广泛使用，但是仍然存发光时间短、发光强度弱、且发光波长较短(峰值在425nm左右，蓝光附近，人裸眼以及多数CCD感光(电荷耦合)芯片对该蓝光波段敏感度不高)的缺点。因此制备具有更长发光时间、更高发光强度、更长发光波长的鲁米诺衍生物具有重要意义。

对鲁米诺进行结构衍生化可以在一定程度上达到以上目标，目前针对鲁米诺的衍生化通常发生在其苯环结构上。例如在苯环上氨基的间位引入羧基以及在氨基的邻位引入甲基等给电基团可以显著增强鲁米诺的发光强度(Sulaiman KO,Onawole AT,Shuaib DT,Saleh TA:Quantum chemical approach for chemiluminescence characteristics ofdi-substituted luminol derivatives in polar solvents.J Mol Liq 2019,279:146-153)，但这些衍生化合物并不会显著影响其发光波长。在苯环上延长共轭体系，如采用萘环构建鲁米诺类似物可以实现长波长的发射(Periyasami G,Martelo L,

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有鲁米诺衍生物发光时间、发光强度和发光波长无法满足实际应用要求的缺陷和不足，提供一种不仅具有发光时间长、发光强度高，还具有发光波长长的一种鲁米诺衍生物。

本发明的目的是提供一种鲁米诺衍生物的制备方法。

本发明的另一目的是提供一种发光液。

本发明的另一目的是提供一种鲁米诺衍生物或发光液在血迹检测或作为辣根过氧化物酶发光底物中的应用。

本发明的上述目通过以下技术方案实现：

一种鲁米诺衍生物，结构式如式(Ⅰ)所示：

其中，R

优选地，所述R

优选地，所述R

本发明进一步保护上述鲁米诺衍生物的制备方法，将

当R

将

或当R

将

所述有机溶剂为冰乙酸或甲苯，粗产物的结构式如式(Ⅲ)或式(Ⅳ)所示：

优选地，当

优选地，当

优选地，所述还原剂为氯化铵和铁粉的混合物、水合肼和FeCl

优选地，所述氯化铵和铁粉的混合物中氯化铵和铁粉的摩尔比为1:(4～6)；所述水合肼和FeCl

优选地，所述100～120℃反应的时间为2～6h。

优选地，所述80～90℃反应的时间为0.5～1.5h。

优选地，所述后处理的步骤为：冷却至室温，部分目标产物直接析出，过滤收集，滤液(含少量产物)用2M NaOH调节至中性，通过减压浓缩得粗产物，利用硅胶柱层析提纯。

优选地，所述纯化的步骤为趁热过滤，取滤液减压浓缩后用硅胶柱层析提纯。

更优选地，所述柱层析的洗脱体系为：二氯甲烷：甲醇＝(10～20):1。

本发明进一步保护一种发光液，含有上述鲁米诺衍生物。

本发明进一步保护上述鲁米诺衍生物或发光液在血迹检测或作为辣根过氧化物酶发光底物中的应用。

优选地，所述作为辣根过氧化物酶发光底物中的应用包括蛋白免疫印迹杂交分析、酶联免疫吸附、过氧化氢生成酶的检测。

本发明具有以下有益效果：

本发明制备得到的鲁米诺衍生物具有发射波长较长(能发出绿色的光)、发光效率高、发光时间长的优点，在血迹检测、蛋白免疫印迹杂交、酶联免疫吸附、过氧化氢生成酶定量分析方面都能较好地应用，其中，在蛋白免疫印迹杂交中，在HRP标二抗稀释至500万倍之后，仍具有较高的信噪比。同时，该衍生物的制备方法简单，条件温和，产率高，适合大规模生产。

