本氏烟ALKBH9B基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法

摘要

本发明公开了一种本氏烟ALKBH9B基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法，所述病毒为马铃薯Y病毒属病毒芜菁花叶病毒，ALKBH9B基因的转录本序列如SEQ IDNO:1所示。本发明通过烟草叶盘农杆菌转化的方法，将携带目的基因靶点的基因敲除载体导入目的植物中，获得了本氏烟ALKBH9B基因突变的纯合植物，该植物能够显著减轻芜菁花叶病毒的侵染。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及本氏烟ALKBH9B基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法。

背景技术

芜菁花叶病毒(TuMV)能够侵染至少43科318种双子叶植物，是农业生产上最重要的植物病毒之一。TuMV广泛分布于北美洲、欧洲、南非、亚洲、澳大利亚等世界各地。在自然条件下，TuMV主要侵染油菜、甘蓝、白菜、青花菜等十字花科作物和蔬菜。TuMV感染后的植物会出现严重的症状，包括黄萎、花叶、斑驳、矮化等。在我国，绝大部分地区的十字花科蔬菜和油菜均有TuMV为害发生，严重时可造成50％～100％的减产。TuMV不仅寄主范围广泛、还能通过多种途径进行传播，如它能由蚜虫以非持久方式传播，也可以通过摩擦接种或汁液接触传染。目前，该病毒是我国十字花科蔬菜和油菜病毒病害的主要病原，在我国绝大部分地区均有发生。

植物病毒是专性的寄生物，其生活循环依赖于寄主的物质和能量。目前在田间生产上，化学药剂对病毒病的防治效果不佳。因此，阻断植物中病毒所需关键因子是植物病毒防治的有效手段。目前在我国农业生产中，芜菁花叶病毒抗性种质资源极度匮乏。在抗病毒作物育种上，采用常规方法难以实现优质与抗病的结合，并且杂交育种等方法不能从根本上解决现有的病害问题。自然界中存在携带隐性抗病基因的植物，这些植物由于突变了病毒繁殖所需要的重要寄主因子，从而得以保留并表现出有效的抗病性。这些隐形突变植物自身形状没有明显差异，因此广泛用于抗病毒植物育种。翻译延长因子家族基因eIF4Es就是隐性抗病基因应用于育种中的典型案例。这些携带隐性抗病基因的植物是优良的抗病资源，但在自然界中挖掘抗病毒基因的工作非常漫长。因此，通过实验室研究挖掘出对病毒侵染重要的隐性抗病基因非常重要，这能够加快抗芜菁花叶病毒的分子育种工程。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种本氏烟ALKBH9B基因在调控植物抗病毒中的应用。

本发明的第二目的是提供一种本氏烟ALKBH9B基因敲除的转基因植物的培育方法。

本发明利用植物免疫反应中的抗病反应原理，发现了本氏烟中ALKBH9B基因是一个感病基因。通过农杆菌转化的方法，将携带ALKBH9B靶点的CRISPR载体导入目的植物中，获得的本氏烟ALKBH9B基因敲除植物能够显著减轻TuMV的侵染，有效控制该病毒的危害。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：

本氏烟ALKBH9B基因在调控植物抗病毒中的应用，其中，所述病毒为芜菁花叶病毒，所述ALKBH9B基因的转录本序列如SEQ ID NO:1所示，将本氏烟ALKBH9B基因突变抵御芜菁花叶病毒的侵染。

具体为：通过构建本氏烟ALKBH9B基因敲除载体，以无菌培养的本氏烟叶片做愈伤组织，使用农杆菌介导的T-DNA方式进行遗传转化，将敲除载体导入目的植物中，获得的本氏烟ALKBH9B基因突变的纯合植物能够显著减轻芜菁花叶病毒的侵染。

一种抗芜菁花叶病毒的ALKBH9B转基因植物的培育方法：通过叶盘法，将携带ALKBH9B基因靶点的基因敲除载体导入目的植物中，获得本氏烟ALKBH9B基因突变的纯合植物。

具体包括以下步骤：

(1)对ALKBH9B两个拷贝基因公共保守区域进行CRISPR靶点筛选，得到gRNA靶点序列，如SEQ ID NO:2所示；设计引物进行PCR扩增，克隆得到ALKBH9B-gRNA片段；其中，引物为ALKBH9B-gRNA-F和ALKBH9B-gRNA-R，序列分别如SEQ ID NO:3-4所示；