附图说明

图1为实施例1制备得到的GL-1的核磁氢谱图。

图2为实施例1制备得到的GL-1的核磁碳谱图。

图3为实施例2制备得到的GL-2的核磁氢谱图。

图4为实施例2制备得到的GL-2的核磁碳谱图。

图5为实施例3制备得到的GL-3的核磁氢谱图。

图6为实施例3制备得到的GL-3的核磁碳谱图。

图7为实施例4制备得到的GL-4的核磁氢谱图。

图8为实施例4制备得到的GL-4的核磁碳谱图。

图9为实施例1～4制备得到的鲁米诺衍生物的化学发光性能图，图9a为鲁米诺和鲁米诺衍生物的化学发光光谱图(为方便比较，对发光强度进行了归一化处理)，图9b为鲁米诺和鲁米诺衍生物在HRP催化下，发光强度随时间变化的动力学曲线，图9c为对图9b曲线下的面积进行积分所得定量数值的柱状图，图9d为GL-1在不同pH缓冲液中的发光强度随时间变化的动力学曲线。

图10为不同浓度实施例1制备得到的GL-1在添加增强剂体系中，发光强度随时间变化的动力学曲线。

图11为实施例1制备得到的GL-1与鲁米诺在血迹检测中的结果图，图11a为GL-1或鲁米诺化学发光强度随随时间的变化图，图11b为GL-1或鲁米诺在不同小鼠血液浓度下化学发光强度随随时间的变化图。

图12为利用Image J对血迹成像化学发光强度的定量分析结果图，图12a为利用Image J对血迹成像化学发光强度定量分析的示意图，图12b为不同小鼠血液浓度的化学发光强度的定量数值曲线。

图13为实施例1制备得到的GL-1在酶联免疫吸附测定中的结果图，图13a为基于不同发光底物的Human TNF alpha ELISA检测示意图，图13b为以利用比色底物TMB进行测试的结果图，图13c为利用荧光底物进行测试的结果图，图13d为利用实施例1所得GL-1进行测试的结果图。

图14为蛋白免疫印迹试验的结果图，图14a为第300秒曝光时间下，不同ECL显影液的成像效果图，图14b为对图14a中的结果进行信噪比计算结果的柱状图。

图15为过氧化氢生成酶检测的的结果图，图15a为过氧化氢生成酶的检测示意图，图15b为实施例1制备得到的GL-1检测葡萄糖氧化酶的发光强度随时间变化的动力学曲线积分面积的柱状图，插图为检测葡萄糖氧化酶的线性关系图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1鲁米诺衍生物GL-1的合成

将(246mg，1.5mmol)3-羟基邻苯二甲酸酐溶解在5mL的冰乙酸溶液中，在室温搅拌下，加入(177mg，1.0mmol)鲁米诺，然后加热至110℃，反应约6小时，TLC监测反应，待反应完全后，将反应液冷却至室温(此时会析出大量的目标产物，将其过滤收集)，滤液用2M NaOH调节至中性，通过减压除去反应溶剂得到粗产物，将粗产物通过硅胶快速柱层析(二氯甲烷:甲醇＝10:1)提纯即可得到相应的淡黄色固体产物(GL-1)，产率约为80％。

HRMS(ESI)m/z:[M+H]

实施例2鲁米诺衍生物GL-2的合成

将(246mg，1.5mmol)3-羟基邻苯二甲酸酐溶解在5mL的冰乙酸(AcOH)溶液中，在室温搅拌下，加入(177mg，1.0mmol)异鲁米诺，然后加热至110℃，反应约6小时，TLC监测反应，待反应完全后，将反应液冷却至室温(此时会析出大量的目标产物，将其过滤收集)，滤液用2M NaOH调节至中性，通过减压除去反应溶剂得到粗产物，将粗产物通过硅胶快速柱层析(二氯甲烷:甲醇＝10:1)提纯即可得到相应的淡黄色固体产物(GL-2)，产率约为80％。

HRMS(ESI)m/z:[M+H]