(2)将ALKBH9B-gRNA构建到带有CRISPR-Cas9载体上，获得重组质粒；

(3)将1μl重组质粒与100μl农杆菌感受态混合转入电击杯中，使用电击装置2500V电击转化，恢复后涂布到抗性培养基上筛选获得带有CRISPR-Cas9重组质粒的农杆菌；

(4)将带有重组质粒的农杆菌侵染烟草叶片，经分化培养获得愈伤组织，再经生根培养获得小苗，转移继续培养；

(5)继续培养的小苗生长稳定后，取叶片样品，使用CTAB法抽提DNA；利用引物对M13-F与BKG-gRNA-R，以提取DNA为模板进行PCR扩增，确定植物中转入了外源CRISPR-Cas9序列；引物M13-F和BKG-gRNA-R的序列分别如SEQ ID NO:5-6所示；

(6)在阳性转基因材料上，使用引物BKG-9B-F1与BKG-9B-R或者BKG-9B-F2与BKG-9B-R，分别克隆本氏烟ALKBH9B的两个拷贝基因靶点序列，通过测序，筛选两个拷贝基因均被编辑的株系，留种；BKG-9B-F1、BKG-9B-F2和BKG-9B-R的序列分别如SEQ ID NO:7-9所示；

(7)在得到的T1代种子中筛选纯合编辑株系，并在纯合株系中选择剔除CRISPR-Cas9骨架的植物进行收种，获得转基因剔除的ALKBH9B基因敲除本氏烟。

同现有技术相比，本发明的突出效果在于：

本发明发现了烟草中TuMV感病基因ALKBH9B，并且通过农杆菌转化的方法，将携带ALKBH9B靶点的CRISPR载体导入目的植物中，转基因剔除的ALKBH9B基因敲除本氏烟，获得的ALKBH9B基因敲除植物能够显著减抑制芜菁花叶病毒造成的病害。

下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的本氏烟ALKBH9B基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法作进一步说明。

附图说明

图1为ALKBH9B基因敲除载体构建示意图；

图2为ALKBH9B基因敲除本氏烟的突变形式(A)及突变体表型(B)；

图3为ALKBH9B基因敲除增强本氏烟对TuMV抗病性。(A)TuMV-GFP浸润接种本氏烟野生型及ALKBH9B基因敲除植物，在第六天紫外灯照射下观察到系统叶病毒积累；(B)对不同植物的同一发病部位取样进行qRT-PCR检测。

具体实施方式

一种抗芜菁花叶病毒的ALKBH9B转基因植物的培育方法：通过叶盘法，将携带ALKBH9B基因靶点的基因敲除载体导入目的植物中，获得本氏烟ALKBH9B基因突变的纯合植物。

具体包括以下步骤：

(1)根据本氏烟基因数据库序列比对，发现ALKBH9B基因存在两个拷贝；

(2)对ALKBH9B两个拷贝基因公共保守区域进行CRISPR靶点筛选，得到gRNA靶点序列：accaaactgcattgtgaca，如SEQ ID NO:2所示；设计引物进行PCR扩增，克隆得到ALKBH9B-gRNA片段；其中，引物为ALKBH9B-gRNA-F和ALKBH9B-gRNA-R，序列分别如SEQ ID NO:3-4所示；

ALKBH9B-gRNA-F：gtcgaagtagtgattgaccaaactgcattgtgacagttttagagctaga；

ALKBH9B-gRNA-R：ttctagctctaaaactgtcacaatgcagtttggtcaatcactacttcgac；

(3)如图1所示，将ALKBH9B-gRNA构建到带有CRISPR-Cas9载体上，获得重组质粒；

(4)将1μl重组质粒与100μl农杆菌感受态混合转入电击杯中，使用电击装置2500V电击转化，恢复后涂布到抗性培养基上筛选获得带有CRISPR-Cas9重组质粒的农杆菌；

(5)将次氯酸钠表面消毒后的野生型本氏烟种子在MS培养基中萌发，待长至四片叶后移栽到空间较大的组培盒中，在组培室无菌环境培养4～6周；

(6)在操作台中切取前期培养的无菌本氏烟叶片，获得面积约为0.5cm

(7)对步骤(4)中构建好的农杆菌进行活化并扩大培养。在操作台中将步骤(6)中培养的已经出现膨胀状态的叶片撒入活化好的农杆菌液体中，轻柔晃动，持续5min，随后，使用无菌水清洗叶片3次；