实施例3鲁米诺衍生物GL-3的合成

将3-硝基邻苯二甲酸酐(193.113mg，1.0mmol)溶解在5mL冰乙酸溶液中，在室温搅拌下，加入异鲁米诺(265.7mg，1.5mmol)，然后通过加热套加热至110℃，反应约4小时，反应完全后，将反应液冷却至室温，用2M NaOH调节反应液pH至中性，减压除去溶剂得到粗产物，粗产物通过硅胶快速柱层析(二氯甲烷:甲醇＝20:1)提纯，即可得到相应的白色固体产物(5a)，产率约为70％。

HRMS(ESI)m/z:[M+H]

将(352mg，1.0mmol)化合物5a加入到5mL 80％乙醇溶液中，在室温搅拌下，加入(53mg，1.0mmol)NH

HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C16H10N4O4H

实施例4鲁米诺衍生物GL-4的合成

将3-硝基邻苯二甲酸酐(193.113mg，1.0mmol)溶解在5mL冰乙酸溶液中，在室温搅拌下，加入异鲁米诺(265.7mg，1.5mmol)，然后通过加热套加热至110℃，反应约4小时，反应完全后，将反应液冷却至室温，用2M NaOH调节反应液pH至中性，减压除去溶剂得到粗产物，粗产物通过硅胶快速柱层析(二氯甲烷:甲醇＝20:1)提纯，即可得到相应的白色固体产物(5b)，产率约为70％。

HRMS(ESI)m/z:[M+H]

将(352mg，1.0mmol)化合物5b加入到5mL 80％乙醇溶液中，在室温搅拌下，加入(53mg，1.0mmol)NH

HRMS(ESI)m/z:[M+H]+Calcd for C16H10N4O4H

结构表征：

核磁表征：将实施例1～4制备得到的鲁米诺衍生物进行核磁氢谱与碳谱检测，结果如图1～8所示，数据一一对应，证明结构正确。

对比例1鲁米诺衍生物GL-1的合成

将(246mg，1.5mmol)3-羟基邻苯二甲酸酐溶解在5mL的氯苯溶液中，在室温搅拌下，加入(177mg，1.0mmol)鲁米诺，然后加热至110℃，反应约6小时，TLC监测反应，待反应完全后，将反应液冷却至室温(此时会析出大量的目标产物)，反应液用2M NaOH调节至中性，通过减压除去反应溶剂得到粗产物，将粗产物通过硅胶快速柱层析(二氯甲烷:甲醇＝10:1)提纯即可得到相应的淡黄色固体产物GL-1，产率约为10％。

与实施例1的区别在于：将实施例1的冰乙酸溶液替换成氯苯溶液，其余步骤的条件、试剂均与实施例1一致。

对比例2鲁米诺衍生物GL-1的合成

将(246mg，1.5mmol)3-羟基邻苯二甲酸酐溶解在5mL的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在室温搅拌下，加入(177mg，1.0mmol)鲁米诺，然后加热至110℃，反应约6小时，TLC监测反应，待反应完全后，将反应液冷却至室温(此时会析出大量的目标产物)，反应液用2M NaOH调节至中性，通过减压除去反应溶剂得到粗产物，将粗产物通过硅胶快速柱层析(二氯甲烷:甲醇＝10:1)提纯即可得到相应的淡黄色固体产物GL-1，产率约为4％。

与实施例1的区别在于：将实施例1的冰乙酸溶液替换成N,N-二甲基甲酰胺溶液，其余步骤的条件、试剂均与实施例1一致。

实验例1鲁米诺衍生物的发光性能测试

当鲁米诺及其衍生物用于HRP/H

室温条件下，先将50μL发光底物溶液(鲁米诺或GL-1/2/3/4溶液)与50μLHRP溶液在96孔板中混匀，然后再加入增强剂MORP与SPTZ各25μL，最后加入50μL H

由图9可知，GL-1的光谱峰值出现在515nm附近，与经典绿色荧光分子荧光素(fluorescein，CAS No.2321-07-5)光谱位置接近(图9a)，而鲁米诺发光光谱的峰值在425nm左右。证明实施例1～4制备的GL-1/2/3/4四个衍生物的发光波长相较鲁米诺具有明显的红移，表现出明显的绿色发光特征。