(8)将叶片转移到共培养培养基(MS，100mM AS)，黑暗处理两天；

(9)将叶片再次转移至带有相应筛选抗性的筛选培养基(MS，1×6BA，1×NAA，Hyg)，每两到三周更换一次培养基，等待分化；

(10)分化后进行切芽，转移至MS培养基中生根培养；

(11)继续培养的小苗生长稳定后，取叶片样品，使用CTAB法抽提DNA；利用引物对M13-F与BKG-gRNA-R，以提取DNA为模板进行PCR扩增，确定植物中转入了外源CRISPR-Cas9序列；引物M13-F和BKG-gRNA-R的序列分别如SEQ ID NO:5-6所示；

M13-F：gtaaaacgacggccagt；

BKG-gRNA-R：ggccatttgtctgcagaattgg；

(12)在阳性转基因材料上，使用引物BKG-9B-F1与BKG-9B-R或者BKG-9B-F2与BKG-9B-R，分别克隆本氏烟ALKBH9B的两个拷贝基因靶点序列，通过测序，筛选两个拷贝基因均被编辑的株系，留种；BKG-9B-F1、BKG-9B-F2和BKG-9B-R的序列分别如SEQ ID NO:7-9所示；

BKG-9B-F1：tgcataggttacaggttcgtatcatg

BKG-9B-F2：gtcaaaatattaataaatgaatgtccg

BKG-9B-R：ttcttgaataaaggaggcaatggatc

(13)在获得的阳性编辑材料中，筛选到两个纯合突变的本氏烟材料。如图2A所示，第一个材料在靶点序列中引入了T碱基的插入纯合突变，命名为：Nb9B-KO1。第二个材料在靶点序列中引入了G碱基的插入纯合突变，命名为：Nb9B-KO2。两个株系均是由碱基插入形式导致提前终止造成的基因突变。(14)在纯合株系中选择剔除CRISPR-Cas9骨架的植物进行收种，获得转基因剔除的ALKBH9B基因敲除本氏烟，通过图2B可以看出，Nb9B的突变对本氏烟正常生长没有影响。

(15)将获得的两个ALKBH9B基因纯合突变体进行TuMV-GFP病毒接种。两个突变体植物相对于野生型有较强的抗病毒表型，如图3所示。

TuMV-GFP浸润接种本氏烟野生型及ALKBH9B基因敲除植物，在第六天紫外灯照射下观察到系统叶病毒积累，如图3A所示；并对不同植物的同一发病部位取样进行qRT-PCR检测，结果如图3B所示，显示TuMV-GFP病毒积累量在两个ALKBH9B基因敲除株系中显著低于野生型。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 本氏烟ALKBH9B基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法

<130> DS221-013

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctatgt taaggaatct gtcacgtgaa gagattcttg atgttttgtc tgaaggttta 60

tgtccccact gcgaagatgt tattgaggct cgtgtttaca atcttcatca gagaaggtta 120

gatgaaatgt ctttatcaga tgttaatgtc acaaaaagtt ctgcagaatt cttgcacgga 180

gaatcatcag atgatgtaat ttcaccaaag agaaggctga attcttatgc tcatacactc 240

aactctttgc gttctccaca agttgtcgaa tcaacttact caggaaggcc gaaggtactt 300

gttacacctt catcgataaa caacaaacga tcagtgttca atcattcaaa ttatgagatt 360

cctccaagtg atggacttag taggtcagtc gtaggcaatg gtttatcgga ggatcagaaa 420

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gatgagcaga gagagatagt cgaatttgtt tatgcactcc agagaatggg acaaaaacgg 600

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attattagag atgaagaagt ggatccattg cctcctttat tcaagaaaat gattaggagg 780

atggttagat ggcatgtttt gcctcctaca tgtgttccca atagttgcat tgtgaatatt 840

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aatcctggag agttctctgg tcctttctcc ttacctcttc ctctcgggtc ggtgctcatt 1020

ctcaacggta atggagctga tgttgctaaa cattgtgtgc ctagcgttcc agctaaaaga 1080

atatccatca ctttccgtaa gatggatgac agaaaattgc cgtttgcata tactcctgac 1140

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cgtagaagtc agagatga 1338

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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accaaactgc attgtgaca 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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