发光动力学曲线的采集选用HRP作为催化剂，使用10mM Tris-HCl pH8.5缓冲液配置溶液，反应体系各物质的终浓度分别为：200μM发光底物溶液，10ng/mL HRP和5mM H

由图9b可知，在HRP/H

为探究pH对发光的影响，采用不同pH的10mM Tris-HCl配置GL-1溶液进行测试，结果如图9d。

由图9d可知，在所测试的弱碱性条件下(pH 7.5～pH 9.0)，GL-1均可以较好的响应HRP/H

本发明中GL-1表现出较高的发光效率，其绿色发光可能不是由鲁米诺的化学发光通过化学发光共振能量转移(CRET)传递到3-羟基邻苯二甲酰亚胺荧光骨架而形成，推测是3-羟基邻苯二甲酰亚胺与鲁米诺骨架形成了一个新发光分子，化学键断裂形成新的不同于鲁米诺的激发态中间体，进而产生绿色化学发光。然而HRP底物的发光效率不仅与其自身的化学反应性、荧光量子产率等相关，也与底物和酶之间的识别与结合情况有关。

同时，采用同样的方法测试了在增强剂存在时的发光动力学曲线，MORP和SPTZ的终浓度分别设置为在1.8mM和300μM。

如图10可知，在加入300μM SPTZ与1.8mM MORP的增强剂体系中，增强剂确实可以明显加强鲁米诺及其衍生物的发光强度和发光时间。在相同浓度下(300μM)GL-1比鲁米诺具有明显的优势。在所测试的各个浓度下(100μM～300μM)，GL-1均表现出比300μM鲁米诺更高的发光效率。实验结果表明：GL-1在有无增强剂的HRP/H

实验例2鲁米诺衍生物在血迹成像中的测试

血液中含有的血红蛋白等具有铁-卟啉(Fe-PPIX)催化中心，可以催化鲁米诺/H

将GL-1或鲁米诺溶液(1mM)和1M H

如图11所示，随着血液的加入，GL-1/H

对小鼠血液经过不同倍数稀释(10、100、200、500、1000)后，将模型鞋的鞋底与稀释后的血液接触进行血渍沾染，然后将鞋印按压在打印纸上，血迹在空气中自然风干后备用。采用0.04M BR缓冲液(pH 9.0)配置1mM GL-1或鲁米诺溶液，用双蒸水配置1M H

为了模拟法医取证中血迹成像过程，我们将经过不同倍数稀释的小鼠血迹喷在鞋底然后印在打印纸上。结果表明，利用GL-1发光液所得照片在各个血液稀释情况下均比鲁米诺发光液的更明亮(图11b)。

利用ImageJ软件对发光亮度进行定量分析(示意图如图12a所示)，如图12b所示，在血迹成像上GL-1确实比鲁米诺具有优势。

实验例3鲁米诺衍生物在酶联免疫吸附中的测试

选用商品化Human TNF alpha ELISA Kit，Fluorescent(ab229399)，分别利用试剂盒自带的荧光底物，商品化比色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，以及本发明的化学发光底物GL-1进行ELISA测试。

首先，将50μL TNF-α(人肿瘤坏死因子α)标准品(60pg/ml)添加到ELISA试剂盒自带的酶标板中，在空白孔中加入50μL标准品稀释液作为对照；然后再加入50μL鸡尾酒式抗体组合(含捕获抗体和HRP标记的检测抗体))，在空白组中加入抗体稀释液50μL，覆膜密封酶标板，在室温下300rpm的摇床中孵育1小时；最后，甩干孔内液体，向每个孔中加入350μL洗涤缓冲液洗涤3次，洗涤完成后，甩干洗涤液，待测。

利用比色底物TMB进行测试(比色法)：每孔加入底物90μL TMB溶液显色液(来自商品化鼠TNF-a ELISA试剂盒(CSB-E04741m)，Cusabio Technology(华美生物，武汉)，避光孵育20min后，再加入50μL终止液，利用酶标仪记录450nm处的OD值(吸收波长)。

利用荧光底物进行测试(荧光分析法)：每孔加入100μL显色溶液(试剂盒自带)；避光孵育10分钟后，记录530nm激发下570nm的荧光值。

利用化学发光底物进行测试(GL-1化学发光检测)：A液(600μM GL-1、3.6mM MORP和600μM SPTZ)；B液(4mM H

所有商品化底物的操作均严格按照试剂盒说明进行。

由图13b～d所示，三种显色方法均能对60pg/mL TNF-α有较好的响应。但是，GL-1化学发光检测的强度相比比色法和荧光分析法的吸光度和荧光具有更大的变化区间(图13d)，表明GL-1对ELISA分析具有较高的灵敏度。

实验例4鲁米诺衍生物在蛋白免疫印迹(WB)中的测试

用RIPA裂解缓冲液(以下简称细胞裂解液)裂解HepG2细胞。将细胞裂解液离心收集上层清液，使用BCA蛋白检测试剂盒(Beyotime,Shanghai,China,货号P0012S)测定细胞裂解液蛋白浓度。每道等量的蛋白质(30μg)装载在10％SDS-PAGE凝胶上进行电泳，然后将该蛋白转至PVDF膜上(Millipore Co.，Ltd,USA,货号ISEQQ00010)；使用5％的脱脂牛奶在室温下进行封闭1h；封闭完成后加入1：5000稀释的一抗GAPDH MC4小鼠单克隆抗体(mAb)在4℃下孵育过夜；然后再加入1：500万的二抗(山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP)在室温条件下孵育1h，在成像溶剂中，采用美国Bio-Rad公司的Gel Doc XR+成像系统进行成像。

成像溶液分别为：商品化ECL-1(弗德生物科技有限公司，杭州，货号FD8020)、ECL-2(碧云天生物技术有限公司，上海，货号P0018FS)、ECL-3(密理博，USA，货号WBKLS0500)、ECL-4(赛默飞世尔科技，USA，货号WE322469)成像溶液和用本发明鲁米诺衍生物GL-1配置得到的发光液ECL@GL-1(包括A液：1mM鲁米诺衍生物分子GL-1、10mM MORP和6mM SPTZ；B液：20mM H

由图14可知，本发明制备的发光液表现出与商品化相当甚至更好的成像能力(图14a)。由图14b所示，对多的成像图片进行信噪比分析(S/N)，在相同条件下本发明发光液的S/N＝6.66，显著高于其他几种发光液。根据实验例1图10的结果我们也可以推至，如果需要降低发光液灵敏度，可以对A液进行稀释。因此利用GL-1我们可以依据需要制备系列发光液，适用于不同灵敏度要求的WB成像。

实验例5鲁米诺衍生物在过氧化氢生成酶检测中的测试

对过氧化氢生成酶检测的原理在于通过HRP/显色底物对双氧水进行定量，通过反应测试体系中过氧化氢生成能力进而定量相关酶的活性。葡萄糖氧化酶(GOx)便是其中之一。该酶可以催化葡萄糖的氧化产生双氧水，对双氧水定量就可以测定葡萄糖氧化酶活性。我们选择葡萄糖氧化酶作为过氧化氢生成体系的例子，对GL-1/HRP体系的检测性能进行了测试。

利用10mM Tris-HCl(pH 6.0)分别配置不同浓度的葡萄糖氧化酶溶液、1mM无水葡萄糖溶液、10ng/ml HRP溶液；用10mM Tris-HCl(pH 12)配置含有1.8mM 4-吗啉吡啶、300μMSPTZ-343、300μM GL-1的发光液。测试时，先将GOx与葡萄糖(Glu)在40℃下孵育30min，依次加入发光液和HRP(体系的最终pH约为9.0)，立即采用多功能酶标仪记录化学发光(检测示意图如图15a所示)。

如图15b所示：利用实例5所示发光液ECL@GL-1及HRP，可以实现葡萄糖氧化酶的定量分析，该发光液同样适用于其他过氧化氢生成酶的定量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。